Avaliação da reserva de fluxo coronariano após reperfusão de isquemia miocárdica em ratos

Resumo

A reserva de fluxo coronariano (CFR) é definida como a razão do fluxo sanguíneo coronariano máximo para o fluxo sanguíneo coronariano em repouso. Apresentamos um protocolo de avaliação do CFR em ratos via ultrassonografia, que oferece a oportunidade de prever fatores de risco cardiovasculares na ausência de doença coronariana obstrutiva.

Resumo

A doença arterial coronariana é a principal causa de morte em todo o mundo. Após infarto agudo do miocárdio, a intervenção miocárdica precoce e bem-sucedida via recanalização da artéria coronária é a estratégia mais efetiva para a redução do tamanho do miocárdio isquêmico. A microvasculatura coronária não pode ser visualizada e imaged in vivo, mas existem várias técnicas invasivas e não invasivas que podem ser utilizadas para avaliar parâmetros que dependem diretamente da função microvascular coronariana. A função endotelial após a reperfusão de isquemia pode ser avaliada também ao nível da circulação coronária através da reserva de fluxo coronariano (CFR). Neste estudo, a velocidade de pico das artérias coronárias de descida anterior esquerda (LAD) foi mensurada em ratos in vivo via ecocardiografia transtorácica Doppler durante o desafio de repouso e estresse (induzido pela Dobutamina). Um coração normal pode aumentar o seu fluxo sanguíneo coronariano até quatro vezes acima dos valores de repouso durante a indução do stress. Após a reperfusão da isquemia, nós encontramos um CFR significativamente diminuído, que possa ser usado como um marcador da deficiência orgânica microvascular coronária. O CFR abriu uma janela sobre a importância da disfunção microvascular e demonstrou prever o risco cardiovascular independentemente de a doença obstrutiva grave estar presente.

Introdução

A reperfusão de isquemia miocárdica (IR) é uma condição em que o suprimento sanguíneo é restrito ao coração, seguido da restauração da perfusão e da reavaliação simultânea¹. A oclusão das artérias coronárias pode ser causada por uma ruptura da placa do êmbolo ou do colesterol, que resulte em um desequilíbrio severo da fonte e da demanda metabólicas, causando a hipóxia do tecido. O salvamento do miocárdio comprometido, melhora a função ventricular esquerda, e aumenta a sobrevivência nos pacientes com infarction miocárdico agudo foram observados pela terapia do reperfusão. Entretanto, após a recanalização da artéria coronária, anormalidades funcionais de pequenos vasos coronarianos podem ocorrer^2,3,4,5. Uma proporção significativa de pacientes, talvez até 40%, não recupera a perfusão microvascular e miocárdica, apesar da restauração do fluxo coronariano. A visualização e a avaliação da microvasculatura coronária podem ser difíceis in vivo, mas há um número de técnicas invasoras e não invasoras que podem ser usadas para avaliar diretamente parâmetros dependendo da função microvascular coronária^{6 ,7}. Além disso, a função endotelial pode ser avaliada ao nível da circulação coronária através do CFR⁵.

A Ecocardiografia transtorácica Doppler é uma ferramenta não invasiva que nos permite estudar a velocidade de fluxo da artéria coronária e CFR⁵. O CFR representa a razão do fluxo sanguíneo coronariano máximo para o fluxo sanguíneo coronariano em repouso⁸. Durante o desafio de stress, um coração normal aumenta o fluxo sanguíneo coronariano até quatro vezes acima do valor de repouso. O risco cardiovascular aumenta quando o CFR é diminuído⁹. Ishihara et al mostraram que o CFR foi severamente prejudicado imediatamente após a angioplastia coronariana⁵. Na ausência de estenose da artéria coronária, o CFR diminui durante a disfunção microvascular coronariana e está presente em cerca de metade dos pacientes com doença arterial coronariana estável¹⁰.

O objetivo geral deste método é a visualização não invasiva da função da artéria coronária descendente anterior (LAD) em ratos via ecocardiografia, que pode ser utilizada para o cálculo do QCR. Isto oferece uma ferramenta importante da avaliação para diagnosticar a deficiência orgânica microvascular e avaliar tratamentos terapêuticos potenciais.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Louisville (IACUC-protocolo aprovado 18223) e o guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório¹¹.

