Imagem latente 3D de alta resolução da infecção do vírus da raiva no tecido solvente-cancelado do cérebro

Resumo

Novel, técnicas de compensação de tecido compatível com imunocoloração, como a imagem 3D final de órgãos com solventes limpos, permitem a visualização 3D da infecção cerebral pelo vírus da raiva e seu ambiente celular complexo. As fatias grossas, anticorpo-etiquetadas do tecido de cérebro são feitas opticamente transparentes para aumentar a profundidade da imagem latente e para permitir a análise 3D pela microscopia confocal da exploração do laser.

Resumo

A visualização de processos de infecção em tecidos e órgãos por imunolabeling é um método-chave na biologia da infecção moderna. A capacidade de observar e estudar a distribuição, tropismo e abundância de patógenos dentro de tecidos de órgãos fornece dados cruciais sobre o desenvolvimento e progressão da doença. Usando métodos convencionais da microscopia, Immunolabeling é restringido na maior parte às seções finas obtidas das amostras parafina-encaixadas ou congeladas. No entanto, o plano de imagem 2D limitado dessas seções finas pode levar à perda de informações cruciais sobre a estrutura complexa de um órgão infectado e o contexto celular da infecção. As técnicas multicolor, immunomancha-compatíveis modernas do esclarecimento do tecido fornecem agora uma maneira relativamente rápida e barata de estudar pilhas de imagem 3D high-volume do tecido vírus-contaminado do órgão. Ao expor o tecido a solventes orgânicos, torna-se opticamente transparente. Isso corresponde aos índices de refração da amostra e, eventualmente, leva a uma redução significativa do espalhamento de luz. Assim, em combinação com os objetivos livres longos da distância de trabalho, as grandes seções do tecido até 1 milímetro no tamanho podem ser imaged pela microscopia confocal convencional da exploração do laser (CLSM) na alta resolução. Aqui, nós descrevemos um protocolo para aplicar a imagem latente do profundo-tecido após o esclarecimento do tecido para visualizar a distribuição do vírus de raiva em cérebros contaminados a fim estudar tópicos como a patogénese, a propagação, o tropism, e o neuroinvasion do vírus.

Introdução

As técnicas convencionais da histologia confiam na maior parte em seções finas de tecidos do órgão, que podem inerentemente fornecer somente introspecções 2D em um ambiente 3D complexo. Embora viável, em princípio, a reconstrução 3D de seções finas seriais exige condutas técnicas exigentes para fatiar e subsequente no alinhamento silico das imagens adquiridas¹. Além disso, a reconstrução sem emenda de z-volumes depois que fatiar do micrótomo é crítica porque os artefatos mecânicos e computacionais podem remanescer por causa do registo suboptimal da imagem causado por planos nonsobrepor da imagem, por variações da mancha, e por física destruição do tecido por, por exemplo, a lâmina do micrótomo. Em contraste, o corte óptico puro de amostras de tecido grosso intacto permite a aquisição de planos de imagem sobrepostas (sobreamostragem) e, assim, facilita a reconstrução 3D. Isso, por sua vez, é altamente benéfico para a análise de processos de infecção em populações de células complexas (por exemplo, redes neuronais no contexto das células gliais e imunes circundantes). Entretanto, os obstáculos inerentes de seções grossas do tecido incluem o espalhamento claro e a penetração limitada do anticorpo no tecido. Nos últimos anos, uma variedade de técnicas foi desenvolvida e otimizada para superar essas questões^{2,3,4,5,6,7,8 , 9} anos de ^{, 10} de ^{, 11} anos de ^{, 12 anos} de ^{, 13}. essencialmente, os tecidos-alvo são girados opticamente transparentes pelo tratamento com^2,3,4,5,6,7aquosos ^,8,9 ou solvente orgânico-baseado^10,11,12,13 soluções. A introdução de 3Disco (imagem latente 3D de órgãos solvente-cancelados)^11,12 e seu sucessor udisco (imagem latente 3D final de órgãos solvente-cancelados)¹³ forneceu uma ferramenta relativamente rápida, simples, e barata com excelentes capacidades de compensação. Os principais constituintes do protocolo de compensação são os solventes orgânicos tert-butanol (TBA), álcool benzílico (BA), benzoato de benzilo (BB) e éter DIFENÍLICO (DPE). O desenvolvimento e a adição de iDISCO (Immunolabeling-permitiu a imagem latente 3D de órgãos solvente-cancelados)¹⁴, um protocolo de imunomarcação compatível, constituíram uma outra vantagem sobre métodos existentes e permitiram a rotulagem do profundo-tecido dos antígenos de interesse, bem como o armazenamento a longo prazo de amostras imuno-manchadas. Assim, a combinação de iDISCO¹⁴ e udisco¹³ permite a imagem latente de alta resolução de proteínas anticorpo-etiquetadas em grandes seções do tecido (até 1 milímetro) usando CLSM convencional.

