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Artigo de método

Avaliação do Risco e Prevalência de Câncer Colorretal por Detecção de Integridade do DNA das fezes

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DOI:

10.3791/59426

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8 de junho de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 2Diatech Pharmacogenetics srl

Neste artigo

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Resumo

O kit de DNA de DIAGNÓSTICO apresentado é um método de economia de tempo e fácil de usar para determinar a probabilidade confiável da presença de lesões de câncer colorretal.

Resumo

Hoje em dia, o DNA das fezes pode ser isolado e analisado por vários métodos. Os longos fragmentos de DNA nas fezes podem ser detectados por um ensaio qPCR, que fornece uma probabilidade confiável da presença de lesões colorretais pré-neoplásicas ou neoplásicas. Este método, chamado DNA longo fluorescência (FL-DNA), é um procedimento rápido e não invasivo que é uma melhoria no sistema de prevenção primário. Este método baseia-se na avaliação da integridade do DNA fecal por amplificação quantitativa de alvos específicos do DNA genômico. Em particular, a avaliação de fragmentos de DNA com mais de 200 bp permite a detecção de pacientes com lesões colorretais com especificidade muito alta. No entanto, este sistema e todos os testes de DNA de fezes disponíveis atualmente apresentam algumas questões gerais que precisam ser abordadas (por exemplo, a frequência em que os testes devem ser realizados e o número ideal de amostras de fezes coletadas em cada ponto de tempo para cada indivíduo). No entanto, a principal vantagem do FL-DNA é a possibilidade de usá-lo em associação com um teste atualmente utilizado no programa de triagem de CRC, conhecido como o exame de sangue oculto fecal à base imunoquímica (iFOBT). De fato, ambos os testes podem ser realizados na mesma amostra, reduzindo custos e obtendo uma melhor previsão da eventual presença de lesões colorretais.

Introdução

O câncer colorretal (CRC) deriva de um processo de várias etapas em que o epitélio saudável lentamente se desenvolve em adenomas ou pólipos, que progridem em carcinomas malignos ao longo do tempo1,,2. Apesar da alta taxa de incidência do CRC, observou-se tendência de queda no percentual de óbitos na última década3. De fato, as ferramentas de diagnóstico precoce adotadas em programas de triagem levaram à detecção e remoção precoce de adenomas pré-neoplásicos ou pólipos4. No entanto, devido aos diferentes limites técnicos, nenhum desses métodos é o ideal. De fato, para melhorar a sensibilidade e a especificidade, muitos testes de DNA de fezes foram propostos sozinhos ou em combinação com os testes de diagnóstico de rotina atuais5,6.

Tipicamente, a mucosa saudável se lança nos colonos apoptóticos do fluxo fecal, enquanto a mucosa doente esfolia colonos não apoptóticos. Fragmentos de 200 bp ou mais de comprimento caracterizam DNA não apoptótico. Este DNA é chamado de DNA longo (L-DNA) e tornou-se um biomarcador utilizado para o diagnóstico precoce do CRC. O L-DNA pode ser isolado da amostra de fezes e quantificado por qPCR usando um kit de DNA FL-DNA in vitrodiagnóstico 7,8,9,,10,,11,12.

O teste consiste em dois ensaios para a detecção de fragmentos de DNA FL variando de 138 bp a 339 bp. Cada ensaio permite a amplificação do FL-DNA (FAM) bem como o DNA de spike-in (HEX). Para garantir a amplificação ideal de todos os fragmentos, o teste foi dividido em dois ensaios (chamados "A" e "B"). O ensaio A detecta duas regiões do exon 14 do gene APC (NM_001127511) e um fragmento de exon 7 do gene TP53 (NM_001276760). O ensaio B detecta um fragmento de exon 14 do gene APC (NM_001127511) e duas regiões dos gônons 5 e 8 do gene TP53 (NM_001276760). Os ensaios não distinguem entre as regiões detectadas. O DNA de pico corresponde ao DNA do salmão Oncorhynchus keta e permite verificar que o procedimento foi feito corretamente e verifica a possível presença de inibidores, o que pode produzir resultados falsos negativos. A concentração fl-DNA é avaliada por quantificação absoluta usando o método de curva padrão e é expressa como ng/reação.