1. os animais

1. Use 4-month-old fêmeas Fisher 344 ratos (BW ~ 150-180 g) para o estudo.

2. imagem latente do ultra-som antes da cirurgia do IR

1. Anestesie o rato com câmara de indução de isoflurano a 5% com 1,5 – 2,0 L/min O₂ fluxo seguido de 1,5 – 2,0% com 1,5 – 2,0 L/min o₂ Flow. Esta anestesia é mantida durante todo o experimento, durante os estágios de repouso e estresse.
2. Coloque o animal em uma posição supina e raspar o tórax. Mantenha a temperatura do corpo a 37-38 ° c usando a plataforma de aquecimento incorporada. Monitore a frequência cardíaca usando o software.
   Nota: a anestesia adequada é crucial para manter a frequência cardíaca a taxas fisiológicas normais (entre 295-350 batimentos/min).
3. Aplique a pomada do veterinário oftálmica para impedir o secura dos olhos antes da imagem latente.
4. Realize ecocardiografia usando sonda linear de 13 – 24 MHz (por exemplo, MS250) (Figura 1a).
5. Coloque o animal na posição supina na plataforma aquecida. Assegure-se de que a anestesia é controlada através do cone do nariz. Em seguida, posicione a sonda para obter a visão de eixo curto paraesternal (PSAX) usando o sistema ferroviário (Figura 1b).
6. Movendo a sonda na direção rostral do PSAX, localize a artéria pulmonar (Figura 1b).
7. Mova a sonda levemente na direção caudal da artéria pulmonar para ver o LAD e armazene a imagem.
   Nota: o LAD é difícil de encontrar sem Doppler de cor, assim que as imagens do B-modo do LAD não são sempre possíveis.
8. Quando as diferenças individuais dificultam a localização da artéria coronária LAD, siga a técnica mencionada abaixo:
   1. Mova a sonda lateral para a artéria pulmonar.
   2. Ângulo da plataforma de modo que o animal é inclinado, invertido, ou ligeiramente para o lado direito para que o ventrículo esquerdo é mais prontamente visível com a sonda.
9. Uma vez que a imagem no modo B é capturada ou Cine-armazenada, clique no Doppler colorido na tela sensível ao toque (Figura 1C). Visualize a artéria coronária (seta branca indica LAD) no eixo curto (Figura 1C). A cor vermelha, como visto em tempo real, é indicativa da direção do fluxo (ou seja, o fluxo sanguíneo é para a sonda).
10. Depois de Visualizar LAD em um modo Color-Doppler, mude o modo para o modo de onda de pulso (PW). Procure a presença de uma linha indicadora amarela na artéria coronária (Figura 2a).
11. Coloque a linha PW amarela no meio da artéria coronária. Assegure-se de que o ângulo esteja paralelo à direção do fluxo.
    Nota: a velocidade do fluxo é altamente dependente do ângulo da linha PW, por isso não se esqueça de corresponder ao ângulo da sonda na tela com o ângulo do LAD. Use a tela sensível ao toque para ajustar o ângulo; O ângulo PW deve ser inferior a 60 °.
12. Use a loja Cine para captar a velocidade do fluxo coronariano de repouso do Lad na diástole de pico como formas de onda (Figura 2b).
13. Após a obtenção da velocidade de fluxo do LAD do descanso, meça a velocidade máxima do fluxo de LAD durante o esforço para calcular o CFR. Para medir a velocidade máxima de fluxo durante o estresse, inutilizar dobutamina em uma dose de 20 μg/kg/min via veia cauda⁸ (Figura 2C).
    Nota: a perfusão de dobutamina não deve ser superior a 8 min. Use uma bomba de infusão e ajuste o diâmetro da bomba de infusão para 14,43 para a seringa de BD 10 mL.
    1. Use a borboleta da infusão de 25 G ajustada para o cannulation da veia de cauda. Para colocar a agulha de infusão, coloque uma pequena faixa de gaze em torno da base da cauda do rato, em seguida, agarrar com hemostats e torcer o torniquete para aplicar a pressão e fazer com que a veia para ampliar.
    2. Coloque a agulha enquanto estiver directamente ligada à seringa de dobutamina.
       Nota: Tome o cuidado extra para não introduzir acidentalmente a medicina ao elaborar o sangue para assegurar a colocação apropriada da agulha na veia de cauda. Além disso, certifique-se de evitar a introdução de uma bolha de ar na veia, como uma embolia pode ser fatal para o animal.
    3. Uma vez que a agulha é colocada, estabilizá-lo com uma cola e um pedaço de fita cirúrgica, fixando a linha de infusão para a cauda.
    4. Remova os hemostats e o torniquete para recuperar o fluxo.
    5. Coloque a seringa de dobutamina na bomba de perfusão e coloque-a para injetar 20 μg/kg/min.
    6. Durante a infusão de dobutamina, monitore cuidadosamente o pico do LAD e a frequência cardíaca. Registre periodicamente os picos de LAD PW no modo Doppler, especialmente quando ele aumenta em resposta à dobutamina.
       Nota: o desafio de stress induzido pela Dobutamina provoca o coração a trabalhar mais; isso muitas vezes resulta no movimento do coração e do LAD. Esteja preparado para mover o animal, a sonda, ou ambos, a fim de manter o LAD em vista.
    7. Depois que os picos de LAD e a freqüência cardíaca plateaued durante o desafio, param a infusão do dobutamine, removem o jogo da infusão da veia de cauda e removem o animal da plataforma. Permita que o animal recupere em sua gaiola Home.
14. Selecione a ferramenta Peak vel para obter as velocidades diastólicas máximas das imagens mostradas na Figura 2b e C.
15. Calcule o índice de CFR como a razão da velocidade de fluxo diastólico de pico de estresse do LAD (dobutamina) para a velocidade de fluxo diastólico de pico do LAD em repouso (Figura 2a).

