Artigo de método

Procedimento de funcionamento padrão para a vigilância do Lyssavirus da população do bastão em Formosa

DOI:

10.3791/59421

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27 de agosto de 2019

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1Animal Health Research Institute, Council of Agriculture, Executive Yuan, 2Institute of Ecology and Evolutionary Biology, National Taiwan University, 3Bat Conservation Society of Taipei

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo introduz um procedimento de funcionamento padrão do laboratório para o teste diagnóstico de antígenos do lyssavirus nos bastões em Formosa.

Resumo

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Vírus dentro do gênero lyssavirus são patógenos zoonóticos, e pelo menos sete espécies de lyssavirus estão associadas a casos humanos. Porque os morcegos são reservatórios naturais da maioria dos lissavírus, um programa de vigilância de lyssavirus de morcegos tem sido conduzido em Taiwan desde 2008 para entender a ecologia desses vírus em morcegos. Neste programa, organizações não-governamentais de conservação de morcegos e centros de controle de doenças animais locais cooperaram para coletar morcegos mortos ou morcegos morrendo de fraqueza ou doença. Os tecidos cerebrais dos morcegos foram obtidos por necropsia e submetidos ao teste de anticorpo fluorescente direto (FAT) e reação em cadeia da polimerase reversa (RT-PCR) para detecção de antígenos de lyssavirus e ácidos nucleicos. Para a FAT, recomenda-se pelo menos dois conjugados de diagnóstico de raiva diferentes. Para o RT-PCR, dois conjuntos de primers (JW12/N165-146, N113F/N304R) são usados para amplificar uma sequência parcial do gene da nucleoproteína do lyssavirus. Este programa de vigilância monitora os lissavírus e outros agentes zoonóticos em morcegos. O lyssavirus do bastão de Formosa é encontrado em dois casos do pipistrelle japonês (ABRAMUS de Pipistrellus) em 2016 – 2017. Esses achados devem informar o público, os profissionais de saúde e os cientistas sobre os potenciais riscos de contato com morcegos e outros animais selvagens.

Introdução

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Vírus dentro do gênero lyssavirus são patógenos zoonóticos. Há pelo menos sete espécies de lyssavirus associadas a casos humanos1. Além das 16 espécies deste gênero1,2,3, Taiwan bat lyssavirus (twblv)4 e Kotalahti bat lyssavirus5 foram recentemente identificados em morcegos, mas seus status taxonômicos ainda não ser determinado.

Os morcegos são os hospedeiros naturais da maioria dos lissavírus, com exceção de Mokola lyssavirus e Ikoma lyssavirus, que ainda não foram identificados em nenhum morcego1,2,3,6. A informação sobre os lyssavirus em morcegos asiáticos ainda é limitada. Dois lyssavirus não caracterizados em morcegos asiáticos (um na Índia e outro na Tailândia)7,8foram relatados . Um caso humano da raiva associou com uma mordida de bastão em China foi relatado em 2002, mas o diagnóstico foi feito somente pela observação clínica9. Em Ásia Central, o lyssavirus de Aravan foi identificado no morcego rato-eared menor (Myotis blythi) em quirguistão em 1991, e o lyssavirus de Khujand foi identificado no morcego whiskered (Myotis mystacinus) em tajikistan em 200110. Em Ásia Sul, o lyssavirus do bastão de Gomes foi identificado na raposa Indian do vôo (medius de Pteropus) em Sri Lanka em 20153. No sudeste asiático, vários estudos sorológicos sobre morcegos nas Filipinas, Tailândia, Bangladesh, Camboja e Vietnã mostraram soroprevalência variável11,12,13,14, quinze anos. Embora o lyssavirus de Irkut fosse identificado no bastão tubo-cheirado maior (leucogaster de Murina) na província de Jilin, China em 201216, as espécies exatas e as posições de lyssavirus em populações asiáticas orientais do bastão permanecem desconhecidas.

Para avaliar a presença de lyssavirus em populações de morcegos taiwaneses, iniciou-se um programa de vigilância empregando tanto a FAT direta como a RT-PCR. O lyssavirus do bastão de Formosa foi identificado em dois casos do pipistrelle japonês (ABRAMUS de Pipistrellus)4 em 2016 – 2017. No artigo atual, um procedimento de funcionamento padrão do laboratório é introduzido para a fiscalização do Lyssavirus da população do bastão em Formosa. O fluxograma do diagnóstico do lyssavirus do bastão em nosso laboratório é apresentado em Figura 1.

