Imagem latente 3D de alta resolução da infecção do vírus da raiva no tecido solvente-cancelado do cérebro

Luca Zaeck; Madlin Potratz; Conrad  M. Freuling; Thomas Müller; Stefan Finke

doi:10.3791/59402

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Artigo de método

Imagem latente 3D de alta resolução da infecção do vírus da raiva no tecido solvente-cancelado do cérebro

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DOI:

10.3791/59402

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30 de abril de 2019

Luca Zaeck¹ , Madlin Potratz¹ , Conrad M. Freuling¹ , Thomas Müller¹ , Stefan Finke¹

¹Institute of Molecular Virology and Cell Biology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health

Neste artigo

Resumo

Novel, técnicas de compensação de tecido compatível com imunocoloração, como a imagem 3D final de órgãos com solventes limpos, permitem a visualização 3D da infecção cerebral pelo vírus da raiva e seu ambiente celular complexo. As fatias grossas, anticorpo-etiquetadas do tecido de cérebro são feitas opticamente transparentes para aumentar a profundidade da imagem latente e para permitir a análise 3D pela microscopia confocal da exploração do laser.

Resumo

A visualização de processos de infecção em tecidos e órgãos por imunolabeling é um método-chave na biologia da infecção moderna. A capacidade de observar e estudar a distribuição, tropismo e abundância de patógenos dentro de tecidos de órgãos fornece dados cruciais sobre o desenvolvimento e progressão da doença. Usando métodos convencionais da microscopia, Immunolabeling é restringido na maior parte às seções finas obtidas das amostras parafina-encaixadas ou congeladas. No entanto, o plano de imagem 2D limitado dessas seções finas pode levar à perda de informações cruciais sobre a estrutura complexa de um órgão infectado e o contexto celular da infecção. As técnicas multicolor, immunomancha-compatíveis modernas do esclarecimento do tecido fornecem agora uma maneira relativamente rápida e barata de estudar pilhas de imagem 3D high-volume do tecido vírus-contaminado do órgão. Ao expor o tecido a solventes orgânicos, torna-se opticamente transparente. Isso corresponde aos índices de refração da amostra e, eventualmente, leva a uma redução significativa do espalhamento de luz. Assim, em combinação com os objetivos livres longos da distância de trabalho, as grandes seções do tecido até 1 milímetro no tamanho podem ser imaged pela microscopia confocal convencional da exploração do laser (CLSM) na alta resolução. Aqui, nós descrevemos um protocolo para aplicar a imagem latente do profundo-tecido após o esclarecimento do tecido para visualizar a distribuição do vírus de raiva em cérebros contaminados a fim estudar tópicos como a patogénese, a propagação, o tropism, e o neuroinvasion do vírus.

Introdução

As técnicas convencionais da histologia confiam na maior parte em seções finas de tecidos do órgão, que podem inerentemente fornecer somente introspecções 2D em um ambiente 3D complexo. Embora viável, em princípio, a reconstrução 3D de seções finas seriais exige condutas técnicas exigentes para fatiar e subsequente no alinhamento silico das imagens adquiridas¹. Além disso, a reconstrução sem emenda de z-volumes depois que fatiar do micrótomo é crítica porque os artefatos mecânicos e computacionais podem remanescer por causa do registo suboptimal da imagem causado por planos nonsobrepor da imagem, por variações da mancha, e por física destruição....