Interrogando os centros germinativos auto-reativas individuais por Photoactivation em um modelo misto de quimérico de auto-imunidade

Resumo

Este protocolo descreve a geração de quimeras misto murino da medula óssea com espontâneas centros germinativos auto-imune, na qual auto-reativas linfócitos transportar um repórter de proteína verde fluorescente (GFP-PA) photoactivatable. Isto fornece a capacidade de ligar a localização celular em tecidos com análises moleculares e funcionais a jusante.

Resumo

Doenças auto-imunes apresentam um peso significativo para a saúde. Questões fundamentais sobre o desenvolvimento e a progressão da doença auto-imune permanecem sem resposta. Um requisito para os avanços em nossa compreensão dos mecanismos subjacentes da doença e dinâmica celular é o acoplamento preciso da localização microanatomical de subconjuntos de célula com a jusante análises moleculares ou funcionais; uma meta que tem sido tradicionalmente difícil de alcançar. O desenvolvimento de photoactivatable estável fluorophores biológica e a sua integração em cepas de repórter permitiu recentemente rotulagem microanatomical precisos e rastreamento de celulares subconjuntos em modelos murino. Aqui, descrevemos como a capacidade de analisar auto-reativas linfócitos de centros germinativos único pode ajudar a fornecer novos insights sobre auto-imunidade, usando a combinação de um novo modelo quimérico de auto-imunidade com um repórter de photoactivatable como um exemplo . Vamos demonstrar que um procedimento para gerar misturado quimeras com espontânea auto-reativas centros germinativos povoados por linfócitos carregando um repórter de proteína verde fluorescente photoactivatable. Usando estratégias de rotulagem in vivo, único centros germinativos podem ser visualizados em tecidos linfoides explantados e seus constituintes celulares fotoativados por microscopia de dois fotões. Fotoativados linfócitos de centros germinativos único podem ser analisados ou classificados cytometrically de fluxo, como células únicas ou a granel e podem ser submetidos a análises adicionais de moleculares e funcionais a jusante. Esta abordagem pode diretamente ser aplicada para fornecer insights renovadas no campo de auto-imunidade, mas o procedimento para a geração de quimeras de medula óssea e o procedimento de fotoativação adicionalmente encontrar ampla aplicação nos estudos de doenças infecciosas e metástases de tumor.

Introdução

A incidência de doença auto-imune tem aumentado rapidamente nas últimas décadas, particularmente nas sociedades ocidentais. Hoje, fileiras de doença auto-imune em terceiro lugar na lista das causas mais prevalentes de morbidade e mortalidade no mundo ocidental¹. Questões fundamentais sobre o desenvolvimento e a progressão da doença auto-imune permanecem sem resposta. Um requisito para os avanços em nossa compreensão dos mecanismos subjacentes da doença e dinâmica celular é o acoplamento preciso da localização microanatomical de subconjuntos de célula com a jusante análises moleculares ou funcionais. Na última década, o desenvolvimento de um número de estável fluorophores biológica photoconvertible, photoactivatable ou photoswitchable e a sua integração em cepas de repórter permitiu a rotulagem microanatomical precisos e rastreamento de celular subconjuntos em modelos murino.

Kaede, uma proteína fluorescente photoconvertible proveniente de um coral de stony, sofre photoconversion irreversível de fluorescência verde para fluorescência vermelha após a exposição à luz ultravioleta ou violeta². Inicialmente contratado para seguir o comportamento dinâmico das células individuais no desenvolvimento de fatias de cérebro de organotypic³, geração de um Kaede bater-no rato posteriormente permitiu monitorar a movimentação celular in vivo e o sistema foi aplicada a análises de migração de células imunes para e de linfonodos⁴. Esta abordagem foi posteriormente refinada com um repórter da segunda geração⁵. Um repórter semelhante é Dendra⁶, que recentemente foi usado para rastrear metástases linfonodal em vivo⁷.

A primeira proteína de photoactivatable desenvolvida foi uma proteína verde fluorescente (GFP) projetada com uma única mutação pontual (T203H), levando a uma absorção muito baixa na região de comprimento de onda de 450 a 550 nm⁸. Após a fotoativação por luz violeta, esta proteína fluorescente verde photoactivatable (PA-GFP) liga seu máximo de absorção de 400 ~-~ 500 nm, rendendo uma intensidade aproximada de 100 vezes aumenta quando animado com um comprimento de onda de 488 nm. A geração de ratos transgênicos, em que todas as células hematopoiéticas expressam PA-GFP permitiu, pela primeira vez, análises aprofundadas de seleção de células B em zonas claras e escuras anatomicamente definidas do centro germinativo⁹.

Considerando que o photoactivation é uma conversão irreversível de um estado não-fluorescente para um estado fluorescente e photoconversion é uma transição unidirecional de um comprimento de onda para outra, photoswitchable proteínas são capazes de vaivém entre as duas condições¹⁰ . Este último capacidade recentemente foi aproveitada para engenheiro de controle óptico de proteína atividade¹¹.

Estamos utilizando o repórter PA-GFP, recentemente caracterizado os repertórios de células B de centros germinativos único em um novo modelo de auto-imunidade espontânea do lúpus, como¹². Este modelo é baseado em quimeras misturadas com 1 parte de medula abrigando um auto-reativas células B receptor bater em com especificidade para complexos de ribonuclear-proteína (564Igi,^13,14) combinado com 2 partes da medula de qualquer desejado dador. Em aproximadamente 6 semanas pós reconstituição condições homeostáticas são alcançadas na qual auto-reativas espontânea centros germinativos estão presentes no baço e os linfonodos cutâneos. Notavelmente, centro germinativo, a população de células B é quase exclusivamente (~ 95%) composto de células derivadas do compartimento do non-564Igi, e estas células B selvagem-tipo-derivado tornaram auto-reativas. Portanto, o modelo permite uma abordagem de 'plug-and-play' para análises de pilhas de B do centro germinativo auto-reativas usando vários transgenes, nocautes e repórteres. Aqui, descrevemos o procedimento para a geração de quimeras misturadas com centros germinativos auto-reativas espontânea, povoados por linfócitos carregando o repórter PA-GFP. Usando estratégias de rotulagem in vivo, centros germinativos único podem ser visualizados em tecidos linfoides explantados e seus constituintes celulares fotoativados usando um microscópio de dois fotões. Fotoativados linfócitos de centros germinativos único podem ser posteriormente analisados por citometria de fluxo ou classificados pelo fluorocromo-ativado da pilha (FACS) de classificação e submetidos a análises adicionais de moleculares e funcionais a jusante. A capacidade de analisar auto-reativas linfócitos de centros germinativos único diretamente pode ser aplicada para fornecer insights renovadas no campo de auto-imunidade, mas as técnicas e abordagens descritas além disso podem encontrar aplicações relevantes em estudos de doenças infecciosas e metástases de tumor.