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Protocolo

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1. precauções de segurança ao manusear lissavírus

  1. Assegure-se de que todos os trabalhadores laboratoriais que manuseiam espécimes de morcego recebam profilaxia antirrábica17. Monitore os níveis de anticorpos da raiva dos trabalhadores de antemão e reexamine-os a cada 6 meses17. A vacinação antirrábica de seguimento é necessária para aqueles cujos níveis de anticorpos são inferiores a 0,5 UI/mL17.
  2. Dependendo dos regulamentos de biossegurança do país em que o laboratório está localizado, assegure-se de que os seguintes procedimentos sejam realizados em laboratórios de nível de biossegurança adequados (por exemplo, laboratórios BSL-2 em Taiwan e em laboratórios BSL-3 na Austrália), e que trabalhadores são atualmente qualificados e usam equipamento de proteção pessoal adequado18.
    Nota: a vacinação contra a raiva fornece pouca ou nenhuma proteção contra os lissavírus pertencentes aos fitógrupos II e III18. Os trabalhadores devem ser informados de que vários patógenos zoonóticos foram identificados em morcegos19 e devem manipular amostras condições adequadas de laboratório de nível de biossegurança com equipamento de proteção pessoal adequado.

2. coleta de amostra

  1. Use encontrado morcegos fracos ou doentes ou carcaças.
    Nota: morcegos fracos ou doentes são entregues à sociedade de conservação de morcego de Taipei para cuidados veterinários ou pesquisa, enquanto as carcaças são submetidas diretamente ao Instituto de pesquisa em saúde animal. Nenhum morcego saudável foi eutanasiado neste programa de vigilância.
  2. Ter um ecologista morcego identificar espécies de morcegos através de características morfológicas20.
  3. Executar o DNA código barras da espécie de morcego quando o lyssavirus positivo é diagnosticado, usando procedimentos publicados anteriormente21.
  4. Submeter uma ficha informativa de cada carcaça de morcego (local de recolha, espécie, sinais clínicos, etc.).

3. necropsia de espécimes de morcego

  1. Prepare materiais.
    1. Prepare uma placa de dissecção limpa e coloque uma almofada absorvente estéril para necropsia.
    2. Prepare tubos de coleta para coletar órgãos de morcegos.
    3. Prepare pinças descartáveis e bipels para necropsia. Troque as ferramentas entre a necropsia de cada morcego. Prepare bolas de algodão umedecidas com etanol a 70% para a limpeza de pinças e bipéis durante a amostragem.
    4. Prepare duas lâminas de microscópio para a FAT. Colete espécimes frescos e corrigi-los em solução de formalina para exame histopatológico.
  2. Examine todos os orifícios externos antes da necropsia. Fotografe as características externas do morcego, especialmente a cabeça, orelhas e asas, para diferenciação de espécies.
  3. Colete uma amostra de swab oral. Coloque o bastão em decúbito ventral no tabuleiro e fixar a cabeça do morcego com pinças. Corte a pele ao longo da linha média da Calvaria com um bisturi e puxe a pele para os lados laterais. Corte o crânio ao longo da linha média da Calvaria com um bisturi e abra-o com uma pinça para expor o tecido cerebral.
  4. Retire o tecido cerebral do crânio e coloque-o sobre um depressor de língua estéril, e fazer manchas de impressão do tecido cerebral (ver passo 4,2). Colete um pequeno pedaço de tecido cerebral fresco e corrigi-lo em formalina para exame histopatológico. Contenha o tecido cerebral remanescente em um tubo para extração de ácido nucleico.
  5. Limpe pinças e bisturi com bolas de algodão umedecidas com etanol a 70% para remover os tecidos retidos entre a coleta de amostras.
  6. Coloque o bastão no tabuleiro em decúbito dorsal e corrigi-lo na placa com agulhas em ambos os lados da axila e calcanhar da cauda.
  7. Incise a pele ao longo da linha média do corpo da mandíbula ao ânus. Levante e separe a pele e os tecidos musculares subjacentes com pinças. Colete as glândulas salivares, que estão perto do osso mandibular.
  8. Levante ligeiramente o esterno com pinças e corte o esterno e a parede abdominal ao longo da linha média com um bisturi. Corte as clavículas com um bisturi. Fixar as gaiolas de costela esquerda e direita para a placa com agulhas para abrir a cavidade torácica.
  9. Registre as lesões brutas e o grau de mudança post-mortem.
  10. Retire os tecidos viscerais (i.e., coração, pulmões, fígado, rins, intestinos) da carcaça usando pinças e um bisturi. Colete os espécimes viscerais conforme necessário para futuras pesquisas.
    Observação: a coleção de amostras duplicadas é recomendada. Um deve ser coletado para o diagnóstico molecular, e o outro deve ser congelado em-80 ° c com ou sem meio de transporte viral para a cultura viral22.