A preservação da estrutura complexa de um órgão em todas as três dimensões é particularmente importante para o tecido cerebral. Os neurônios compreendem uma subpopulação celular muito heterogênea com morfologias 3D altamente diversificadas baseadas em suas projeções de neurite (revistas por Masland¹⁵). Além disso, o cérebro consiste em vários compartimentos e subcompartimentos, cada um composto por diferentes subpopulações celulares e suas proporções, incluindo células gliais e neurônios (revisados por von Bartheld et al.¹⁶). Como um vírus neurotrópico, o vírus da raiva (RABV, revisto por Fooks et al.¹⁷) infecta principalmente os neurônios, usando sua maquinaria de transporte para viajar em direção retrógrada ao longo de axônios do local primário de infecção para o sistema nervoso central (CNS). O protocolo aqui descrito (Figura 1a) permite a detecção e visualização assistida por imunocoloração de células infectadas por rabv e rabv em pilhas de imagens grandes e coerentes obtidas de tecido cerebral infectado. Isso permite uma avaliação de alta resolução 3D imparcial do ambiente de infecção. É aplicável ao tecido cerebral de uma variedade de espécies, pode ser realizada imediatamente após a fixação ou após o armazenamento a longo prazo de amostras em paraformaldeído (PFA), e permite o armazenamento e reimagem de amostras manchadas e limpas por meses.

Protocolo

RABV-Infected, material arquivado PFA-fixo do cérebro foi usado. Os respectivos estudos experimentais em animais foram avaliados pelo Comitê responsável de cuidados, uso e ética do escritório Estadual de agricultura, segurança alimentar e pescaria em Mecklemburgo-Pomerânia Ocidental (LALFF M-V) e obteve aprovação com permissões 7221.3-2.1-002/11 (camundongos) e 7221.3-1-068/16 (furões). Os cuidados gerais e os métodos utilizados nos experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas.

PRECAUÇÃO: Este protocolo utiliza várias substâncias tóxicas e/ou nocivas, incluindo PFA, metanol (MeOH), peróxido de hidrogénio (H₂O₂), azida sódica (NaN₃), TBA, BA, BB e DPE. MeOH e TBA são altamente inflamáveis. Evite a exposição usando equipamentos de proteção individual apropriados (um jaleco, luvas e proteção ocular) e conduzindo experimentos em uma capa de fumaça. Recolher os resíduos separadamente em recipientes apropriados e eliminá-lo de acordo com as regulamentações locais. O vírus da raiva é classificado como um nível de biossegurança (BSL)-2 patógeno e pode, portanto, geralmente ser tratado condições BSL-2. Algumas atividades, incluindo procedimentos que podem gerar aerossóis, trabalhar com altas concentrações de vírus, ou trabalhar com novos lissavírus, podem requerer classificação BSL-3. A profilaxia pré-exposição é recomendada para pessoal de alto risco, incluindo cuidadores de animais e trabalhadores de laboratório^18,19. Consulte os regulamentos da autoridade local.