Protocolo

Uso de todos os animais em conformidade com as directrizes da Comunidade Europeia e foi aprovado pela Inspetoria dinamarquês para a pesquisa Animal (2017-15-0201-01348).

1. criação de mouse geral e preparação de buffers e ferramentas

1. Linhas de camundongo sob condições de patógeno específico (SPF) gratuito, com monitorização periódica do estado de saúde de acordo com as diretrizes padrão.
2. Opcional: verificar a ausência de centros germinativos espontâneas em ratos ingênuos devido às infecções acidentais não-monitorado. Isto pode ser feito por microscopia de imunofluorescência (presença de estruturas centro germinativo) ou fluxo cytometry (frequência de células centro germinativo B) como descrito anteriormente,¹².
   Nota: Qualquer fêmeas ou machos podem ser usados. Geralmente, é ideal para sexo jogo doadores e receptores, como incompatibilidade de sexo teoricamente pode levar a alloreactivity para o antígeno-Y masculino por destinatários/doadoras¹⁵.
3. Use CD45.1 destinatários (B6. SJL -Ptprc^um Pepc^b/BoyJ) em cerca de 6-10 semanas de idade. Use 564Igi (B6. Cg-Igh^{tm1 Tik (Igh564)}Igk^{tm1 Tik (Igk564)}/J) e PA-GFP (B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) doadores em 6-12 semanas de idade.
4. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos (tesoura reta fina e pinças de Dumont #5 e #7) em autoclave-los de acordo com as orientações de rotina da esterilização.
5. Prepare 500 mL de solução tampão de medula óssea (BM) com tampão fosfato salino (PBS), 2% de soro Fetal bovino (FBS), ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em pH 7,4. Para preparar o tampão de BM, adicionar 10 mL de calor-inativada (1 hora em banho de água de 56 ° C para inativar o complemento) FBS e 1,25 mL de uma solução de EDTA 400mm (ajustada ao pH 7,4) a 500 mL de PBS, pH 7,4 e misture bem. Filtre o buffer usando um frasco de filtro de 0,2 µm.
6. Prepare-se 10 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) (155 mM NH₄Cl, 12mm NaHCO₃, EDTA 0,1 mM) diluindo-se 1 mL de um estoque de 10 x 10 ml de volume total de água de grau reagente. Prepare 50 mL de PBS com 5 mM EDTA, pH 7,4.

