Para reproducibly contar os números dos mRNAs em oócitos individuais, fluorescência única molécula de RNA in situ hibridação (RNA-FISH) foi otimizada para células não-aderentes. Oócitos foram coletados, hibridizados com sondas específicas transcrição e quantificados usando um software de quantificação de imagem.
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Artigo de método
Uso de uma única molécula fluorescente hibridação In Situ (FISH-SM) para Quantify e Localize os mRNAs em oócitos murino
Neste artigo
Resumo
Resumo
Métodos atuais rotineiramente usados para quantificar o mRNA de oócitos e embriões incluem digital polimerase transcrição reversa reação em cadeia (dPCR), quantitativo, real-time RT-PCR (RT-qPCR) e sequenciação do ARN. Quando estas técnicas são realizadas usando um único oócito ou embrião, baixo-cópia mRNAs confiável não são detectados. Para superar este problema, oócitos ou embriões podem ser agrupados para análise; no entanto, isso muitas vezes leva a alta variabilidade entre as amostras. Neste protocolo, descrevemos o uso da fluorescência hibridação in situ (FISH) usando química de DNA ramificada. Esta técnica identifica o padrão espacial dos mRNAs em células individuais. Quando a técnica está associada a encontrar o local e software de computador de rastreamento, a abundância de mRNAs na célula também pode ser quantificada. Usando esta técnica, há reduzida variabilidade dentro de um grupo experimental e menos oócitos e embriões são necessários para detectar diferenças significativas entre os grupos experimentais. Comercialmente disponível DNA ramificado SM-kits de peixes foram otimizados para detectar mRNAs em secionado tecidos ou células aderentes em slides. No entanto, oócitos efetivamente não adere aos slides e alguns reagentes do kit foram muito duras, resultando em lise do oócito. Para evitar este Lise, várias modificações foram feitas para o kit de peixe. Especificamente, buffers de permeabilização e lavagem de oócito projetados para a imunofluorescência de oócitos e embriões substituiu os buffers de proprietários. A permeabilização, lavagens e incubação com sondas e amplificador foram realizadas em placas de 6-poços e oócitos foram colocados em slides no final do protocolo utilizando meios de montagem. Essas modificações foram capazes de superar as limitações do kit comercialmente disponível, em particular, a lise do oócito. Para precisão e reproducibly contar o número dos mRNAs em oócitos individuais, utilizou-se o software de computador. Juntos, este protocolo representa uma alternativa para PCR e sequenciamento para comparar a expressão de transcritos específicos em células únicas.
Introdução
Transcriptase reversa cadeia da polimerase (PCR) tem sido o padrão-ouro para quantificação de mRNA. Dois ensaios, digital PCR (dPCR)1 e quantitativo, real time PCR (qPCR)2 são utilizados atualmente. Das duas técnicas de PCR, dPCR tem maior sensibilidade do que qPCR, sugerindo que poderia ser usado para medir a abundância de mRNA em células únicas. No entanto, em nossas mãos, dPCR análise de mRNAs baixa abundância nas piscinas de ovócitos de 5 a 10 por cada amostra experimental produziu dados com baixa reprodutibilidade e alta variação3. Isto é provavelmente devido ao erro experimental associado a ....
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Protocolo
Animais procedimentos foram revisados e aprovados pelo Comitê de uso da Universidade de Nebraska-Lincoln e institucional Cuidado Animal e todos os métodos foram realizados em conformidade com os regulamentos e orientações pertinentes. Para este estudo, CD-1 consanguíneo ratos tem acesso ad libitum chow roedor normal e água; Eles foram mantidos em um 12:12 escuros: ciclo de luz.
1. preparação dos meios de comunicação necessários
- Para a mídia de base (OMM), adicione 100 mM NaCl, KCl de 5 mM, 0.5 mM KH2PO4e 1,7 mM CaCl2-2 H2O a 100 mL de água estéril.
Nota: Médio OMM pode ser armazenado ....
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Resultados
Após a conclusão do protocolo, o resultado será imagens individuais de confocal z-series (Figura 4A e Figura 5), imagens costuradas (Figura 4), e contagens de mRNA (Figura 4B). Quando é executada a multiplexação, haverá também mescladas imagens mostrando o rótulo para dois diferentes mRNAs (F.......