1. fixação de tecido cerebral e seccionamento

1. Fixar amostras cerebrais num volume adequado de 4% de PFA em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS [pH 7,4]) durante pelo menos 48 h a 4 ° c (com uma relação tecido-a-fixativa aproximada de 1:10 [v/v]).
2. Lave as amostras de tecido 3x em PBS por pelo menos 30 min cada lavagem e armazená-los em 0, 2% NaN₃/PBS a 4 ° c até o uso.
3. Corte o tecido em seções de 1 mm de espessura usando um do (taxa de avanço da lâmina: 0,3 – 0,5 mm/s, amplitude: 1 mm, espessura da fatia: 1.000 μm).
4. Para manter a sequência de fatias correta, armazene cada seção de tecido separadamente em um poço de uma placa de cultura de células multipoços. Adicionar 0, 2% NaN₃/PBS e guarde as secções de tecido a 4 ° c até à utilização.

2. amostra pré-tratamento com metanol

Nota: realize todas as etapas de incubação com oscilação suave e, se não indicado de outra forma, à temperatura ambiente. Proteja as amostras da luz. O pré-tratamento da amostra serve a finalidade geral de melhorar a difusão do anticorpo e de reduzir o autofluorescence do tecido pela exposição ao MeOH e ao H₂o₂, respectivamente¹⁴.

1. Prepare 20% (v/v), 40%, 60%, e 80% MeOH soluções em água destilada. Por exemplo, para 20% MeOH, adicione 10 mL de 100% MeOH a 40 mL de água destilada em uma embarcação selável apropriada e misture invertendo-a.
2. Transfira as amostras para embarcações de tamanho razoável (por exemplo, tubos de reacção de 5 mL). Tome cuidado para usar materiais quimicamente resistentes aos reagentes utilizados neste protocolo. Por exemplo, note que, enquanto o polipropileno é adequado, o poliestireno não é.
   Nota: as especificações de volume neste protocolo referem-se a 5 mL de tubos de reacção. Se for utilizada uma embarcação diferente, ajuste os volumes em conformidade.
3. Incubar as amostras em 4 mL de cada concentração da série preparada de soluções de MeOH em ordem ascendente para 1 h cada.
4. Incubar as amostras 2x por 1 h cada em puro (100%) MeOH.
5. Resfrie as amostras a 4 ° c (por exemplo, em um refrigerador de laboratório seguro).
6. Prepare a solução de branqueamento (5% H₂o₂ em MeOH), por exemplo, diluindo uma solução de stock de 30% h₂O₂ em 1:6 em puro (100%) MeOH, e Chill-lo a 4 ° c.
7. Retire o 100% MeOH das amostras refrigeradas e adicione 4 mL de solução de branqueamento pré-refrigerada (5% H₂O₂ em MeOH). Incubar durante a noite a 4 ° c.
8. Troque a solução clareador por 4 mL de 80% de MeOH e incubar por 1 h. Continue usando a série preparada de soluções de MeOH em ordem decrescente para 1 h cada um até que as amostras foram incubadas por 1 h em 4 mL de 20% MeOH.
9. Lave as amostras 1x por 1 h com 4 mL de PBS.

3. imunocoloração

Nota: realize todas as etapas de incubação com oscilação suave e, se não indicado de outra forma, à temperatura ambiente. Proteja as amostras da luz. Para evitar o crescimento microbiano, adicionar NaN₃ a uma concentração final de 0, 2% para as soluções nesta seção. As amostras de tecido são ainda mais permeabilizadas pelo tratamento com detergentes não iônicos Triton X-100 e Tween 20. O soro normal é usado para bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos. Glicina e heparina são adicionadas para reduzir o fundo de imunolabeling¹⁴.