2. estabelecimento de quimeras misto de medula óssea

1. Irradiação de destinatários (dia 0)
   1. Coloque os destinatários de medula óssea CD45.1 em um recipiente apropriado irradiação e irradiar com 1.100 Rad em um irradiador gama.
      Nota: Fontes de irradiação alternativo podem ser usadas. Independentemente da fonte, a dose/hora tem de ser otimizado para produzir o efeito máximo mieloablativo com dano tecidual colateral mínimo aos animais.
   2. Coloque na água antibiótica ad libitum (1 mg de sulfadiazin e 0,2 mg de trimetoprim/mL de água potável).
2. Extração dos ossos (1 dia)
   1. Anestesiar os doadores de medula óssea 564Igi pelo fluxo contínuo de 4% de isoflurano no ar e a eutanásia por deslocamento cervical. Os doadores com etanol uma mangueirada e colocá-los em almofadas cirúrgicas estéril do capuz do fluxo. Proceda-se ao trabalho de manutenção de condições estéreis, usando equipamentos e buffers de estéril.
   2. Para extrair o fêmur e tíbia, primeiro fazer uma incisão ao redor do tornozelo e estender para cima até o quadril com uma tesoura reta fina. Usando um fórceps pesado ou o polegar e o dedo indicador, puxamos a pele para cima e a perna em direção ao corpo. Da mesma forma, puxe a pele para baixo e fora o pé.
   3. Saem as articulações do joelho e tornozelo, agarrando a perna no quadril e puxando o pé com força. Prossiga para quebrar o tornozelo conjunta e puxar o pé para o corpo, mantendo-se para o tibia, descascamento, assim, os tendões e músculos da tíbia.
   4. Quebrar o joelho comum para liberar o tibia e da mesma forma puxar isto para o corpo, mantendo-se para o fêmur, descascamento, assim, tendões e músculos fora do fêmur. Fazer uma incisão na articulação do quadril e cortou os tendões e, em seguida, puxe o fêmur da tomada de quadril. Repita os passos 2.2.2 – 2.2.4 para o lado contralateral.
   5. Limpe cuidadosamente os ossos, esfregando-os com uma toalha de papel grosseiro a fim de remover todos os restantes músculos e tecido conjuntivo. Em seguida, enxágue-os no buffer de BM gelada antes de finalmente, transferindo-os para buffer de BM frio fresco no gelo usando um par de pinças de Dumont #7. Repita a etapa 2.2 para os doadores de PA-GFP.
      Nota: O número de células de medula óssea de um único doador varia de acordo com sexo e idade. Escala o número de doadores de acordo com os rácios desejada entrada da medula óssea e números e o número desejado de destinatários. Se os doadores são escassos, os membros da frente podem ser incluídos para extração de medula óssea. Isso normalmente resulta em um adicional 1/3 a ½ das células obtidas de membros posteriores. Normalmente, em qualquer lugar de 50 milhões de células podem ser recuperados por doador, dependendo da idade, sexo, antecedentes e se apenas posteriores ou traseiros e membros da frente estão incluídos.
3. Extração de células de medula óssea
   1. Prepare a argamassa enxaguando no buffer de BM gelada. Escorra o buffer de enxaguar e usar um controlador elétrico pipeta com uma pipeta sorológica 10ml para adicionar 10 mL de tampão de BM gelada fresco.
   2. Transferir os ossos de doadores a 564Igi para a argamassa usando um par de pinças de Dumont #7 e usar o pilão, para esmagar e moer os ossos para liberar a medula óssea. Aspirar o extrato de medula óssea com uma pipeta sorológica 10ml e passá-lo através de um filtro de célula de 70 µm em um tubo de 50 mL no gelo.
   3. Adicionar um adicional 10 mL de tampão de BM gelada fresco para a argamassa e repita o procedimento para garantir a completa recuperação das células. Remova a argamassa com uma toalha de papel material ósseo, descartar adequadamente e enxaguar a argamassa cuidadosamente com etanol a 70%, seguido pelo buffer do BM. Repita a etapa 2.3 para o grupo de doadores de medula óssea de PA-GFP.
4. Contagem de células de medula óssea
   1. Utilizando uma micropipeta, coloque uma gota contendo 40 µ l de tampão de Lise RBC em um pedaço de filme plástico de parafina. Inverter o tubo de medula óssea 564Igi algumas vezes e tirar um 10 µ l alíquota usando uma micropipeta. Misture-o com a 40 µ l de gota de tampão de lise de RBC.
   2. Posteriormente adicione 50 µ l de azul de Trypan (0,4% em solução aquosa) para a entrega. Imediatamente carrega 10 µ l da mistura resultante em um Burker-Türk hemocytometer e contagem ao microscópio. Calcule o número de células por mL, usando a 10 x fator de diluição total. Confirmar a viabilidade celular adequada > 90%. Repita a etapa 2.4 para o grupo de doadores de medula óssea de PA-GFP.
5. Preparação de suspensões de doador
   1. Com base em contagens obtidas no passo 2.4 e o número desejado de destinatários, calcule o volume de doador de medula de cada um dos grupos de dois doadores para ser misturado no tubo de mistura do doador.
      Nota: por exemplo, para configurar um grupo de 564Igi:PA mista 1:2-quimeras GFP com 6 CD45.1 destinatários: cada destinatário requer 20 x 10⁶ doador células total, 1 parte de 564Igi e 2 peças de PA-GFP. Portanto, isso requer 6 x 1/3 x 20 x 10⁶ = 40 x 10⁶ células de doador de 564Igi e 6 x 2/3 x 20 x 10⁶ = 80 x 10⁶ PA-GFP células de doador.
   2. Misture as quantidades apropriadas de medula do doador PA-GFP e 564lgi em um tubo cónico de 50 mL. Centrifugue a mistura de medula óssea em 200 x g e 4 ° C durante 10 minutos utilizando um rotor de balde oscilante.
   3. Decante o sobrenadante e ressuspender as células em buffer de BM gelada em uma densidade de 1 x 10⁸ células por mL. Transferir para um tubo de microcentrifuga pré-resfriado 1,5 mL no gelo.
6. Destinatários reconstituição de medula óssea com medula óssea do doador
   1. ANESTHETIZE destinatários usando indução com fluxo contínuo de 4% de isoflurano no ar, seguido de manutenção em 3,75%. Verifique se o plano adequado de anestesia por ausência de reflexo de dedo-pinch.
   2. Agite cuidadosamente o tubo contendo a mistura de medula óssea para garantir adequada ressuspensão das células da medula óssea e, em seguida, 200 µ l de aspirado de medula óssea mix (~ 20 x 10⁶ células), em um 0,3 mL, 30 calibre seringa de insulina.
   3. Coloque o receptor de lado, esticar suavemente a pele acima e abaixo do olho para ligeiramente 'arrancar do olho' e Introduza cuidadosamente a ponta da seringa aproximadamente em um ângulo de 30° para a frente do buraco do olho, tendo o cuidado de evitar o olho e o tecido circundante. Quando a ponta da agulha é sentida ao toque do osso, sublinhando o buraco do olho, retraia ligeiramente (~0.5 milímetros) e injetar lentamente a medula óssea de doador utilizando uma pressão constante.
      Nota: Deve haver sem sangramento, sem vazamento de fluido e não muito pequeno abaulamento do olho em cima da injeção.
   4. Retornar o rato da gaiola com água ad libitum de antibiótica e verifique se a recuperação imediata do procedimento. Repita a etapa 2.6 para cada destinatário.
      Nota: Injeção de cauda-veia pode ser usada em vez de injeção retroorbital, com resultados semelhantes, no entanto, em nossas mãos é consideravelmente mais lento, que pode ser uma preocupação quando se trabalha com grandes grupos de destinatários. Recuperação de animais anestesiados diretamente na roupa de cama de pequeno diâmetro deve ser evitada, visto que representa um risco de aspiração e asfixia
7. Remoção da água antibiótica (dia 14)
   1. Retire a água antibiótica a cage(s) e substitua por água potável regular.

3. verificação bem-sucedida reconstituição e verificando o grau adequado de quimerismo (semana 6)

