Este ensaio de matança de opsonophagocytic é usado para comparar a capacidade de células fagocíticas de imunes a responder e matar as bactérias com base em diferentes tratamentos e/ou condições. Classicamente, este ensaio serve como o padrão ouro para avaliar funções efetoras dos anticorpos produzidos contra uma bactéria como opsoninas.
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Artigo de método
Ensaio de matar Opsonophagocytic para avaliar as respostas imunológicas contra patógenos bacterianos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Um aspecto fundamental da resposta imune a colonização bacteriana do host é fagocitose. Um ensaio de matança de opsonophagocytic (OPKA) é um procedimento experimental em que células fagocíticas são co cultivadas com unidades bacterianas. As células do sistema imunológico irão fagocitar e matar as culturas bacterianas de forma dependente de complemento. A eficiência da matança imune mediada por células é dependente de uma série de fatores e pode ser usada para determinar bacteriano como diferente culturas comparam no que diz respeito a resistência à morte celular. Desta forma, a eficácia da terapêutica potencial imunológico-baseado pode ser avaliada contra estirpes de bactérias específicas e/ou serótipos. Neste protocolo, descrevemos um OPKA simplificado que utiliza condições de cultura de base e célula contando determinar a viabilidade celular bacteriana após co-cultura com condições de tratamento e HL-60 células do sistema imunológico. Este método tem sido utilizado com sucesso com um número de diferentes sorotipos de pneumococo, capsulares e estirpes de acapsular e outras espécies bacterianas. As vantagens deste protocolo OPKA são sua simplicidade, versatilidade (como este ensaio não é limitado aos tratamentos de anticorpo como opsoninas) e a minimização do tempo e reagentes para avaliar grupos experimentais básicos.
Introdução
O opsonophagocytic matar o ensaio (OPKA) é uma ferramenta fundamental para vinculação de alterações na estrutura bacteriana ou função alterações posteriores na resposta imune e na função. Como tal, é frequentemente usado como um ensaio complementar para determinar baseados em imune a eficácia de tratamentos anticorpo candidatos vacinais, otimização de enzimas, etc. Enquanto os ensaios in vivo são necessários para determinar o espaço livre efetivo ou proteção em um modelo de infecção bacteriana, o OPKA pode ser usado para avaliar a contribuição imune à morte da célula bacteriana componentes mais básicos: bactérias, células do sistema imunológico e experimental tratamen....
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Protocolo
1. cultura, diferenciação e validação de células HL-60
- Prepare meios de cultura celular HL-60, composto de 500 mL RPMI com L-glutamina e 50ml inactivadas pelo calor fetal soro bovino. Não adicione antibióticos como isso pode afetar a diferenciação das células HL-60.
- Para propagação/manutenção de células HL-60,6 células de cultura 5 x 10 em 10 mL de meios de cultura de células HL-60 em 75 cm2 exalados frascos em 37 ° C e 5% de CO2. Passagem células todos os dias 3−4 para manter as concentrações de célula ideal.
Nota: A concentração de célula não deve exceder 5 x 106/mL.
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Resultados
Validação de HL-60 diferenciação deve ser executada antes de iniciar o OPKA. Isso pode ser feito usando citometria de fluxo para determinar a expressão extracelular de CD11b, CD35, CD71 e anexina V (Figura 1). Iodeto de propidium também pode ser usado como um marcador da viabilidade. Após o tratamento com DMF durante 3 dias, a expressão de CD35 deve ser aumentada (≥55% de todas as células) e expressão de CD71 deve ser diminuída (≤20% de todas as células). Deve ser a porcentagem de células de.......
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Discussão
OPKAs servir papéis essenciais na avaliação de respostas imunes de anticorpo mediada induzidas pela vacinação6,8. O principal significado deste OPKA simplificado é a capacidade de adaptação nas condições a serem testadas (ou seja, anticorpos, enzimas tratamentos, etc.). Neste sentido, este ensaio pode ser usado para testar a contribuição de opsoninas (ou seja, anticorpos) na fagocitose, mas pode também ser usado para avaliar maneiras de superar os fatores de viru.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. Moon Nahm (Universidade de Alabama Birmingham) por sua inestimável ajuda no estabelecimento de ensaios OPKA em nosso laboratório. Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de saúde Grant 1R01AI123383-01A1 para FYA.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anexina V (conjugada com APC) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, humano (conjugado com PE) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, humano (conjugado com PE) | BioLegend | 334105 | |
| cepa bacteriana a ser usada (ou seja, Streptococcus pneumoniae, WU2) | Laboratório de Referência Respiratória Bacteriana (Dr. Moon Nahm) | ||
| placas de ágar sangue | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glicerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 células | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Controle de isotipo (PE conjugado) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimetilformamida (DMF) | Fisher Meios químicos | ||
Referências
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al.
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Reimpressões e permissões
