Method Article

Análise do desenvolvimento de câmara cardíaca durante a embriogênese de rato usando toda montagem de epifluorescência

DOI:

10.3791/59413

April 17th, 2019

In This Article

Summary

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Apresentamos os protocolos para examinar o desenvolvimento de coração de rato usando microscopia epifluorescente de montagem toda em embriões de rato dissecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato repórter bater-em ratos. Este método nos permite visualizar diretamente a cada estágio da formação ventricular durante o desenvolvimento de coração de rato sem métodos histoquímicos trabalho intensivos.

Abstract

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O objetivo do presente protocolo é descrever um método para a dissecção de embriões do rato e visualização das câmaras ventriculares rato embrionária durante o desenvolvimento do coração usando ventricular repórter fluorescentes específicos bater-nos ratos (os ratos MLC-2v-tdTomato). Desenvolvimento do coração envolve uma formação de tubo linear de coração, o tubo de coração loop e quatro septation de câmara. Esses processos complexos são altamente conservados em todos os vertebrados. O coração embrionário de rato tem sido amplamente utilizado para estudos do desenvolvimento de coração. No entanto, devido ao seu tamanho extremamente pequeno, dissecar corações embrionárias de rato é tecnicamente desafiador. Além disso, visualização da formação de câmara cardíaca muitas vezes precisa de hibridação in situ, beta-galactosidase coloração usando ratos de repórter LacZ, ou imunocoloração de corações embrionárias seccionadas. Aqui, descrevemos como dissecar corações embrionárias de rato e Visualizar diretamente a formação de câmara ventricular de MLC-2v-tdTomato ratos usando microscopia epifluorescente todo de montagem. Com este método, é possível examinar diretamente a formação do tubo cardíaco e loop, em formação de câmara quatro sem mais experimental manipulação de embriões do rato. Embora a linha de bater-no rato repórter MLC-2v-tdTomato é usada no presente protocolo como um exemplo, este protocolo pode ser aplicado a outras linhas de rato transgénico repórter fluorescentes específicos do coração.

Introduction

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Formação de câmara durante o desenvolvimento do coração é um complexo processo de transição através de vários estágios embrionários morfologicamente distintas1,2. A forma crescente de progenitoras cardíacas de população forma um tubo linear de coração e então sofre alongamento e looping para formar a forma espiral do coração em desenvolvimento. Após seu processo de septation, o coração em desenvolvimento é transformado em coração de quatro câmaras. Interrupção de qualquer um destes processos resulta em defeitos cardíacos do desenvolvimento. Assim, é importante compreender os mecanismos moleculares subjacentes ....

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Protocol

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Todos os procedimentos de animais foram realizados com a aprovação do Comité de uso e Vanderbilt University Medical Center institucional Animal Care.

1. colheita de embriões e dissecação de rato

  1. Companheiro de 8-10 semanas MLC-2v-tdTomato+ /- ratos fêmeas com 8-10 semanas MLC-2v-tdTomato+ /- ratos masculinos para obter MLC-2v-tdTomato+ +, MLC-2v-tdTomato+ /- e MLC-2v-tdTomato- / - embriões.
  2. Verifique as barragens para plugues vaginais todas as manhãs. Meio-dia o dia da deteção de plug vaginal é considerado como E0.5.
    Nota: O exame Vaginal para detectar um plug vag....

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Results

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Durante o desenvolvimento do coração, MLC-2v é considerado o mais antigo marcador para câmara ventricular especificação17. Conforme representado na Figura 1, podemos dissecados fora toda embriões do rato e corações embrionárias de MLC-2v-tdTomato repórter bater-em ratos e examinado MLC-2v-tdTomato expressão de repórter durante o desenvolvimento do coração. No MLC-2v-tdTomato repórter bater-em camundongos, expressão constitutiva tdTomat.......

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Discussion

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O método descrito aqui é relativamente simples para examinar o desenvolvimento da câmara ventricular, sem realizar experimentos trabalhosos para rotular ventriculares ou cardíaco-específico genes estruturais ou proteínas. Assim, este método minimiza variabilities técnicas que eram frequentemente encontrados nas seções de coração immunostained.

Há duas etapas críticas para executar com êxito este método, incluindo a estimativa precisa da idade embrionária de camundongos e dissecação do coração .......

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Disclosures

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Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

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Este trabalho foi financiado pelo NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) e Gilead Sciences Research Scholar programa (Y.-J. N).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
microscópio de dissecaçãoLeicaMZ125
escada de DNA (100 bp)PromegaG2101
LeicaM165 FC
GoTaq Green master MixPromegaM712
máquina de PCR (master cycler)Eppendorf6336000023
Microscópio de dissecação de epifluorescência

References

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  1. Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
  2. Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).
  3. ....

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Mouse Embryonic Heart DissectionWhole Mount EpifluorescenceMLC 2v tdTomato ReporterHeart Tube FormationChamber SeptationEmbryo GenotypingFluorescent MicroscopyCardiac Chamber DevelopmentMouse EmbryogenesisVentricular Chamber Visualization

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