1. Retroorbital sangramento de quimeras e controles
   1. Prepare tubos de colheita de sangue, rotulagem 1,5 mL microcentrifuge tubos de acordo com números de etiqueta de orelha destinatário e adicionar 50 µ l de PBS contendo 5 mM EDTA.
      Nota: Inclua controlos adequados para PA-GFP, CD45.1 e CD45.2 e 9 11 (idiotipo). Isso pode ser feito, incluindo 1 PA-GFP + mouse, 1 CD45.1 de rato, 1 rato B6 e 1 564Igi de rato.
   2. ANESTHETIZE ratos e verifique se o plano adequado de anestesia como na etapa 2.6.1. Coloque a Quimera de lado, esticar suavemente a pele acima e abaixo do olho para ligeiramente 'arrancar do olho'.
   3. Introduza cuidadosamente um enrolado BoPET heparinizado tubo capilar (volume interno de 60 µ l) aproximadamente em um ângulo de 40° para a frente do buraco do olho, tendo o cuidado de não danificar o olho e o tecido circundante. Torção/Rode suavemente o tubo até que ele começa a se encher com sangue.
   4. Permitem que o sangue para encher passivamente o tubo por acção capilar, até quase completamente cheio, então retire o tubo e coloque-o no tubo da coleção pre-rotulados correspondente, enquanto ao mesmo tempo relaxante imediatamente o aperto ao redor dos olhos para permitir que o olho para resolver para a posição. Sangramento deve parar imediatamente.
   5. Certifique-se de que o tubo capilar tem esvaziado no tubo de coleta e descarte-a em um recipiente de objectos cortantes. Fechar o tubo e inverter três vezes para assegurar uma mistura completa com o PBS/EDTA.
   6. Retornar o rato da gaiola e verifique se a recuperação imediata do procedimento. Repita o passo 3.1 para cada rato experimental e controles apropriados.
      Nota: Tenha cuidado ao usar a punção da veia submandibular como esse método pode representar um maior risco para a infecção acidental em destinatários irradiados antes que estas são totalmente reconstituídas. Além disso, em nossa experiência, descobrimos que o volume de sangue coletado e a quantidade de sangue perdido devido a sangramento excessivo é mais variável. Ambas estas considerações são importantes, como as quimeras de medula óssea são sensíveis na fase de reconstituição, antes que a nova medula óssea é totalmente incorporada e hematopoiese retomou a níveis normais.
2. Purificação de células mononucleares (PBMC) de sangue periférico
   1. Após a conclusão da coleta de sangue, brevemente (10 s) centrifugar os tubos a baixa velocidade (< x 200 g) coletar o diluídos estabilizado sangue na parte inferior dos tubos.
   2. Encha uma seringa de 10 mL com meio de separação de linfócitos e anexar uma agulha de 18 G. Introduza a agulha no fundo do tubo do primeiro e underlayer a amostra de sangue com 1 mL de meio de separação de linfócitos. Cuidadosamente, retirar a agulha e limpe-a com uma toalha de papel para evitar a contaminação cruzada da próxima amostra.
   3. Prosseguir através de todas as amostras e, em seguida, centrifugar durante 25 minutos a 800 x g, à temperatura ambiente, em uma centrífuga balançando-balde, com os freios definidos como baixa/desligar.
   4. Prepare um conjunto de correspondentes 1,5 mL microcentrifuge tubos contendo 1 mL de tampão BM gelada cada.
   5. Após centrifugação, para cada amostra, insira a camada superior (plasma) com uma micropipeta de 200 µ l e aspire a camada de células mononucleares (MNC) logo acima da interface. Transferi as células para o correspondentes tubo contendo 1 mL de tampão de BM. Feche a tampa e inverter para misturar. Descarte o tubo de contendo meio de separação de linfócitos.
   6. Prosseguir através de todas as amostras e centrifugar a 200 x g por 5 min, 4 ° C, em um rotor de balde oscilante. Aspirar e desprezar o sobrenadante e resuspenda o pellet em 200 µ l de tampão de BM gelada. As amostras estão agora prontas para anticorpo de coloração e análise do fluxo cytometric.
3. Coloração para avaliação de fluxo cytometric
   Nota: Sugeriu painel: CD45.1-FITC, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A568, CD45.2-APC. PA-GFP ativado não é detectado no Pacífico canal laranja (ou equivalente). Nenhuma tintura de viabilidade é necessária, como a separação de linfócitos se livra de células mortas.
   1. Utilizando uma micropipeta, adicione 100 µ l de suspensão de células por poço para cada amostra de Quimera e controle, para uma placa de 96 poços.
   2. Para as 3 amostras de controle não-PA-GFP, juntar os restantes 100 µ l de cada amostra (300 µ l total). Adicione 50 µ l deste material para controle imaculado e único controle manchada wells. Para o controle de PA-GFP single-manchado além disso adicione 50 µ l de amostra de PA-GFP imaculada.
   3. Para cada poço, adicionar 100 µ l de tampão (inocente), único anticorpo (controles de compensação single-manchado, exceto para o controle de compensação de PA-GFP) ou mistura de anticorpo (amostras). Incube no gelo por 20 minutos.
   4. Centrifugar a 200 x g por 5 minutos a 4 ° C. Filme de buffer. Adicionar 200 µ l de tampão de BM a cada poço e centrifugue novamente para lavar. Flick fora do buffer e ressuspender as células em cada poço em 200 µ l de tampão de BM. As amostras estão agora prontas para análise em um citômetro de fluxo (Figura 1).
      Nota: Respostas de centro germinativo nas quimeras podem ser analisadas em qualquer ponto de 6 semanas em diante.

4. In vivo de rotulagem do seio subcapsular/zona marginal para auxiliar a identificação dos centros germinativos único

Nota: O presente protocolo é demonstrado por Whitney/jarrete (linfonodo poplíteo) e injeções intravenosa (i.v., baço), mas pode ser variado de acordo com o site de destino.

1. Injeção de Whitney bilateral para a rotulagem de linfonodo poplíteo
   1. Anestesia os ratos como na etapa 2.6.1.
   2. Em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, dilua 2 µ l de anticorpo de CD169 antirato rato PE-etiquetadas em 18 µ l de PBS, pH 7,4. Coloque duas gotas de 10 µ l de cada da mistura em um pedaço de filme plástico de parafina. Aspire cada gotícula utilizando uma seringa de insulina 0,3 mL com uma agulha de 30 calibre.
   3. Injectar a 10 µ l de rotulagem mistura em ambos o Whitney (entrar com a agulha em um ângulo de 5-10° na parte central da pata, proximal desde o início dos dedos e insira a agulha aproximadamente a meio caminho em direção ao calcanhar) ou o jarrete (entrar com a agulha em um 5 - 10 ° ângulo acima do calcanhar e inserir sobre metade do seu comprimento ao longo do eixo do tendão de Aquiles no sentido do joelho). Retornar os ratos de suas gaiolas e aguarde aproximadamente 15 minutos antes de prosseguir com o passo 5.
2. Injeção intravenosa para a rotulagem de baço
   1. Anestesia os ratos como ponto 2.6.1.
   2. Em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, dilua 10 µ l de anticorpo de CD169 antirato rato PE-etiquetadas em 90 µ l de PBS. Aspire a mistura com uma seringa de insulina de 0,3 mL.
   3. Realize a injeção de i.v. retroorbital conforme passo 2.6. Retornar os ratos de suas gaiolas e aguarde aproximadamente 15 minutos antes de prosseguir com o passo 5.
      Observação: como alternativa ao isoflurano, injeção anestésica como mistura de xilazina/cetamina pode ser usada; no entanto, isso geralmente leva a tempos de recuperação mais lentos. Desde que a drenagem linfática é geralmente influenciada pelo movimento do músculo esquelético, isso é esperado para levar a tempo de drenagem mais lento.