O método FL-DNA é um teste de DNA de fezes não invasivo e barato que, combinado com o exame de sangue oculto fecal à base imunoquímica (iFOBT), é atualmente usado em programas de triagem de CRC e permite melhores previsões de LESÕES de Adenomas de CRC e/ou de alto risco12.

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Protocolo

Os pacientes foram recrutados no Istituto Scientifico Romagnolo por lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) de Meldola (FC, Itália) entre 2013 e 2015. Os pacientes inscritos estavam no protocolo IRSTB002, aprovado pelo Comitê de Ética do IRST - IRCCS AVR (25/10/2012, ver. 1). Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.

1. Extração de DNA de fezes

  1. Use um kit para preparar amostras de fezes (ver Tabela de Materiais). Selecione e trate o material fecal realizando a extração de acordo com as instruções do fabricante. Amplie o DNA purificado diretamente ou armazene a -20 °C para análise posterior.

2. Preparação de controle positivo, padrões, DNA de pico e amostras clínicas

  1. Elaboração de normas e amostras
    1. Para preparar o controle positivo, padrões, DNA de pico e todas as amostras clínicas, centrífugue uma alíquota de controle positivo, padrões e DNA de pico, em seguida, resuspend cada reagente adicionando a quantidade correta de água fornecida (veja abaixo). Então, cuidadosamente vórtice o controle positivo, padrão, e pico-in DNA, em seguida, centrífuga para 10 s. Para obter uma ressuspensão completa dos reagentes secos, armazene os reagentes líquidos à temperatura ambiente (RT) por 30 minutos antes do uso.
      1. O controle positivo é o DNA humano em um formato seco. Resuspenque cada alíquota com 750 μL de água.
      2. O DNA de espigão é o DNA do salmão(Oncorhynchus keta),que é usado como um controle interno exógeno para verificar a possível presença de inibidores em amostras de DNA extraídas de fezes. Resuspenque cada alíquota com 100 μL de água.
    2. Para preparar a curva padrão, produza quatro diluições de 1:5 a partir da solução de estoque. Os pontos padrão devem ser 10 ng/reação, 2 ng/reação, 0,4 ng/reação e 0,08 ng/reação.
  2. Preparação do DNA de 1x
    1. Prepare o controle de DNA logo antes do uso.
    2. Prepare o controle de DNA de 1x spike-in misturando 5 μL de pico FL-DNa com 20 μL de água estéril. O número de amostras de controle de DNA de 1x será preparado de acordo com o número de amostras a serem analisadas, além do controle positivo.
  3. Preparação de amostras
    1. Misture 75 μL das amostras (amostras clínicas ou controle positivo) com 25 μL de DNA de 1x, produzindo um volume total de 100 μL.

3. Amplificação e determinação do valor FL-DNA utilizando qPCR Easy PGX

NOTA: Misturas completas de amplificação contendo primers e sondas específicas visando o DNA humano e o controle interno são fornecidas em formato liofilizado em 8 tiras de poço para FL-DNA Mix A e FL-DNA Mix B. Padrões, controles positivos e negativos, e as amostras devem ser amplificadas com ambas as misturas liofilizadas. As amostras clínicas só devem ser amplificadas em duplicata com ambas as misturas liofilizadas.

