Análise do desenvolvimento de câmara cardíaca durante a embriogênese de rato usando toda montagem de epifluorescência

Resumo

Apresentamos os protocolos para examinar o desenvolvimento de coração de rato usando microscopia epifluorescente de montagem toda em embriões de rato dissecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato repórter bater-em ratos. Este método nos permite visualizar diretamente a cada estágio da formação ventricular durante o desenvolvimento de coração de rato sem métodos histoquímicos trabalho intensivos.

Resumo

O objetivo do presente protocolo é descrever um método para a dissecção de embriões do rato e visualização das câmaras ventriculares rato embrionária durante o desenvolvimento do coração usando ventricular repórter fluorescentes específicos bater-nos ratos (os ratos MLC-2v-tdTomato). Desenvolvimento do coração envolve uma formação de tubo linear de coração, o tubo de coração loop e quatro septation de câmara. Esses processos complexos são altamente conservados em todos os vertebrados. O coração embrionário de rato tem sido amplamente utilizado para estudos do desenvolvimento de coração. No entanto, devido ao seu tamanho extremamente pequeno, dissecar corações embrionárias de rato é tecnicamente desafiador. Além disso, visualização da formação de câmara cardíaca muitas vezes precisa de hibridação in situ, beta-galactosidase coloração usando ratos de repórter LacZ, ou imunocoloração de corações embrionárias seccionadas. Aqui, descrevemos como dissecar corações embrionárias de rato e Visualizar diretamente a formação de câmara ventricular de MLC-2v-tdTomato ratos usando microscopia epifluorescente todo de montagem. Com este método, é possível examinar diretamente a formação do tubo cardíaco e loop, em formação de câmara quatro sem mais experimental manipulação de embriões do rato. Embora a linha de bater-no rato repórter MLC-2v-tdTomato é usada no presente protocolo como um exemplo, este protocolo pode ser aplicado a outras linhas de rato transgénico repórter fluorescentes específicos do coração.

Introdução

Formação de câmara durante o desenvolvimento do coração é um complexo processo de transição através de vários estágios embrionários morfologicamente distintas^1,2. A forma crescente de progenitoras cardíacas de população forma um tubo linear de coração e então sofre alongamento e looping para formar a forma espiral do coração em desenvolvimento. Após seu processo de septation, o coração em desenvolvimento é transformado em coração de quatro câmaras. Interrupção de qualquer um destes processos resulta em defeitos cardíacos do desenvolvimento. Assim, é importante compreender os mecanismos moleculares subjacentes ....

Protocolo

Todos os procedimentos de animais foram realizados com a aprovação do Comité de uso e Vanderbilt University Medical Center institucional Animal Care.

1. colheita de embriões e dissecação de rato

1. Companheiro de 8-10 semanas MLC-2v-tdTomato^{+ /-} ratos fêmeas com 8-10 semanas MLC-2v-tdTomato^{+ /-} ratos masculinos para obter MLC-2v-tdTomato^{+ +}, MLC-2v-tdTomato^{+ /-} e MLC-2v-tdTomato^{- / -} embriões.
2. Verifique as barragens para plugues vaginais todas as manhãs. Meio-dia o dia da deteção de plug vaginal é considerado como E0.5.
   Nota: O exame Vaginal para detectar um plug vag....

Resultados

Durante o desenvolvimento do coração, MLC-2v é considerado o mais antigo marcador para câmara ventricular especificação¹⁷. Conforme representado na Figura 1, podemos dissecados fora toda embriões do rato e corações embrionárias de MLC-2v-tdTomato repórter bater-em ratos e examinado MLC-2v-tdTomato expressão de repórter durante o desenvolvimento do coração. No MLC-2v-tdTomato repórter bater-em camundongos, expressão constitutiva tdTomat.......

Discussão

O método descrito aqui é relativamente simples para examinar o desenvolvimento da câmara ventricular, sem realizar experimentos trabalhosos para rotular ventriculares ou cardíaco-específico genes estruturais ou proteínas. Assim, este método minimiza variabilities técnicas que eram frequentemente encontrados nas seções de coração immunostained.

Há duas etapas críticas para executar com êxito este método, incluindo a estimativa precisa da idade embrionária de camundongos e dissecação do coração .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
microscópio de dissecação	Leica	MZ125
escada de DNA (100 bp)	Promega	G2101
	Leica	M165 FC
GoTaq Green master Mix	Promega	M712
máquina de PCR (master cycler)	Eppendorf	6336000023

Microscópio de dissecação de epifluorescência