5. explanting o baço e linfonodos e preparar o photoactivation

1. Preparar uma câmara de imagiologia e photoactivation dupla face
   1. Remover o êmbolo de uma seringa de 20 mL e volta-carga-com graxa vácuo inserindo o bico de um tubo de vácuo graxa nele. Em seguida, remover o êmbolo de uma seringa de 5 mL e usar a seringa de 20 mL para trás-carga com graxa de vácuo.
   2. Use a seringa de 5 mL de carregado de vácuo-graxa para preparar uma imagem e câmara photoactivation colocando uma lamela quadrada numa superfície plana e rastreamento ao longo das bordas da lamela com graxa de vácuo (aproximadamente 1-2 mm das bordas).
      Nota: tenha cuidado para evitar a contaminação da graxa vácuo de todas e quaisquer superfícies que posteriormente entrar em contacto com a lente do microscópio, como microdroplets de vácuo óleo emulsionado em água a imersão pode contaminar a lente.
   3. Encher a câmara de vácuo graxa-lamínula com buffer de BM gelada e coloque sobre uma superfície plana e fria.
2. Colheita de linfonodos e baço
   1. Eutanásia em in vivo rotulado quimérico mouse para ser analisado conforme passo 2.2.1. Uma mangueirada a carcaça com etanol a 70%.
   2. Para acessar o linfonodo poplíteo, use tesoura reta fina para fazer uma incisão na pele logo abaixo do poço do joelho e estender o corte para cima ao longo da coxa-linha quase até a articulação do quadril. Usando Dumont #5 ou 7 # pinça, puxe cada uma das abas expostas para fora da pele, para expor o tecido na fossa poplítea (Figura 2A).
   3. Com cuidado usando um par de pinças de Dumont #5, digite fossa poplítea apenas medial à veia poplítea e dissecar abrir a gordura inserindo e abrindo e fechando a pinça ao longo do eixo da perna, para expor o linfonodo poplíteo subjacente.
   4. Pop do nó de linfa da fossa por beliscar o músculo quadríceps do lado da frente proximal ao joelho usando o polegar e o dedo indicador (Figura 2B). Agarra o nó de linfa de baixo com a pinça para libertá-lo no tecido circundante (Figura 2) e coloque-o na câmara de vácuo graxa preparada na etapa 5.1.
   5. Repita os passos de 5.2.2 – 5.2.4 para o lado contralateral. Múltiplos nódulos linfáticos podem ser montados em uma única câmara, se desejado.
   6. Finalmente, feche a câmara colocando uma segunda lamela em cima da borda de vácuo graxa e pressionando suavemente para baixo, tomando cuidado para expulsar todas as bolhas de ar.
      Nota: Alguns do buffer podem ser empurrado para fora também, mas a gordura a vácuo deve formar um selo apertado, impedindo o vazamento do fluido (Figura 2D). Os linfonodos estão agora em uma câmara de imagem dupla-face.
   7. Para acessar o baço, usando um par de tesouras bem direto fazer uma incisão através da parede abdominal no lado esquerdo do mouse, proximal à linha anterior e medial, apenas abaixo da caixa torácica e estendê-lo ao redor do corpo até a linha axilar posterior. A ponta do baço deve ser visível (Figura 3A).
   8. Retirar o baço com um par de pinças de Dumont #7 e corte das aderências na parte inferior para liberá-lo. Use o par de tesoura reta fina para cortar mm ~ 2 fatias grossas, transversais.
   9. Coloque a fatia na câmara de vácuo graxa preparada na etapa 5.1. Várias fatias de baço podem ser montadas em uma única câmara, se desejado.
   10. Finalmente, feche a câmara colocando uma segunda lamela em cima da borda de vácuo graxa e pressionando suavemente para baixo, tomando cuidado para expulsar todas as bolhas de ar. Manter todas as câmaras de imagem no gelo em todos os momentos, exceto durante a imagem latente e fotoativação.
       Nota: Alguns do buffer podem ser empurrado para fora também, mas a gordura a vácuo deve formar um selo apertado, impedindo o vazamento de fluido. As fatias do baço estão agora em uma câmara de imagem dupla-face (Figura 3B).

6. Photoactivation

1. Identificação único centros germinativos
   Nota: Este protocolo é descrito para o baço, mas é inteiramente análogo para os nódulos linfáticos.
   1. Coloque a câmara de imagem no palco microscópio. Utilizando uma pipeta de transferência de plástico de 3,5 mL, coloque uma gota de água destilada em cima da lamela superior e inferior o objetivo até o ponto de contato. Concentre-se na parte superior do tecido, usando a luz transmitida.
   2. Alterne para o modo escuro e excitação de dois fotões e ajustar o laser para 940 nm.
      Nota: Com os conjuntos de filtro apropriado, este comprimento de onda permite excitação e detecção de segunda geração de harmônicos em estruturas que contenham colágeno associadas com os grandes vasos e elementos estruturais, bem como o CD169-PE injetado na etapa 4.2, que Identifica a zona marginal. No entanto, 940 excitação nm não não Fotoativar PA-GFP.
   3. Localizar branco-polpa áreas individuais (delimitadas pela coloração de CD169-PE) perto da superfície do tecido e identificar a bainha linfoide periarteriolar (PALS, zona de células T), a segunda geração de harmônicos, associada com a arteríola central. Na zona entre os amigos e a zona marginal, olha para a presença de altamente autofluorescent, ativado macrófagos tingible do corpo (sinal de autofluorescent forte em todos os canais, bolha-como a aparência com vacúolos escuros) (Figura 4A).
      Nota: Se necessário, devido à orientação indesejável do tecido, a câmara de imagem pode ser invertida e imagens podem ser realizada de outra direção.
   4. Com base em características identificadas na etapa 6.1.3., desenhar uma região de interesse, identificação de uma área de único centro germinativo. Configurar uma Z-pilha de em torno de 100-150 µm profundidade, a partir da superfície do tecido e usando um tamanho de passo de ~ 3 µm.
   5. Mudar para onda de excitação 830 nm. Desligue ou dim todos os canais para evitar Fotodano detectores (como poder do laser e fluorescência de saída normalmente é drasticamente mais elevada neste comprimento de onda) e em seguida 'imagem' na pilha.
      Observação: Configurações específicas, tais como laser tempo de interrupção de energia e pixel, dependem da profundidade do tecido, o tecido específico usado e o sistema da imagem latente. Cada aplicativo tem que ser otimizado para o sistema de imagem específico usado. Enquanto é essencial para obter o photoactivation eficiente em toda a pilha, tenha cuidado para não Fotodano as células.
   6. Volte de onda de excitação 940 nm e reabrir os canais. Fazer a varredura através da pilha para confirmar o photoactivation eficiente ao longo (Figura 4B) e ausência de Fotodano (sinal de PA-GFP difusa, não-celular-delimitada, manchas escuras ou autofluorescência de alto grau na área fotoativo).
   7. Proceder à Fotoativar todos os tecidos relevantes na câmara de imagem e, em seguida, imediatamente devolvê-lo em gelo até o processamento adicional. Prossiga com o photoactivation das câmaras de imagem adicionais.
      Nota: Tecido explanting, montagem e particularmente photoactivation são processos demorados, mas o total tempo de rotação deve ser restringido para 4-6 horas, para evitar uma redução dramática na viabilidade celular.

