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Artigo de método

Ensaios de explosão oxidativa desencadeada por padrão e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis Arabidopsis thaliana

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DOI:

10.3791/59437

⸱

21 de maio de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Queen's University

Neste artigo

Resumo

Este trabalho descreve dois métodos para quantificar as respostas de defesa em Arabidopsis Arabidopsis thaliana após a exposição aos elicitors imunes: o estouro oxidativo transiente, e a inibição do crescimento de plântulas.

Resumo

As plantas evoluíram um sistema imunológico robusto para perceber patógenos e proteger contra a doença. Este papel descreve dois ensaios que podem ser usados para medir a força da ativação imune no Arabidopsis thaliana de Arabidopsis que segue o tratamento com moléculas do elicitores. Apresentado em primeiro lugar é um método para capturar o estouro oxidativo rápido-induzido e dinâmico, que pode ser monitorado usando um ensaio luminol-baseado. O segundo apresentado é um método que descreve como medir a inibição imune-induzida do crescimento de plântulas. Estes protocolos são rápidos e de confiança, não exigem o treinamento ou o equipamento especializado, e são amplamente utilizados compreender a base genética da imunidade da planta.

Introdução

Para perceber e se defender contra patógenos, as plantas evoluíram com receptores de reconhecimento de padrões ligados à membrana (PRRs) que detectam moléculas microbianas conservadas fora da célula conhecida como padrões moleculares associados a micróbios (MAMPs)1. A ligação de mamps a seus PRRS cognato inicia a sinalização imune quinase-negociada proteína tendo por resultado a resistência de doença do largo-espectro2. Uma das primeiras respostas após a ativação do PRR é a fosforilação e a ativação de proteínas integrais de membrana plasmática respiratória BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) que catalisam a produção de espécies reativas de oxigênio extracelular (ROS)3 , 4. Ros desempenham um papel importante no estabelecimento de resistência à doença, atuando tanto como mensageiros secundários para propagar a sinalização imune, bem como agentes antimicrobianos diretos5. A primeira observação de um surto oxidativo imune-eliciado foi descrita usando tubérculos de batata de CV. Rishiri após a inoculação de Phytophthora infestans 6. A produção de Eros foi avaliada em diversas espécies vegetais utilizando discos foliares7, culturas de suspensão celular8e protoplastos6. Descrito aqui é um método simples para a produção de ROS desencadeados por padrão em discos foliares de Arabidopsis Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

Como resposta à percepção MAMP, as proteínas ativadas de RbOH catalisam a produção de radicais de superóxido (o2-), radicais hidroxilo (• Oh) e oxigênio singlet (1o2) que são convertidos em peróxido de hidrogênio (H2o 2) no espaço extracelular9. H2o2 pode ser quantificado por quimioluminescência à base de luminol na presença do agente oxidante peroxidase de rábano (HRP)10. HRP oxida H2O2 gerando um íon hidróxido (Oh−) e gás de oxigênio (O2) que reagem com luminol para produzir um intermediário instável que libera um fóton de luz10. A emissão de fótons pode ser quantificada como unidades de luz relativa (RLUs) usando um leitor de microplacas ou Imager capaz de detectar luminescência, que se tornaram peças padrão de equipamentos na maioria dos laboratórios moleculares. Medindo a luz produzida sobre um intervalo de 40-60 minutos, um estouro oxidativo transiente pode ser detectado tão cedo quanto 2-5 minutos após o tratamento do elicitores, atingindo o pico em 10-20 minutos, e retornando aos níveis básicos após ~ 60 minutos11. A luz cumulativa produzida sobre este curso do tempo pode ser usada como uma medida da força imune que corresponde à ativação de proteínas de RBOH12. Convenientemente, este ensaio não exige o equipamento especializado ou a preparação incômoda da amostra.

Pico logo após a detecção da MAMP, a explosão oxidativa é considerada uma resposta imune precoce, juntamente com a ativação do MAPK e a produção de etileno5. As respostas imunes posteriores incluem reprogramação transcricional, fechamento estomático e deposição de calose2,5. A exposição prolongada aos MAMPs ativa continuamente a sinalização imune energeticamente dispendiosa, resultando na inibição do crescimento vegetal, indicativo de um trade-off entre o desenvolvimento e a imunidade13. A inibição do crescimento de plântulas desencadeada por padrão (SGI) é amplamente utilizada para avaliar a produção imune em Arabidopsis e tem sido parte integrante da identificação de vários componentes-chave da sinalização imune, incluindo PRRS 14,15 ,16. Conseqüentemente, este papel apresenta adicionalmente um ensaio para o SGI Pattern-desencadeado em Arabidopsis, por meio de que as plântulas são crescidas em placas do multi-poço que contêm meios ou meios padrão suplementados com um elicitores imune por 8-12 dias e pesaram então utilizando uma escala analítica.