1. Lave as amostras 2x durante 1 h cada uma em 4 mL de 0,2% Triton X-100/PBS.
2. Permeabilize as amostras por 2 dias a 37 ° c com 4 mL de 0,2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M Glycine/PBS.
3. Bloqueie a ligação inespecífica de anticorpos incubando as amostras durante 2 dias a 37 ° c em 4 mL de 0,2% de soro/PBS normal de Triton X-100/10% DMSO/6%.
   Nota: Use o soro normal da mesma espécie que o anticorpo secundário estêve levantado dentro para conseguir resultados de obstrução ideais.
4. Incubar as amostras em 2 mL de solução de anticorpos primários (3% soro normal/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 com heparina] + anticorpo primário/anticorpos) durante 5 dias a 37 ° c. Atualize a solução de anticorpos primários após 2,5 dias.
   1. Para o PTwH, reconstitua o sal de sódio da heparina em água destilada para fazer uma solução de estoque de 10 mg/mL (armazene esta solução, aliquotados, a 4 ° c). Adicionar a solução de ações para 0,2% Tween 20/PBS a uma concentração final de 10 μg/mL.
      Nota: a escolha da diluição correcta do anticorpo pode necessitar de optimização. Geralmente, as concentrações padrão de Immunohistochemistry são um bom ponto começar.
5. Lave as amostras durante 1 dia em 4 mL de PTwH, trocando o tampão de lavagem pelo menos 4x – 5x durante o curso do dia e deixando a lavagem final durante a noite.
6. Incubar as amostras em 2 mL de solução de anticorpos secundários (3% soro normal/PTwH + anticorpo secundário/anticorpos) durante 5 dias a 37 ° c. Refresque a solução secundária do anticorpo após 2,5 dias.
   1. Diluir o anticorpo secundário/anticorpos em 1:500 na solução de anticorpos secundários (i.e., 4 μL em 2 mL).
7. Lave as amostras durante 1 dia, conforme descrito no passo 3,5, deixando a lavagem final durante a noite.

4. coloração nuclear

Nota: realize todas as etapas de incubação com oscilação suave e, se não indicado de outra forma, à temperatura ambiente. Proteja as amostras da luz. Se nenhuma mancha nuclear é exigida ou o espectro do comprimento de onda/emissão da excitação de a-PRO-3 é exigido para a excitação ou a deteção de um outro fluorophore, salte esta etapa.

1. Diluir a mancha de ácido nucleico para-PRO-3 em 1:1000 em PTwH e incubar as amostras em 4 mL de solução de coloração nuclear por 5 h.
2. Lave as amostras durante 1 dia, conforme descrito no passo 3,5, deixando a lavagem final durante a noite.
   Nota: após as lavagens, as amostras podem ser armazenadas em PBS a 4 ° c até a limpeza óptica.

5. esclarecimento do tecido

Nota: realize todas as etapas de incubação com oscilação suave e, se não indicado de outra forma, à temperatura ambiente. Proteja as amostras da luz. As amostras de tecido são desidratadas em uma série graduada de soluções de TBA. Como a imunocoloração requer soluções aquosas, todos os procedimentos de coloração devem ser terminados antes da limpeza tecidual. O afastamento ótico e a harmonização do índice refração são conseguidos pelo tratamento com uma mistura de Ba, de BB, e de DPE. A solução de compensação é suplementada com DL-α-tocoferol como um antioxidante¹³.