7. recuperação e análise de células fotoativo

1. Extração de linfócitos de linfonodos e baço
   1. Para cada amostra fotoativados, prepare um tubo de microcentrifuga adequadamente rotulado de 1,5 mL contendo 500 µ l de tampão de BM no gelo. Inclui amostras de um controle de não-PA-GFP e um rato PA-GFP não está ativado. Isso pode ser feito, incluindo um controle de B6 e um rato de controle de PA-GFP.
   2. Remova cuidadosamente o deslizamento da tampa superior da câmara de imagem, tendo o cuidado de manter a posição das amostras (se várias amostras estão presentes em uma única câmara) e colocar cada amostra em seu tubo de amostra respectivos.
   3. Usando um homogeneizador de pilão, esprema o tecido e torça o pilão no tubo para liberar os linfócitos. Utilizando uma micropipeta, aspirar o lisado e filtrar através de um filtro de célula de 70 µm para um tubo de microcentrifugadora fresco, pre-cooled 1,5 mL. Para amostras de linfonodo, pule para a etapa 7.1.5.
   4. Para amostras do baço, centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 ° C, em um rotor de balde oscilante. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 200 µ l de tampão de lise de RBC. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente, em seguida, adicionar 800 µ l de tampão de BM gelada e prosseguir para a etapa 7.1.5.
   5. Centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 ° C, em um rotor de balde oscilante. Desprezar o sobrenadante e ressuspender em 200 µ l de tampão de BM gelada. As amostras estão agora prontas para coloração para avaliação de fluxo cytometric e classificação, se desejado.
2. Coloração para avaliação de fluxo cytometric
   Nota: Sugeriu painel: CD169-PE, Cy5.5-B220-PerCP, 9d 11-A647, CD38-PE-Cy7, tintura de viabilidade fixável Efluor-780, GL7-Pacific Blue. PA-GFP ativado não é detectado no Pacífico canal laranja (ou equivalente). Photoactivated PA-GFP é detectado no canal da GFP. Qualquer macrófagos co purificados (que podem ou não podem ter sido em vivo rotulado com CD169-PE) podem ser excluídos por coloração com CD169-PE e usar isto como um portão de despejo.
   1. Utilizando uma micropipeta, adicione 100 µ l de suspensão de células por poço para cada amostra de Quimera e controle, em uma placa de 96 poços.
   2. Para as amostras de controlo de B6, adicione 50 µ l deste material para controle imaculado e único controle manchada wells. Para o controle de single-manchado de PA-GFP não está ativado além disso adicione 50 µ l de amostra de PA-GFP imaculada não está ativado. Para o controle de single-manchado de PA-GFP ativado, piscina o restante material para todas as amostras fotoativados.
   3. Para cada bem, adicionar 100 µ l de buffer (inocente e controla compensação de PA-GFP), único anticorpo (controles de compensação single-manchado) ou mistura de anticorpo (fotoativo amostras). Incube no gelo por 20 minutos.
   4. Centrifugar a 200 x g 5 minutos a 4 ° C. Filme de buffer. Adicionar 200 µ l de tampão de BM a cada poço e centrifugue novamente para lavar. Flick fora do buffer e ressuspender as células em cada poço em 200 µ l de tampão de BM. As amostras estão agora prontas para análise em um citômetro de fluxo ou classificador (resultados representativos na Figura 5).

Resultados

Geração de quimeras misto de medula óssea

O presente protocolo robustamente alcança quimeras misto da medula óssea com uma quase completa quimerismo no compartimento da pilha de B como mostrado no resultado representativo na Figura 1 (para significância estatística, consulte ¹²). As serotipagem revela normalizado B celulares com 6 semanas pós reconstituição (figura 1A), com uma baixa frequência de 9 11 (idiotipo) células B circulantes positivas decorrentes do compartimento de 564Igi (figura 1B). Dentro do portão de linfócitos totais, existe uma baixa frequência de células derivadas de destinatário residuais, ~ 6% CD45.1 (Q1), indicando um grau geral de quimerismo ~ 94% (Figura 1). Dentro do doador do compartimento (CD45.1-, Q3 + Q4) a relação de 564Igi (Q4) de PA-GFP (Q3) é de cerca de 23% para 77%. Ligeiramente inferior a entrada de 33% e 66% de rácio é explicado pela seleção negativa pesada de células B derivado do compartimento de 564Igi ¹². Como visto na Figura 1, há praticamente completo quimerismo no compartimento da pilha de B (99,9% CD45.1-) e dominância de PA-GFP derivadas da medula óssea de células B (Q3), que é uma consequência da seleção negativa pesada de 564Igi-derivado de células B.