Para demonstrar como os ensaios ROS e SGI podem ser usados para monitorar a sinalização mediada por PRR, três genótipos que representam diferentes saídas imunes foram escolhidos: (1) o tipo selvagem de adesão de Arabidopsis Columbia (Col-0), (2) o dominante-negativo bak1-5 mutante em que o coreceptor multi-funcional de PRR brassinosteroid insensivel 1-associado quinase 1 (BAK1) é não-funcional na sinalização imune17,18, e (3) o mutante cpk28-1 recessive, que não possui o proteínas reguladoras proteína quinase dependente de cálcio 28 (CPK28) e monitores intensificados respostas imunes-desencadeadas19,20. Os ensaios ROS e SGI são apresentados em resposta a um epítopo de peptídeo elf18 produzido sinteticamente de fator de alongamento bacteriano tu (EF-tu), reconhecido em Arabidopsis pelo receptor PRR EF-tu (EFR)15. Estes protocolos podem ser usados com outros indutores imunes tais como a proteína da motilidade bacteriana flagelina14 ou proteínas endógenas do elicitor da planta (atpeps)16, entretanto, deve-se notar que a responsividade da planta difere dependendo do elicitores21. Juntos, os ensaios ROS e SGI podem ser utilizados para a avaliação rápida e quantitativa das respostas mediadas pelo PRR precoce e tardia.

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Protocolo

1. detecção de ROS estourou em discos de folhas de Arabidopsis após Elicitação imunológica

  1. Crescimento e manutenção de plantas.
    1. Para sincronizar a germinação, estratifique as sementes de Arabidopsis suspendendo aproximadamente 50 sementes em 1 ml de agar estéril 0,1% [w/v] e armazene a 4 ° c (sem luz) por 3-4 dias.
      Nota: estratifique um controle de fundo de tipo selvagem (por exemplo, Col-0) e genótipos com saídas imunes altas e baixas (por exemplo, cpk28-1 e bak1-5, respectivamente) para servir como controles internos.
    2. Semear sementes no solo e germinar padrão de curto-dia condições (22 ° c, 10 h luz, 150 mE/m2/s intensidade de luz, e 65-70% umidade relativa).
    3. Após aproximadamente 7 dias, use fórceps para transplantar seedlings individuais aos potenciômetros novos, separados por pelo menos 4 cm para permitir o desenvolvimento cheio da roseta. Transplante 6-12 mudas por genótipo e retorno às condições padrão de curto-dia. Regularmente água e fertilizar plantas (1 g/L de 20-20-20 fertilizante a cada 2 semanas).
  2. Colete discos foliares em placas 96-well para a recuperação durante a noite.
    1. Em 4-5 semanas após a germinação (Figura 1a), use um perfurador afiado da biópsia de 4 milímetros para remover um disco da folha por a planta, evitando a meados de-veia e sendo cuidadoso limitar o ferimento (Figura 1b). Coloque os discos foliares em uma placa de luminômetro 96-well não utilizada contendo 100 μL de ddH2o com o lado adaxial voltado para cima para evitar a dessecação22 (Figura 1C). Se a avaliação de vários elicitors, remover 1 folha de disco da mesma folha para cada tratamento elicitores.
      Nota: folhas de amostra que são totalmente expandidas, terceira a quinta da parte superior da roseta, e aproximadamente o mesmo tamanho e idade para limitar a variabilidade. Se possível, corte discos de folhas ao meio usando uma lâmina de barbear antes da recuperação durante a noite, pois isso aumenta a área de superfície exposta à solução de elicitores23.
    2. Recupere durante a noite na temperatura ambiente para evitar a interferência de ROS produzidos por ferimento durante a coleta de discos foliares. Cubra as placas com uma tampa para evitar a evaporação.
  3. Realize o tratamento de elicitores e meça a produção de ROS.
    1. Programe o leitor de placas antes de adicionar a solução de reação, pois isso reduzirá o tempo entre o início do burst de ROS e as primeiras medições gravadas. Use um software comercial que seja apropriado para o leitor da placa. No nosso caso (consulte o Sumário), clique em configuraçõese selecione o cartucho LUM96 e o tipo de leitura cinética . Clique na categoria área de leitura e arraste para selecionar um subconjunto de poços ou a chapa inteira a ser lida. a aba do Pmt e do sistema ótico , ajuste o tempo da integração a 1.000 MS. na guia timing , defina o tempo de execução total para 40-60 min e o intervalo para 2 min.
    2. Retire a água de cada poço usando uma pipeta multicanal.
      Nota: Não perfure discos foliares, pois isso pode provocar tensões de ferimento e resultar em saídas de ROS mais variáveis.
    3. Prepare uma solução de reacção contendo 100 μM de luminol, 10 μg/mL de HRP, e a concentração desejada de elicitores (por exemplo: elf18 a 1 nM, 10 nM, 100 nM ou 1.000 nM) em ddH2o estéril utilizando 10 ml de solução para placa de 1 96 poços.
      Nota: dissolva peptídeos liofilizados em H estéril2o em tubos de baixa ligação para fazer um estoque de 10 mm, Flash-Freeze no líquido N2, e armazene em-80 ° c. Quando estiver pronto para usar, diluir estoques em H2o estéril para gerar um estoque de trabalho de 100 μm e armazenar a-20 ° c.
    4. Utilize uma pipeta multicanal para dispensar 100 μL da mistura de reacção a cada poço, acrescentando a solução a todos os discos foliares do mesmo tratamento ao mesmo tempo22. Inclua uma reação de controle (sem elicitor) para cada genótipo para avaliar os níveis basais de ROS na ausência de Elicitação. Meça imediatamente a emissão clara para todos os comprimentos de onda no espectro visível usando um leitor do microplate.
      Nota: Prepare e aplique a solução de reacção pouca luz, pois luminol e HRP são reagentes sensíveis à luz. Manter os reagentes no gelo ou a-20 ° c, excepto em utilização.
    5. Meça a emissão clara com um tempo da integração de 1.000 MS em intervalos de 2 minutos durante um período de 40-60 minutos em um leitor da microplaca a fim capturar o estouro oxidativo dinâmico (Figura 1D).
      Nota: Use um tempo de integração mais longo para melhorar a sensibilidade do ensaio11, ao assegurar-se de que todas as amostras em uma placa 96-well possam ser medidas dentro de um intervalo.
  4. Interpretação de dados.
    1. Para cada genótipo, use um aplicativo de planilha para calcular a contagem média de fótons e o erro padrão em cada ponto de tempo e exiba a produção de ROS em função do tempo usando um gráfico de dispersão.
      figure-protocol-1
      Onde t = cada ponto de tempo
    2. Alternativamente, somar as contagens de fótons para cada disco de folha e apresentar a média desses valores para cada genótipo usando um gráfico de barras com barra de erro padrão ou uma caixa e plotagem de Whisker.
      figure-protocol-2