1. Prepare soluções de 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% e 96% de TBA em água destilada. Por exemplo, para 30% TBA, adicione 15 mL de 100% TBA a 35 mL de água destilada em uma embarcação selável apropriada e misture invertendo.
   Nota: o TBA tem um ponto de fusão de 25 – 26 ° c; assim, tende a ser sólido à temperatura ambiente. A fim de preparar as soluções TBA, aqueça o frasco bem selado a 37 ° c em uma incubadora ou banho de água.
2. Desidratar as amostras com 4 mL de cada concentração da série preparada de soluções de TBA em ordem ascendente para 2 h cada. Deixe o 96% TBA durante a noite.
3. Desidrata as amostras mais em puro (100%) TBA para 2 h.
4. Prepare solução de compensação BABB-D15.
   Nota: BABB-D15 é uma combinação de BA e BB (BABB) que é misturado com o DPE em uma relação de x: 1, onde x é especificado no nome da solução, neste caso 15.
   1. Para BABB, misture uma parte BA com duas partes BB.
   2. Misture BABB e DPE em uma proporção de 15:1.
   3. Adicionar 0,4 vol% DL-α-tocoferol (vitamina E).
      Nota: por exemplo, para 20 mL de BABB-D15, misture 6,25 mL de BA com 12,5 mL de BB. Adicionar 1,25 mL de DPE e completá-lo com 0, 8 mL de DL-α-tocoferol.
5. Limpe as amostras na solução de compensação até que sejam opticamente transparentes (2 – 6 h).
6. As amostras podem ser armazenadas a 4 ° c em BABB-D15, protegidas da luz, até a montagem e a imagem.

6. montagem da amostra

1. Usando uma impressora 3D, imprima a câmara de imagem e a tampa (material: copoliéster [CPE], bocal: 0,25 mm, altura da camada: 0, 6 mm, espessura da parede: 0,88 mm, contagem de parede: 4, infill: 100%, sem estrutura de suporte; o correspondente. O arquivo STL pode ser encontrado nos materiais suplementares deste protocolo).
2. Montar a câmara de imagem (Figura 2).
   1. Monte um lamela redondo (diâmetro: 30 milímetros) na câmara da imagem latente com RTV-1 (um-componente quarto-temperatura-vulcanizing) borracha de silicone. Retire o excesso de borracha de silicone com um cotonete de algodão molhado e Cure durante a noite.
   2. Montar uma lamínula redonda (diâmetro: 22 mm) na tampa com borracha de silicone RTV-1. Retire o excesso de borracha de silicone com um cotonete de algodão molhado e Cure durante a noite.
3. Coloque a amostra em uma câmara de imagem, adicione um pequeno volume de BABB-D15 e insira a tampa. Encha a câmara com BABB-D15 através da entrada, usando uma agulha hipodérmica (27 G x 3/4 polegada [0,40 mm x 20 mm]).
4. Ligue a entrada e sele a câmara de imagem com borracha de silicone RTV-1. Cure durante a noite no escuro.