3. lesão de reperfusão de isquemia

1. Anestesiado rato com câmara de indução isoflurano a 5% com 1,5 – 2,0 L/min O₂ fluxo seguido de 1,5 – 2,0% com 1,5 – 2,0 L/min o₂ Flow.
2. Confirme a profundidade da anestesia pela falta do reflexo de retirada do pedal. Use pomada veterinária oftalfólica sobre os olhos para evitar a secura. Mantenha a temperatura corporal adequada de 37-38 ° c usando uma almofada de aquecimento ou um controlador de temperatura animal.
3. Administrar o Meloxicam pré-cirúrgico, 5 mg/kg por via intramuscular, 15 min antes da cirurgia, seguido de 2 mL de bolus subcutâneo de 0,9% de soro fisiológico para prevenir a desidratação durante a cirurgia. Foram utilizadas luvas e instrumentos estéreis e empregadas técnicas assépticas. Usando a fonte luminosa da fibra óptica, o rato do entubar usando o cateter do calibre 18 IV e conecta ao ventilador.
4. Ligate LAD usando 8-0 sutura do monofilamento com a abertura de 15 milímetros no 5^th espaço intercostal. Amarre um nó liso e deixe por 30 min. Confirme visualmente a isquemia em todos os ratos através da descoloração da superfície do coração¹². Libere a ligadura após 30 min e verifique a reperfusão pelo avermelhamento da área previamente descolorida do músculo cardíaco por 1-2 min¹².
5. Feche a caixa torácica usando 4-0 sutura absorvível com um padrão de sutura interrompida, em seguida, feche a pele usando 5-0 sutura de seda não absorvível com padrão de sutura contínua.
6. Retire o animal da anestesia. Permita que o animal recupere na gaiola Home. 5mg/kg o Meloxicam foi injetado por via intramuscular a cada 24 horas antes da eutanização do animal (72horas após a cirurgia).

4. imagem latente do ultra-som após a cirurgia do IR

1. 72 h após a cirurgia de IR, medir o fluxo coronariano e CFR novamente. Compare as medições antes das medições do IR. Repita as etapas 2,1 a 2,15 conforme descrito acima.

Resultados

Para este estudo, foram utilizados 12 ratos fêmeas Fisher 344. Nós executamos um teste de esforço com dobutamine e medimos a velocidade da artéria coronária de LAD antes e 72 horas após a cirurgia do IR. Antes da cirurgia do IR, a velocidade de repouso da artéria coronária de LAD foi medida como 423 ± 59 milímetros/s, que foi aumentada após a infusão do dobutamine (1005 ± 77mm/s) (Figura 3a). Após 72 h de reperfusão de isquemia, a velocidade da artéria coroná...

Discussão

Os principais achados do presente estudo são que o IR aumenta a velocidade da artéria coronária em repouso e prejudica a CFR, mesmo na ausência de qualquer estenose angiográfica residual.

Compreender a fisiologia coronária é uma parte essencial da tomada de decisão clínica para que os cardiologistas tratem a doença arterial coronariana. O CFR é um dos importantes parâmetros funcionais na compreensão da fisiopatologia da microcirculação coronariana⁷

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 10 mL	BD Seringa	302995
250S 13– Sonda linear de 24 MHz	FUJIFILM VisualSonics Inc
Cloridrato de dobutamina	Sigma	D0676-10mg
Isoflurano	RRC	27376
Legato 100 Bomba de seringa	KD Scientific	788100
Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics Inc
Conjunto de infusão com asas, 27G x 1/2",	Medline.com

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