4. teste de anticorpo fluorescente direto (FAT)

  1. Faça esfregaços de impressão do tecido cerebral para a FAT. Execute o Fat como descrito anteriormente18,23 com as seguintes modificações.
  2. Separe suavemente o tecido cerebral do tecido nervoso conectado com pinças e transfira o tecido cerebral para um depressor de língua estéril. Corte a seção transversal do cérebro, incluindo o tronco cerebral e cerebelo18,23. Faça manchas de impressão do tecido cerebral, tocando levemente a superfície cortada do tecido cerebral, e pressione o slide no tecido da lente para remover o excesso de tecido.
  3. Fixar as lâminas com acetona a-20 ° c durante 30 min. seque as lâminas testadas e os controlos positivos e negativos antes de se manchar com o conjugado.
  4. Usando cada um dos dois comercialmente disponíveis FITC-conjugated anti-raiva anticorpos para coloração de antígeno de lissavirus é altamente recomendado23. Determine a concentração de trabalho do conjugado comercial antes da primeira coloração. Soltar os conjugados diluídos através de um filtro de seringa de 0,45 μM nas lâminas e incubar as lâminas a 37 ° c durante 30 min dentro de uma câmara húmida.
  5. Drenar o excesso de conjugado das lâminas e lavar as lâminas com tampão fosfato salina (PBS) após a incubação.
  6. Solte uma pequena quantidade de 10% de glicerol nas lâminas e cubra com lâminas de cobertura.
  7. Examine as lâminas com um microscópio fluorescente.

5. extração de ácido nucleico

  1. Adicione o volume apropriado de MEM-10 (meio essencial mínimo suplementado com o soro bovino fetal de 10%) ao tecido de cérebro (10% w/v).
  2. Homogeneate o tecido cerebral com um grânulo de aço de 5 milímetros em um instrumento do homogeneizador e centrifugue em 825 x g por 10 minutos.
  3. Extraia o ácido nucleico, cujo volume final é de 50 μL, dentro de 200 μL do sobrenadante utilizando o kit de extração de ácido nucleico total disponível comercialmente com instrumento.

6. RT-PCR e análise filogenética

Nota: vários conjuntos de primers foram publicados para detectar todos os lyssavirus conhecidos ou lyssavirus específicos. O protocolo descrito aqui é um exemplo que nosso laboratório usa e pode não caber todas as necessidades experimentais. Selecione primers adequados de acordo com as necessidades laboratoriais.