7. processamento de imagens e imagens

1. Configure a aquisição da imagem selecionando as respectivas linhas de laser para corresponder aos fluoróforos utilizados. Ajuste os intervalos de detecção de cada detector para evitar a sobreposição do sinal entre os canais.
   Nota: intervalos de detecção exemplares para Alexa fluor 488, Alexa fluor 568 e TO-PRO-3 são 500 – 550 nm, 590 – 620 nm e 645 – 700 nm, respectivamente.
2. Escolha os parâmetros de aquisição, defina a borda superior e inferior da pilha z e adquira a pilha de imagens.
   Nota: os parâmetros de aquisição exemplares são uma verificação sequencial com um tamanho de pixel de 60-90 nm, um tamanho z-Step de 0,5 μm, uma média de linha de 1, uma velocidade de digitalização de 400 Hz e um tamanho de furo de pino de 1 unidade arejada.
3. Processe a pilha de imagens usando um software de análise de imagem apropriado (por exemplo, Fiji) para gerar projeções 3D ou realizar análises aprofundadas.
   Observação: devido ao tamanho grande dos arquivos de imagem adquiridos, o uso de uma estação de trabalho geralmente é necessário.
   1. Abra o arquivo de aquisição ou imagem (s) em Fiji (File | Aberto | Selecionar arquivos).
      1. Se estiver usando, por exemplo,. Arquivos LIF, selecione ou desmarque as opções desejadas na janela de diálogo bio-formats. Exibir pilha com hyperstack. Além disso, não são necessárias seleções ou Ticks específicos. Prima OK.
      2. Se o arquivo contiver várias pilhas de imagens, selecione as que serão analisadas e confirme pressionando OK.
   2. Realize correção de lixívia dividindo a imagem mesclada em canais individuais (Image | Cor | Channels Toole, em seguida, selecione mais | Canais divididos). Para cada canal, selecione correção de lixívia (Image | ADJUST | Correção de lixívia) e escolha a relação simples (intensidade do fundo: 0,0).
      Nota: em alguns casos, por exemplo, quando não há nenhuma deterioração linear do sinal ou o sinal é demasiado fraco total, a relação simples pode falhar. Alternativamente, tente ajuste exponencial ou pule a correção de lixívia.
   3. Ajuste o brilho e o contraste para cada canal usando os controles deslizantes (Image | Ajustar o ajuste | Brilho | Contraste).
   4. Mesclar os canais (imagem | Cor | Mesclar canais), faça uma composição (imagem | Color | Channels Toole, em seguida, selecione mais | Fazer Composite), e convertê-lo para o formato RGB (Image | Color | Channels Toole, em seguida, selecione mais | Converta para RGB).
   5. Se necessário, redimensione a pilha de imagens para reduzir o tempo de computação e o tamanho do arquivo (Image | ADJUST | Tamanho, ambas as opções assinalada mais bilinear interpolação).
   6. Gerar uma projeção 3D (Image | Stacks | projeto 3D). Escolha o ponto mais brilhante como método de projeção e defina o espaçamento da fatia para corresponder ao tamanho da etapa z da pilha de imagens adquirida. Para obter a máxima qualidade, defina o incremento do ângulo de rotação para 1 e habilite a interpolação. Modifique a rotação total, os limites de transparência e a opacidade conforme necessário.
   7. Se necessário, reajustar o contraste e o brilho convertendo a projeção 3D de volta para o formato de 8 bits (Image | Tipo | 8 bits). Use os respectivos controles deslizantes (Image | ADJUST | Brilho | Contraste) e reconverter a pilha de imagens para o formato RGB conforme descrito na etapa 7.3.4.
   8. Salve a projeção 3D como. TIF arquivo (formato de arquivo de imagem) e. Arquivo AVI (formato de arquivo de vídeo).

Resultados

A combinação de idisco¹⁴ e de udisco¹³ acoplada com o CLSM de alta resolução fornece introspecções profundas na definição e na plasticidade armazenamento da infecção de rabv do tecido de cérebro e do contexto celular circunvizinho.

Usando imunocoloração da fosfoproteína RABV (P), camadas complexas de células neuronais infectadas podem ser visualizadas em cortes grossos de cérebros de camundongo (Figura 3). Subseqüent...