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Discussão
Uma série de pequenas etapas durante o protocolo irá garantir sucesso fluorescência e contagens exatas dos mRNAs. Em primeiro lugar, o protocolo deve ser realizado imediatamente após a coleta e fixação de oócitos. Observe que o PVP é adicionado para o buffer de fixação paraformaldeído 4% para evitar oócitos grudem uns aos outros. Nós achamos que é necessário realizar o experimento imediatamente após a coleta e fixação de oócitos. Qualquer atraso resulta em um muito menor sinal de fluorescência que resultaria em subcontag.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a declarar
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. Daniel R. Larson por sua generosa ajuda com a instalação e utilização do local encontrando e programa de rastreamento 13 e o apoio técnico da Universidade de Nebraska Lincoln microscopia núcleo para a imagem de microscopia confocal. Este estudo representa uma contribuição da Universidade da divisão de pesquisa agrícola de Nebraska, Lincoln, Nebraska e foi apoiado por fundos de hachura UNL (NEB-26-206/adesão número-232435 e NEB-26-231/adesão número-1013511).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| (±)-&ácido alfa;-lipóico | Sigma-Aldrich | T1395 | Ácido alfa-lipóico |
| Albumina, soro bovino, baixo teor de ácidos graxos | MP Biomedicals, LLC | 199899 | FAF BSA |
| BD seringa de 10mL TB | Becton, Dickinson and Company | 309659 | seringa de 10 mL |
| BD Agulha PrecisionGlide | Becton, Dickinson and Company | 305109 | agulha de calibre 27 1/2 |
| Cloreto de cálcio di-hidratado | Sigma-Aldrich | C7902 | CaCl2-2H2O |
| Ácido cítrico | Sigma-Aldrich | C2404 | Citrato |
| D-(+)-Glicose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| Glicose Fosfato | Na2HPO4 | ||
| Easy Grip Placa de Petri | Falcon Corning | 351008 | placa de 35 mm |
| Edetato Dissódico | Avantor | 8994-01 | |
| Tesoura Bonn Extra Fina | Fine Science Tools | 14084-08 | Reta, Afiada/Afiada, não serrilhada, tesoura de ponta de 13mm |
| Soro Bovino Fetal | Atlanta biologicals | S10250 | FBS |
| Solução de Reagente de Gentamicina | gibco | 15710-064 | Gentamicin |
| GlutaMAX-I (100X) | gibco | 35050-061 | Glutamax |
| Gold Seal Micro Slides | Gold Seal | 3039 | 25 x 75mm |
| slides Gonadotrofina, Do Soro de Éguas Grávidas | Sigma | G4877 | eCG |
| hCG NHPP recombinante | AFP8456A | hCG | |
| Hialuronidase, Tipo IV-S: De Testículos Bovinos | Sigma-Aldrich | H3884 | Hyaluronidase |
| Estilo Joalheiro Fórceps | Integra | 17-305X | Pinças 4-3/8", Estilo 5F, Reta, Micro Fine Jaw |
| L-(+)-Lactic Acid, ácido livre | MP Biomedicals, LLC | 190228 | L-Lactato |
| Sulfato de magnésio heptahidratado | Sigma-Aldrich | M2773 | MgSO4-7H2O |
| MEM Aminoácidos não essenciais | Corning | 25-025-Cl | NEAA |
| Vidro de Cobertura do Microscópio | Fisher Scientific | 12-542-C | 25 x 25x 0,15 mm lamínulas |
| de cobertura Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Sonda | Cell Diagnostics | 501891-C2 | Sonda Nanog |
| Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe | Advanced Cell Diagnostics | 501611-C3 | Pou5f1 Sonda |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | Paraformaldeído |
| PES 0,22 um Membrana - filtros estéreis | Millex-GP | SLGP033RS | 0,22 um |
| Polivinilpirrolidona | Sigma-Aldrich | P0930 | PVP |
| Cloreto de potássio | Sigma-Aldrich | 60128 | KCl |
| Fosfato de potássio monobásico | Sigma-Aldrich | 60218 | KH2PO4 |
| Prolongar o reagente antidesvanecimento Gold | invitrogen | P36934 | Reagente antidesvanecimento sem DAPI |
| RNAscope DAPI | Advanced Cell | Diagnostics 320858 | DAPI |
| RNAscope FL AMP 1 | Cell Diagnostics | 320852 | Amplifier 1 |
| RNAscope FL AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 320853 | Amplifier 2 |
| RNAscope FL AMP 3 | Advanced Amplificador | de 320854 | 3 |
| RNAscope FL AMP 4 ALT A | de 320855 | Diagnóstico Avançado | Células 4 ALT A |
| RNAscope FL AMP 4 ALT B | de 320856 | Diagnóstico Avançado | Células 4 ALT B |
| RNAscope FL AMP 4 ALT C | de 320857 | Diagnóstico Avançado | Células 4 ALT C |
| RNAscope Kit de Reagentes de Detecção Multiplex Fluorescente | Diagnóstico Celular Avançado | 320851 | Kit de Reagentes FISH |
| Sonda RNAscope Sonda de Controle Negativo 3-plex | Diagnóstico Celular Avançado | 320871 | |
| Sonda RNAscope de Controle Negativo Controle Positivo 3-plex | Diagnóstico Celular Avançado | 320881 | Controle Positivo |
| RNAscope Sonda Diluente | Celular Diagnóstico Celular Avançado | 300041 | Sonda Diluente |
| RNAscope Protease III | Diagnóstico Celular Avançado | 322337 | Protease III |
| RNAscope Protease III & Kit de Reagentes IV | Diagnóstico Celular Avançado | 322340 | Kit de Protease FISH |
| RNAscope Protease IV | Diagnóstico Celular Avançado | 322336 | Agulha Protease IV |
| S / S com Luer Hub 30G | Component Supply Co. | NE-301PL-50 | agulha romba de 30 calibres |
| Bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | S6191 | NaCl |
| Hidróxido de sódio | Sigma-Aldrich | 306576 | NaOH |
| Piruvato de sódio, >= 99% | Sigma-Aldrich | P5280 | Solução de piruvato |
| 6 Well Dish | Agtechinc | D18 | prato de 6 poços |
| Taurina | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Prato de cultura de tecidos | Falcon Corning | 353002 | prato de 60 mm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Triton X-100 |
Referências
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. CAMP-dependent regulation of ovulatory resp....
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Reimpressões e permissões