  1. Consulte a Tabela de Materiais para instrumentos e software operacional qPCR.
    1. Abra o software operacional e configure a placa e o perfil térmico:
      1. Configure a placa como mostrado na Tabela 1.
        1. Defina o tipo de poço para todas as oito posições na coluna 1 como Padrão.
        2. Defina o tipo de poço para os poços A2 e B2 como NTC.
        3. Defina o tipo de poço para C2 e D2 (os controles positivos) como Desconhecido.
        4. Defina o tipo de poço para todas as outras posições como Desconhecido.
        5. Selecione todas as 96 posições e adicione os Corantes FAM e HEX. Clique em Sincronizar placa.
      2. Defina o perfil térmico de acordo com a Tabela 2.
    2. Centrifugar o número necessário de tiras para 10 s para trazer o conteúdo para o fundo do tubo.
    3. Remova suavemente as vedações das tiras, prestando atenção para reter o conteúdo e adicione às respectivas tiras: controle negativo: 20 μL de água; amostra: 20 μL de DNA; curva padrão: 20 μL de padrão 1, 2, 3 ou 4; controle positivo: 20 μL de controle positivo.
    4. Feche cuidadosamente todas as tiras usando as tampas ópticas planas de 8 tiras e vórtice por alguns segundos.
    5. Centrifugar as tiras por 10 s e carregá-las no instrumento. Então, comece a corrida.

4. Análise de dados

NOTA: A análise dos dados pode ser realizada automaticamente ou manualmente, dependendo do software (ver Tabela de Materiais).

  1. No final da corrida, selecione as colunas A, C, E, G para "FAM: FL-DNA-A" e"HEX: IC", e colunas B, D, F, H para "FAM: FL-DNA-B" e"HEX: IC".
  2. Definir o seguinte para o Valor de Partida das Quantidades Padrão: 10 ng/reação para poços A1 e B1, 2 ng/reação para C1 e D1, 0,4 ng/reação para E1 e F1, e 0,08 ng/reação para G1 e H1.
  3. Definir valores de fluorescência limiar para 150 tanto para canais FAM (FL-DNA A e FL-DNA B) quanto HEX (IC).
  4. Na tabela de resultadosda caixa, clique em Opções de Coluna | Selecione Todos | Ok para obter os resultados em ambos os canais com seus respectivos valores Cq (⁄R) e R.
    NOTA: Esses valores são fornecidos pelo software de instrumento PCR em tempo real. ΔR corresponde ao valor de fluorescência normalizado ao último ciclo de amplificação.
  5. Na tabela de resultados da caixa, clique com o botão direito do mouse na tabela para abrir o menu de contexto e clique em Enviar para Excel para exportar os dados brutos.
  6. Verifique os valores das normas para verificar a adequação da curva padrão.
  7. Para cada mistura FL-DNA, verifique a coluna R2 ["R² (⁄R)" e eficiência ["Eficiência (%)" coluna] valores. Se estiverem em uma faixa aceitável, é possível prosseguir com a análise de acordo com as instruções do fabricante(Tabela 3).
  8. Se os resultados do canal FAM não estiverem na faixa esperada, omita um ponto da curva padrão e reanalise a corrida.
  9. Determinar os valores dos controles negativos e positivos com a seguinte fórmula, considerando os valores "No Cq" como zero:
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
  10. Compare os valores obtidos com os informados na Tabela 4.
  11. Se os controles de reação estiverem na faixa de valores esperados, proceda com a análise das amostras.
    NOTA: Verifique se os valores do Cq obtidos são gerados a partir de uma reação de amplificação real (curva de fluorescência sigmoidal) e não de um artefato (curva de fluorescência linear).
  12. Para analisar a adequação da amostra para cada mistura FL-DNA, compare os valores de Cq do canal HEX. Se o valor for ≥16, proceda com a análise das amostras. Se o valor for <16 ou não houver Cq, é provável que seja devido a um erro de dispensação do Pico DE DNA FL. Portanto, não é possível analisar as amostras.
  13. Calcule a média dos valores do Cq no canal "HEX" do controle positivo usando a seguinte fórmula:
    figure-protocol-3
  14. Calcule a média dos valores do Cq no canal "HEX" da amostra replica-se usando a seguinte fórmula:
    figure-protocol-4
  15. Calcule os valores de CqHEX de acordo com a seguinte fórmula:
    figure-protocol-5
  16. Compare os valores de CqHEX das amostras com os relatados na Tabela 5.
  17. Para cada mix (Mix A e Mix B), compare os valores de Cq do canal FAM com os relatados na Tabela 6.
  18. Para determinar o valor FL-DNA de cada amostra adequada, utilize a seguinte fórmula, considerando os valores "No Cq" como zero:
    figure-protocol-6
    figure-protocol-7
    NOTA: O risco e prevalência de câncer colorretal é uma função das avaliações do iFOBT e fl-DNA de acordo com os resultados do nomograma fagan obtidos por Rengucci et al.12 (Tabela 7).