  1. Prepare o reagente RT-PCR de uma etapa da seguinte forma: Adicionar 5 μL de ácido nucleico extraído à mistura de reacção contendo 2,5 μL de tampão de reacção 10x, 0,5 μL de primers para a frente e para trás (10 μM de cada), 4 μL de dNTP de 1,25 mM, 0,3 μL de inibidor de RNase (40 U/μL) , 0,3 μL de transcriptase reversa (10 U/μL), 0,4 μL de DNA polimerase (5 U/μL) e 11,5 μL de água tratada com DEPC.
    Nota: o conjunto primário utilizado neste protocolo é JW12 (5 '-ATGTAACACCYCTACAATG-3 ') e N165-146 (5 '-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3 ')24. Modificar a preparação de reagentes e condições de ciclismo de acordo com os conjuntos de primer utilizados.
  2. Realize a ciclagem as seguintes condições: incubação a 42 ° c por 40 min; desnaturação inicial a 94 ° c por 10 min; 35 ciclos de 94 ° c para 30 s, 55 ° c para 30 s e 72 ° c para 30 s; e finalmente, mais extensão em 72 ° c por 10 min.
  3. Use um ou mais conjuntos de primer para aumentar a sensibilidade diagnóstica.
    1. Use N113F (5 '-gtaggatgctatatggg-3 ') e N304R (5 '-ttgacgaagatcttgctcat-3 ')25,26 para preparar o reagente de RT-PCR de um passo da seguinte forma: Adicionar 5 μL de ácido nucleico extraído a uma mistura de reacção contendo 5 μL de tampão 10x, 5 μL de primers de avanço e reverso (4 μM de cada), 5 μL de dNTP de 1,25 mM, 0,5 μL de inibidor de RNase (40 U/μL), 0,2 μL de transcriptase reversa (10 U/μL), 1 μL de DNA polimerase (5 U/μL) e 23,3 μL de água tratada com DEPC.
    2. Realize a ciclagem as seguintes condições: incubação a 42 ° c por 40 min; desnaturação inicial a 95 ° c por 5 min; 35 ciclos de 95 ° c por 1 min, 55 ° c por 1 min e 20 s, e 72 ° c por 1 min; e finalmente, mais extensão em 72 ° c por 10 min.
      Nota: dependendo das necessidades laboratoriais, escolha primers adequados para o diagnóstico. N113F foi originalmente projetado para a amplificação do vírus da raiva, mas pode não funcionar bem para outros lyssavirus. O conjunto de N113F e N304R funciona bem para o vírus da raiva (variante de texugo de Taiwan) e o lyssavirus de morcego de Taiwan. Será mais fácil obter sequências inteiras de nucleoproteínas usando o conjunto de primers JW12 e N304R se o lyssavirus for amplificado por ambos os dois conjuntos de primer acima.
  4. Analise o produto do PCR na electroforese do gel do agarose de 2% e visualize pela iluminação da luz UV.
  5. Sequencia o produto do PCR pelo serviço de sequenciamento comercial.
  6. Insira ou carregue a sequência na página da Web da ferramenta de pesquisa de alinhamento local básica nucleotídeo (BLAST). Selecione o "outros (NR etc.)" banco de dados e entrar no organismo como lyssavirus. Selecione o algoritmo MegaBlast e execute o BLAST.

7. isolamento de vírus

Nota: execute o isolamento de vírus quando 1) a FAT ou 2) o RT-PCR indica positividade.

  1. Homogeneize o espécime do cérebro em uma suspensão de 10% (w/v) em MEM-10. Centrifugador a 825 x g durante 10 min.
  2. Inocular 200 μL de sobrenadante com uma suspensão de 3 x 106 Mna (rato neuroblastoma) células em 1 ml de mem-10 para 1 h a 37 ° c com 1% Co2. Transfira a suspensão do homogeneato de células cerebrais para um balão de 25 cm2 e adicione 6 ml de mem-10.
  3. Cultive 1 mL da suspensão de células de homogeneatos cerebrais em uma corrediça de vidro revestida com Teflon de 4 poços com 6 mm de diâmetro ao mesmo tempo.
  4. Após 3 – 4 dias de incubação a 37 ° c com 1% de CO2, fixar as células na corrediça de 4 poços com 100% de acetona (v/v).
  5. Manchar as lâminas com dois anticorpos anti-raiva conjugados FITC seguindo os passos 4.4 – 4.7. As células estão infectadas quando as inclusões intracitoplasmicas são investigadas. Registre a porcentagem de células infectadas.
  6. Executar tripsinização e subcultura da cultura de célula inoculada quando as lâminas são manchadas como negativas:
    1. Retire o meio e enxague o balão com 5 mL de PBS.
    2. Adicione 1 mL de tripsina ao balão e bata firmemente no fundo do balão.
    3. Adicionar 6 mL de MEM-10 e ressuspender as células.
    4. Coloque a suspensão celular em um novo balão de tecido (6 mL) e em uma corrediça de 4 poços (1 mL).
  7. Repita os passos 7.4 – 7.6 até 100% de infectividade ser atingida.
  8. Colete o sobrenadante após 24 h de incubação.