2. ensaio de inibição do crescimento de plântulas

  1. Esterilizar sementes e semear em placas de Murashige e Skoog (MS).
    1. Prepare meio estéril de meia-força (0,5 x) MS (2,16 g/L) contendo 0,8% de agar [w/v]. Despeje a mídia em placas (90 x 15 mm) em uma capa de fluxo laminar.
    2. Esterilizar aproximadamente 100 sementes em um tubo de microcentrífuga por lavagem com 1 mL de etanol a 70% por 2 min e remover por aspiração. Adicionar 1 mL de 40% lixívia e suavemente rocha por 17 minutos à temperatura ambiente. Remova a lixívia por aspiração e lave três vezes em 1 mL de água estéril durante 5 min. ressuscitem em 1 mL de agar estéril de 0,1%.
      Nota: Alternativamente, use um protocolo de esterilização de sementes de gás cloro24.
    3. Semeie aproximadamente 100 sementes por o genótipo em placas do ágar do MS usando uma pipeta e um selo com fita do micropore em uma capa do fluxo laminar.
      Nota: Evite colocar sementes em estreita proximidade, pois isso tornará as mudas de transplante difíceis mais tarde.
    4. Estratifique as sementes colocando as placas a 4 ° c (sem luz) durante 3-4 dias para sincronizar a germinação (Figura 2a).
  2. Transplante de mudas em 48-well placas contendo peptídeos imunológicos elicitores.
    1. Após a estratificação, mova as placas para a luz em condições de dia curto (22 ° c, 10 h de luz, 150 mE/m2/s de intensidade de luz e 65-70% de umidade relativa) para 3-4 dias para permitir a germinação.
    2. Em uma capa de fluxo laminar, prepare diluições de peptídeo de elicitores (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM e 1.000 nM) em meios líquidos estéreis de 0,5 x MS contendo 1% de sacarose [w/v], usando 25 mL de MS para cada placa de 48 poços. Prepare as placas pipetando 500 μL de meio líquido MS ou meio MS contendo peptídeos por poço. Se disponível, use um pipetador da repetição para a preparação da placa para agilizar o processo.
      Nota: para cada genótipo, cultivar mudas em MS sem elicitores para dar conta de quaisquer diferenças inerentes ao crescimento das mudas.
    3. Usando fórceps estéril cuidadosamente transplantar um seedling a cada poço do mesmo tamanho e idade, assegurando que não há nenhum dano à muda ou à ruptura à raiz e que a raiz está submersa nos meios. Para cada genótipo, transplantar um mínimo de 6-8 mudas em cada diluição peptídica (Figura 2b).
      Nota: mudas de transplante aos 4 dias após a germinação, pois as raízes curtas são mais fáceis de manipular, e as mudas mais velhas podem produzir resultados menos ideais.
    4. Sele as placas com fita do micropore e mova-se para trás à luz circunstâncias padrão do short-dia (22 ° c, luz de 10 h, 150 mim/m2/s intensidade de luz, e umidade relativa de 65-70%). Permitir que as mudas cresçam por 8-12 dias.
  3. Determine a inibição do crescimento percentual.
    1. Retire cuidadosamente as mudas de 48-well placas e seque por dabbing na toalha de papel. Pesar mudas em uma escala analítica e valores de registro. Se disponível, use uma escala analítica equipada com saída USB para gravar valores de peso fresco em uma planilha. Antes de pesar as mudas, tire uma foto para exibir visualmente a inibição do crescimento (Figura 2C).
    2. Determine a inibição do crescimento percentual de mudas tratadas com elicitor em comparação com as mudas cultivadas apenas em MS (Figura 2D) da seguinte forma:
      figure-protocol-3
    3. Plotar dados usando um gráfico de barra com barras de erro padrão ou usando uma plotagem de caixa e Whisker para exibir melhor a variância inter-experimental.