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Resultados

O fluxo de trabalho deste protocolo é mostrado na Figura 1. O fluxo de trabalho fornece duas etapas de controle e ações diferentes de acordo com os resultados desta etapa. Em primeiro lugar, se uma amostra apresenta controles inadequados, a amplificação deve ser repetida. Em segundo lugar, se a amplificação for inibida, a amostra deve ser reprocessada desde o início ou classificada como não valiosa.

A Figura 2 mostra as curvas de fluorescência produzidas por a...

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Discussão

Estudos anteriores demonstraram que a análise da integridade do DNA das fezes extraídas por abordagens manuais e semiautomáticas pode representar uma ferramenta alternativa para a detecção precoce das lesões colorretais7,,8,,9,,10,,11,,12. Testes de triagem molecular e não invasivo foram desenvolvidos ao longo dos anos para a...

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Divulgações

Maura Menghi é funcionária em tempo integral da Diatech Pharmacogenetics srl.

Agradecimentos

Os autores não têm reconhecimentos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de polipropileno de 1,5 mL e 2 mL com trava de torção (livre de DNase, RNase, DNA, PCR sem inibidores)Consumíveis necessários para extração de DNA e PCR em tempo real
Etanol absoluto (qualidade do grau analítico)Reagente necessário para extração de DNA
Centrífuga de bancadaVelocidade máxima de 20000 x g. Instrumento necessário para extração de DNA
Software de análise EasyPGX versão 2.0.0Diatech PharmacogeneticsRT800-SWSoftware de análise 
Centrífuga/vórtice EasyPGX 8-well stripsDiatech PharmacogeneticsRT803Instrumento recomendado para o ensaio de PCR em tempo real
EasyPGX qPCR instrument 96 Diatech PharmacogeneticsRT800-96Instrumento recomendado para o ensaio de PCR em tempo real
EasyPGX pronto FL-DNADiatech PharmacogeneticsRT029Kit necessário para o ensaio de PCR em tempo real
Micropipetas (volumes de 1 a 1.000 µ L)Consumíveis necessários para extração de DNA e PCR em tempo real
descartáveis sem póConsumíveis necessários para extração de DNA e PCR em tempo real
QIAamp Fezes de DNA rápidasQiagen51604Kit recomendado para a extração e purificação de DNA de fezes
Pontas de filtro estéreis sem DNase, RNase (volumes de 1 a 1.000 µ L)Consumíveis necessários para extração de DNA e PCR em tempo real
Bloco térmico, por exemplo, bloco seco EasyPGXDiatech PharmacogeneticsRT801Instrumento necessário para extração de DNA
Vórtice, por exemplo, centrífuga/vórtice EasyPGX 1,5 ml RT802Diatech Pharmacogeneticsnecessário para extração de DNA
Luvas Instrumento da

Referências

  1. Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
  2. Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
  3. SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National Cancer Institute. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html (2019).
  4. Levin, B., et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).
  5. Bosch, L. J., et al. Molecular tests for colorectal cancer screening. Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).
  6. Ahlquist, D. A. Molecular detection of colorectal neoplasia. Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).
  7. Calistri, D., et al. Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).
  8. Calistri, D., et al. Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool. Neoplasia. 6, 536-540 (2004).
  9. Calistri, D., et al. Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer. Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).
  10. Calistri, D., et al. Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).
  11. De Maio, G., et al. Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis. World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).
  12. Rengucci, C., et al. Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).

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Reimpressões e permissões

Errata


Formal Correction: Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection
Posted by JoVE Editors on 9/28/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. An affiliation was updated.

The first affiliation was updated from:

Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)

to:

Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy

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