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Resultados

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De 2014 a maio de 2017, foram coletadas 332 carcaças de morcegos de 13 espécies para vigilância. Dois positivos testados. No primeiro caso de morcego, a impressão cerebral testou negativamente usando a FAT com um dos anticorpos antirrábico FITC-conjugados comerciais (Figura 2), enquanto o RT-PCRs empregando cada um dos dois conjuntos de primer (JW12/N165-146, N113F/N304R) rendeu resultados positivos (Figura 3). Uma seqüência de 428 BP do amplicon (amplificada co...

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Discussão

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Este procedimento de funcionamento padrão do laboratório (SOP) fornece um processo de série para testar amostras do bastão para a presença de antígenos do lyssavirus em Formosa. Os passos principais incluem o emprego de FAT e RT-PCR. A seleção de amostras apropriadas e o isolamento bem-sucedido do vírus também são importantes. Adicionalmente, alguma solução de problemas foi conduzida durante a monitoração de lyssavirus do bastão. A diferença principal era os animais do alvo. Inicialmente (2008 – 2009), os animais-alvo da...

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Divulgações

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Nenhum conflito de interesses é declarado.

Agradecimentos

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Agradecemos a Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-jung Tsai e Ya-LAN li por sua assistência durante este estudo. Este estudo foi apoiado por Grant no. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) do Bureau de inspeção e quarentena de saúde animal e vegetal, Conselho de agricultura, executivo Yuan, Taiwan.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2,5% Tripsina (10x)Gibco15090046Tripsina
25 cm2 frascoGreiner bio-one690160
AcetonaHoneywell32201-1L
Agarose IVWR Ciências da Vida97062-250
ÁlcoolNIHON SHIYAKU REAGENTNS-32294
AMV Transcriptase reversaPromegaM5101
(100X) Gibco15240-062MEM-10
LâminaBraunBA215
Centrífugaeppendorf5424R
Sistema de quimiolumineânciaTOP BIO CO.Tubo de coleta MGIS-21-C2-1M
Qiagen990381
Tubo de coletaSSI2341-SO
Cobrir a corrediçaMuto Pure chemical Co., LTD.24505
analisador de DNAApplied Biosystems3700XL
Soro bovino fetalGibco10437028MEM-10
FITC Anti-Rábicos Globulina MonoclonalFujirebio Diagnostic Inc.800-092Anticorpos anti-rábicos conjugados com FITC: reagente B
Lâmina de vidro com revestimento de Teflon de quatro poçosThermo Fisher Scientific30-86H-WHITE
ScienceMJ-105-R
HBSS (1x)Gibco14175095Incubadora de tripsina
ASTECSCA-165DS
Microscópio invertidoOlympusIX71
L-Glutamina 200 mM (100x)GibcoA2916801MEM-10
LIGHT DIAGNOSTICS Reagente anti-rábico FAT EMDMillipore Corporation5100Anticorpos anti-rábicos conjugados com FITC: reagente A
MagNA Pure Compact InstrumentRoche03731146001
MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1Roche03730964001
MEM (10x)Gibco11430030MEM-10
MEM NEAA (100x)Gibco11140050MEM-10
MEM solução vitamínicaGibco11120052MEM-10
NaHCO3Merck1.06329.0500MEM-10
AgulhaTerumoNN * 2332R9
PBSMedicago09-8912-100
Síntese de primersMission Biotech
RNasin ribonuclease inhibitorPromegaN2111
Serviço de sequenciamentoMission Biotech
SlideThermo ScientificAA00008032E00MNT10
Sodium Pyruvate (100 mM)Gibco11360070MEM-10
Stainless Steel BeadsQIAGEN69989
Almofada absorvente estéril3M1604T-2
Filtro de seringaNalgene171-0045
Taq polimeraseJMR HoldingsJMR-801
TermocicladorApplied Biosystems2720
TissueLyser IIQIAGEN85300
Abaixador de línguaHONJER CO., LTD.
PinçaTennyson instrumento médico desenvolvimento CO., LTD.A0601
Tartarato de TilosinaSigmaT6271-10GMEM-10
Antibiótico-Antimicótico Sistema de eletroforese em gel Major 122246

Referências

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