Colheita de tecidos, processamento e avaliação de fluxo cytometric

Figura 2 e Figura 3 demonstram procedimentos e resultados da explanting recentemente isolaram, linfonodos e baço fatias. A Figura 4 apresenta um resultado representativo para a rotulagem em vivo e fotoativação de uma área de único centro germinativo em uma fatia de baço explantados. Como pode ser visto (Figura 4A), a rotulagem in vivo com CD169-PE rotulou robustamente a zona marginal (vermelho, indicado por "MZ"). O segundo sinal de harmônicos é apreciado em elementos estruturais que contenham colágeno e vasos principais (azuis), incluindo a arteríola central da bainha linfoide periarteriolar (PALS). Altamente autofluorescent, ativados macrófagos tingible-corpo estão associados com atividade centro germinativo (setas). Tomados em conjunto, a identificação da zona marginal, PALS e macrófagos tingible do corpo, permite a identificação de uma região de interesse que provavelmente contém um único centro germinativo. A região de interesse é fotoativo, conforme ilustrado na Figura 4B. Como demonstrado, photoactivation é microanatomically precisos⁹, produzindo uma área definida de ativação. Os resultados apresentados, além disso, servir como confirmação de elevada densidade de PA-GFP + linfócitos no quimeras reconstituídas e presença de centros germinativos espontâneas. Avaliação de cytometric do fluxo a jusante mais confirma normalizado B compartimento celulares (Figura 5), uma população espontânea centro germinativo (Figura 5E) e a presença de um subconjunto de células centro germinativo B que tenham sido fotoativados (Figura 5F).

Assim, o presente protocolo apresenta um método robusto para a geração de quimeras misto da medula óssea com espontânea auto-reativas centros germinativos, que são compostos predominantemente de células B derivadas tipo selvagem, carregando um repórter photoactivatable. Isto permite análises a jusante de centros germinativos individuais (visão geral gráfica na Figura 6).

Figura 1: Fluxo cytometric avaliação do grau de quimerismo em sangue de 564Igi (CD45.1-, PA - GFP-): PA-GFP (CD45.1-, PA-GFP +) misturado quimeras em letalmente irradiados CD45.1 destinatários (CD45.1 +, PA - GFP-), 6 semanas pós reconstituição. A) enredo mostrando retenção de células B220 + B, pre-condomínio fechadas em linfócitos singlet. B) Subgate de enredo A, apresentando 9 11 + (idiotipo) frequência entre a população de células B. C) Sinopse do PA-GFP contra CD45.1, pre-condomínio fechado em linfócitos singlet. D) trama de PA-GFP contra CD45.1 no subgate de células B da trama do r. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Procedimento para colheita e montagem linfonodos poplíteos para imaging e photoactivation. A) uma incisão é feita abaixo do joelho e prolongado até a articulação do quadril, e as bordas são retraídas para os lados, a fim de expor a fossa poplítea (seta). B) o fatpad sobrejacente é aberto e o linfonodo poplíteo é exposta (seta). C) o linfonodo poplíteo é obtido da fossa. D) o procedimento é repetido para o lado contralateral, e ambos os nós são montados em uma câmara de lamela/vácuo-graxa dupla face cheia de buffer de BM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: procedimento de colheita e o baço para fotoativação e imagens de montagem. Um) uma incisão é feita na linha medial anterior, logo abaixo da caixa torácica e estendida ao redor do corpo até a linha axilar posterior, e as bordas são retraídas para expor a ponta do baço (seta). B) o baço retraído e extirpado e corte em fatias finas (1-2mm), que são montadas em uma câmara de lamela/vácuo-graxa verso preenchida com buffer de BM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Fotoativação. A) dois fotões Micrografia de um centro germinativo no baço antes de fotoativação. Rotulagem in vivo com anti-CD169-PE foi realizada antes da colheita do baço para rotular a zona marginal (vermelho, indicado por "MZ"). Os segundo harmônicos do sinal é aparente em estruturas que contenham colágeno associadas com o tegumento e vasos principais (azul). Pontas de seta identificam altamente autofluorescent, registrados os macrófagos tingible do corpo associados com atividade de centro germinativo. Imagem foi realizada em 940 excitação nm. A barra de escala no canto superior esquerdo indica 200 µm. B) quanto A, mas depois photoactivation em 830 nm. Fotoativados células são agora visível (verde), em uma região definida de interesse delimitada pela zona marginal e englobando os macrófagos tingible-corpo identificados anteriormente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Fluxo cytometric análise de células do centro germinativo B fotoativados. A) lote de frente contra o portão lateral de dispersão e de linfócitos. B) parcela da área de dispersão para a frente, em função da altura de dispersão para a frente dentro do portão de linfócitos e o portão de singlete resultante. C) viabilidade tingir exclusão trama dentro do portão singlet e portão resultante de células vivas. D) Gating de células B220 + B. Gating E) de células B de centro germinativo, identificado como CD38lo GL7hi células dentro do portão B220 +. F) Gating fotoativados células no seio da população de pilha GC B, identificado como o subconjunto de células expressando co não está ativado e fotoativados PA-GFP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: visão gráfica do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Um grande número de modelos murino de auto-imunidade está disponível, muitos dos quais presentes com centros germinativos espontânea¹⁶. No entanto, muitos dos modelos disponíveis abrigam fundos genéticos complexos ou mutações em centrais reguladores da proliferação de linfócitos ou ativação, tornando-as mal adaptado à intercrossing com linhas de repórter e estudos de comportamento normal dos linfócitos em auto-imunidade, respectivamente. O presente modelo, pelo contrário, permite uma abordagem de 'plug-and-play' para análises aprofundadas de células de centro germinativo selvagem-tipo-derivado B auto-reativas usando qualquer combinação desejada de transgenes, nocautes e repórteres, no presente caso representado por photoactivatable GFP. Usando estratégias de rotulagem in vivo, centros germinativos único podem ser visualizados em tecidos linfoides explantados e seus constituintes celulares fotoativados usando um microscópio de dois fotões. Fotoativados linfócitos de centros germinativos único podem então ser analisado ou classificada de fluxo cytometrically, como células únicas ou a granel. Estas células posteriormente podem ser submetidas a análises moleculares e funcionais a jusante adicionais para fornecer insights renovadas no campo de auto-imunidade.

Existem alguns passos críticos para o desempenho bem sucedido deste procedimento. Como demonstrado pelos resultados representativos, a irradiação (1.100 Rad) e reconstituição de medula óssea do doador substituir com sucesso o compartimento de destinatário da medula óssea, rendendo quase completa quimerismo no compartimento da pilha de B. Este é um ponto importante, como as células B destinatário-derivado residuais tornaria um subconjunto da população centro germinativo 'dark'. Independentemente da fonte usada para a irradiação, o timing/dose de irradiação tem que ser otimizado para produzir o efeito máximo mieloablativo com dano tecidual colateral mínimo aos animais. Para reconstituição, o protocolo de esmagamento de osso e reconstituição com 20 milhões de células de doador total foi encontrado para produzir robustamente graus elevados de reconstituição. Trabalhar estéril e fria/no gelo para a extração de medula óssea garante alta viabilidade da doação de medula. Para alcançar o desejado doador rácios de medula óssea, é essencial ter um cuidado grande quando contando alíquotas das células, tanto para a contagem em si e quando estiver retirando a subamostra de medula óssea para a contagem. Mistura e granulação co os tutanos de doadores, em vez de centrifugação e resuspending separadamente e depois misturar, servem para evitar qualquer distorção em rácios de doador após a contagem de células.