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Resultados

Mutantes cpk28-119,25 e bak1-517,18 plantas foram utilizadas para demonstrar os desfechos esperados para genótipos com respostas imunes altas e baixas, respectivamente, em burst oxidativo e SGI ensaios em relação a um controle de fundo de tipo selvagem (Col-0). Para avaliar os efeitos dose-dependentes, uma série de diluição do peptide 10-fold (1-1000 nanô...

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Discussão

Este trabalho descreve dois métodos para a avaliação de respostas imunes desencadeadas por padrão em Arabidopsis, oferecendo abordagens quantitativas para avaliar a produção imune sem o uso de equipamentos especializados. Em combinação, ROS e SGI acionados por padrão podem ser usados para avaliar respostas precoces e tardias à percepção de micródios, respectivamente.

A maior limitação do ensaio de explosão oxidativa é a variabilidade. Por razões que não são completamente compreendidas...

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Agradecimentos

O trabalho em nosso laboratório é financiado através do programa de descoberta de recursos naturais e engenharia de pesquisa do Canadá (NSERC), a Fundação Canadense para a inovação John R. Evans Leader ' s Fund, e da Queen ' s University. KS e é são apoiados por tandem Ontario bolsas de pós-graduação e NSERC Canadá bolsas de pós-graduação para estudantes de mestrado (CGS-M).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
20-20-20 FertilizantePlant Prod10529Misture 1g/L em água e aplique nas plantas a cada 2 semanas para um crescimento ideal.
Punção de biópsia de 4 mmMedical Mart232-33-34-PUm conjunto de brocas de cortiça com uma área de superfície de 0,125 cm^2 também pode ser usado.
Placas estéreis de 48 poços com tampaBalança analítica Sigma-AldrichCLS3548
com suíte de traçãoVWRVWR-225ACQualquer balança analítica padrão pode ser usada para ensaios de inibição de crescimento, no entanto, uma saída direta de computador é ideal.
Pipeta Multicanal Mecânica BioHit mLine 12 (30-300 uL)Sartorius725240Qualquer pipeta multicanal pode ser usada, assim como uma única pipetadora, se necessário.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)EZ Biolabcp7211Armazene 10 mM de peptídeo estoque a -80C em tubos de baixa ligação a proteínas. Quando descongelado, armazene 100 uM de estoque de giro a -20C.
FórcepsFisher Scientific22-327379
Peroxidase de RábanoSigma-AldrichP6782Dissolver em água pura. Armazene a -20C e longe da luz.
LuminolSigma-AldrichA8511dissolver em DMSO. Armazene a -20C e longe da luz.
Murisage e Skoog Basal SaltsCedarlane LabsMSP09-100LTLoja a 4C.
SoilSunGrow HorticultureSunshine Mix #1Outros tipos de solo também podem ser usados para cultivar Arabidopsis. Misture com água ao encher panelas.
Leitor de microplacas multimodo SpectraMax Paradigm com módulo LUMDispositivos molecularesDeve solicitar um orçamentoQualquer leitor de placas capaz de detectar luminescência pode ser usado para esses ensaios.
SacaroseSigma-AldrichS0389-1KGArmazenar em temperatura ambiente.
Placas de Poliestireno Branco de 96 PoçosFisher Scientific07-200-589

Referências

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