Discussão

O ressurgimento e o desenvolvimento de técnicas de compensação tecidual nos últimos anos^{2,3,4,5,6,7,8, 9} anos de ^{, 10} de ^{, 11} anos de ^{, 12 anos} de ^...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
Álcool benzílico	Alfa Aesar	41218	Reagente de limpeza
Benzoato de benzila	Sigma-Aldrich	BB6630-500ML	Reagente de limpeza
Dimetilsulfóxido Carl	Roth	4720.2	Vários tampões
Éter difenílico	Sigma-Aldrich	240834-100G	Reagente de limpeza
DL-&alfa;-Tocoferol	Alfa Aesar	A17039	Soro antioxidante
de burro	Bio-Rad	C06SBZ	Reagente bloqueador
Glicina Carl	Roth	3908.2	Redução de fundo
Soro de cabra	Merck	S26-100ML	Reagente bloqueador
Sal de heparina sódica	Carl Roth	7692.1Fundo	redução
Solução de peróxido de hidrogênio (30%)	Carl Roth	8070.2	Branqueamento de amostras
de metanol	Carl Roth	4627.4	Pré-tratamento de amostras
Paraformaldeído	Carl	Roth 0335.3	Pó cristalino para fazer solução fixadora
Azida de sódio	Carl Roth	K305.1	Prevenção do crescimento microbiano em soluções
de estoqueterc-Butanol	Alfa Aesar	33278	Desidratação de amostra para limpeza de tecidos
TO-PRO-3	Thermo Fisher	T3605	Mancha de ácido nucleico
Triton X-100	Carl Roth	3051.2	Detergente
Tween 20	AppliChem	A4974,0500
DetergenteDiversos
5 mL reação tubos	Eppendorf	0030119401	Tubos de amostra
Lamínula, circular (diâmetro: 22 mm)	Marienfeld	0111620	Parte da câmara de imagem
Lamínula, circular (diâmetro: 30 mm)	Marienfeld	0111700	Parte da câmara de imagem
Agulha hipodérmica (27 G x ¾ ” [0,40 mm x 20 mm])	B. Braun	4657705	Enchimento da câmara de imagem com solução de limpeza
RTV-1 borracha de silicone Wacker		Elastosil E43	Adesivo para a montagem da câmara de imagem
Ultimaker CPE 2,85 mm transparente	Ultimaker	8718836374869	Filamento de copoliéster para impressora 3D para impressão de peças da câmara de imagem
Equipamento técnico e software
Impressora 3D	Ultimaker	Ultimaker 2+	Impressão da câmara de imagem
Sistema automatizado de imersão em água	Leica	15640019	Bomba de água controlada por software
Agitador orbital de bancada	Elmi	DOS-20M	Incubação de amostras à temperatura ambiente (~ 150 rpm)
Agitador orbital de bancada, aquecido	New Brunswick Scientific	G24 Incubação de amostra de agitador ambiental	a 37 & C (~ 150 rpm)
Microscópio confocal de varredura a laser	Leica	DMI 6000 TCS SP5	Microscópio confocal invertido para imagem de amostra
Fiji	NIH (ImageJ)	software de código aberto (v1.52h)	Pacote de processamento de imagem baseado em ImageJ
Objetiva de imersão em água de longa distância de trabalho	Leica	15506360	HC PL APO 40x/1,10 W motCORR CS2
Vibratome	Leica	VT1200S	Estação de trabalho de fatiamento
	de amostra Dell	Precision 7920	CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB SSD DDR4 de 2666 MHz: 2 TB
forte>Anticorpos primários
Cabra anti-RABV N	Friedrich-Loeffler-Institut		Soro N anti-RABV policlonal monoespecífico de cabras, gerado por imunização de cabras com nucleoproteína N de RABV expressa por baculovírus e purificada por His-tag Diluição: 1:400
Coelho anti-GFAP	Dako	Z0334	Anticorpo policlonal (RRID:AB_10013382) Diluição: 1:100
Coelho anti-MAP2	Abcam	ab32454	Anticorpo policlonal (RRID:AB_776174) Diluição: 1:250
Coelho anti-RABV P 160-5	Friedrich-Loeffler-Institut		Soro policlonal monoespecífico anti-RABV P de coelho, gerado pela imunização de coelhos com fosfoproteína P RABV purificada por baculovírus e purificada por His-tag (ver referência 23: Orbanz et al., 2010) Diluição: 1:1.000
Anticorpos secundários
Antígono anti-cabra IgG	Thermo Fisher Scientific	dependendo do conjugado fluoróforo	Altamente absorvido Diluição: 1:500
IgG anti-rato de burro	Thermo Fisher Scientific	dependendo do fluoróforo conjugado	Altamente absorvido Diluição: 1:500
IgG anti-coelho de burro	Thermo Fisher Scientific	dependendo do fluoróforo conjugado	Altamente absorvido Diluição: 1:500
IgG anti-rato de cabra	Thermo Fisher Científico	dependendo do fluoróforo conjugado	Altamente absorvido Diluição: 1:500
IgG anti-coelho de cabra	Thermo Fisher Científico	dependendo do fluoróforo conjugado	Altamente absorvido cruzado Diluição: 1:500