A geração de Quimera mista da medula óssea do protocolo pode ficar sozinha, e permite a geração de quimeras com centros germinativos auto-reativas com qualquer repórter desejado, transgene ou mata-mata. No entanto, uma limitação para isso é a necessidade de usar histocompativéis doadores. A tensão de 564Igi é sobre um fundo de congenic C57Bl/6J e como consequência, os outros doadores e beneficiários devem ter um fundo de congenic H-2b (ou alternativamente, a estirpe de 564Igi deve ser traçada para a estirpe desejada e o fenótipo auto-imune verificado no novo plano de fundo). O procedimento de irradiação tende a favorecer um ambiente de tolerogenic¹⁷, e incompatibilidades em alguns antígenos de histocompatibilidade menores podem ser toleradas. No entanto, este aspecto deve ser considerado cuidadosamente, particularmente se mistura doadores masculinos e femininos e/ou destinatários, devido ao potencial de reatividade feminino com Y-antígenos macho-restrito.

Da mesma forma, o aspecto de fotoativação do protocolo pode estar sozinho e pode ser usado em muitos contextos diferentes. No entanto, o repórter PA-GFP está disponível apenas com o promotor UBC, que é ativo em todas as células hematopoiéticas linhagem, mas não em células do estroma. Como mencionado na introdução, outros photoactivatable, photoswitchable ou photoconvertible repórter estirpes estão disponíveis e podem ser substituídas por PA-GFP, com ajustamento adequado das condições experimentais.

É importante evitar photoactivation inadvertida de áreas indesejáveis, mantendo-se o laser bem acima de 900 nm quando de imagem, como esta vontade de comprimento de onda não Fotoativar PA-GFP. Para o photoactivation propriamente dito, configurações específicas, tais como laser tempo de interrupção de energia e pixel, vão depender da profundidade do tecido, o tecido específico usado e o sistema da imagem latente, e cada aplicativo tem que ser otimizado para o sistema de imagem específico usado. Tenha cuidado para não Fotodano as células, mas é ao mesmo tempo essencial para obter o photoactivation eficiente em toda a pilha, a fim de obter uma representação suficiente de células ativadas por análises a jusante. Centro germinativo B células geralmente constituem em qualquer lugar de 0,5% de ~ 2% das células do linfonodo esplênica ou cutânea B, e como pode ser visto nos resultados representativos (Figura 5), fotoativados único centro germinativo B células podem fazer ~ 1% do total população presente em uma fatia de baço único. Portanto, análise bem sucedida ou classificação de um número significativo de células requer um grande número de eventos de processamento.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo, 9D11-A568		Hiridoma 9D11 gerado internamente, gentilmente fornecido por MC Carroll, rotulado com kit: Biotium 92255
Anticorpo, anti-camundongo / antígeno GL7 humano azul do Pacífico (marcador de ativação de células T e B)	Biolegend	144613
anticorpo, PE anti-camundongo CD169 (Siglec-1)	Biolegend	142403
anticorpo, PE / Cy7 anti-camundongo CD38	Biolegend	102717
anticorpo, PerCP / Cy5.5 anti-camundongo / humano CD45R / B220	Biolegend	103235
tubo capilar,	células de 211766		Fisher Scientific
, 70 µ m	Falcon	352350
Tubos cônicos, 50 mL	Falcon	352235
Lamínula, quadrado, 22x22 mm, 0,13-0,17 mm	Thermo Fisher Scientific	22X22-1
EDTA	Merck	1.084.180.250
Etanol, 70%	VWR	8301.360
Soro fetal bovino	Life Technologies	10270106
Citômetro de fluxo, FACS Canto II	BD Biosciences	338962
Citômetro de fluxo, LSRFortessa SORP	BD Biosciences-Produto		de encomenda especial com 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm e 640 nm)
Graxa, alto vácuo, Dow Corning	VWR	DOWC1597418
Hemocitômetro, Burker-Tü rk	VWR	630-1544
Isoflurano, IsoFlo vet.	Orion Pharma	9658
Meio de separação de linfócitos (Meio de separação de células Lympholyte-M)	Cedarlane	CL5035
, 1,5 mL (Eppendorf)	Microscópio Sarstedt	72.690.550
, Two-photon	Prairie Technologies (agora Bruker)	-	Pedido especial Argamassa de microscópio de dois fótons Ultima In Vivo
com lábio, não vidrado, 75 ml	VWR	410-0110
Agulha NaHCO3	Merck	1063290500
, calibre 18	BD Medical	304622
NH4Cl	VWR	87.769.290
PBS	Sigma	d8537
Homogeneizador de pilão	VWR	47747-358
Pilão, não vidrado, 175 mm	VWR	410-0122
Pipeta, serológica, 10 ml	VWR	612-3700
Pipeta, transferência, plástico	Sarstedt	861,172,001
Película de parafina de plástico (Parafilm M)	Bemis	PM996
Placa, 96 poços	Falcon	353910
Fórceps cirúrgico, Student Dumont #5 Fórceps	FST - Fine Science Tools	91150-20
Pinça cirúrgica, Student Dumont #7 Fórceps	FST - Fine Science Tools	91197-00
Tesoura cirúrgica, Tesoura fina Student, Straight	Science Tools	91460-11
Seringa, 10 mL	Terumo	SS-10ES1
Seringa, 20 mL	Terumo	SS-20ES1
Seringa, 5 mL	Terumo	Seringa SS-05S1
, Insulina, 0,3 cc	BD Medical	324827
Tribrissen vet. 24% inj., contendo 200 mg de sulfadiazina e 40 mg de trimetoprim/ml	MSD Saúde animal	431577
Solução azul de tripano, 0,4%	VWR	K940-100ML
Corante de viabilidade, eBioscience Corante de viabilidade fixável eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	65-0865-14