Este trabalho descreve dois métodos para quantificar as respostas de defesa em Arabidopsis Arabidopsis thaliana após a exposição aos elicitors imunes: o estouro oxidativo transiente, e a inibição do crescimento de plântulas.
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Artigo de método
Ensaios de explosão oxidativa desencadeada por padrão e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis Arabidopsis thaliana
Neste artigo
Resumo
Resumo
As plantas evoluíram um sistema imunológico robusto para perceber patógenos e proteger contra a doença. Este papel descreve dois ensaios que podem ser usados para medir a força da ativação imune no Arabidopsis thaliana de Arabidopsis que segue o tratamento com moléculas do elicitores. Apresentado em primeiro lugar é um método para capturar o estouro oxidativo rápido-induzido e dinâmico, que pode ser monitorado usando um ensaio luminol-baseado. O segundo apresentado é um método que descreve como medir a inibição imune-induzida do crescimento de plântulas. Estes protocolos são rápidos e de confiança, não exigem o treinamento ou o equipamento especializado, e são amplamente utilizados compreender a base genética da imunidade da planta.
Introdução
Para perceber e se defender contra patógenos, as plantas evoluíram com receptores de reconhecimento de padrões ligados à membrana (PRRs) que detectam moléculas microbianas conservadas fora da célula conhecida como padrões moleculares associados a micróbios (MAMPs)1. A ligação de mamps a seus PRRS cognato inicia a sinalização imune quinase-negociada proteína tendo por resultado a resistência de doença do largo-espectro2. Uma das primeiras respostas após a ativação do PRR é a fosforilação e a ativação de proteínas integrais de membrana plasmática respiratória BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) que catalisam a produção de espécie....
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Protocolo
1. detecção de ROS estourou em discos de folhas de Arabidopsis após Elicitação imunológica
- Crescimento e manutenção de plantas.
- Para sincronizar a germinação, estratifique as sementes de Arabidopsis suspendendo aproximadamente 50 sementes em 1 ml de agar estéril 0,1% [w/v] e armazene a 4 ° c (sem luz) por 3-4 dias.
Nota: estratifique um controle de fundo de tipo selvagem (por exemplo, Col-0) e genótipos com saídas imunes altas e baixas (por exemplo, cpk28-1 e bak1-5, respectivamente) para servir como controles internos. - Semear sementes no solo e germinar padrão de curto-dia condições (22 ° c, 10 h luz....
- Para sincronizar a germinação, estratifique as sementes de Arabidopsis suspendendo aproximadamente 50 sementes em 1 ml de agar estéril 0,1% [w/v] e armazene a 4 ° c (sem luz) por 3-4 dias.
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Resultados
Mutantes cpk28-119,25 e bak1-517,18 plantas foram utilizadas para demonstrar os desfechos esperados para genótipos com respostas imunes altas e baixas, respectivamente, em burst oxidativo e SGI ensaios em relação a um controle de fundo de tipo selvagem (Col-0). Para avaliar os efeitos dose-dependentes, uma série de diluição do peptide 10-fold (1-1000 nanô.......
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Discussão
Este trabalho descreve dois métodos para a avaliação de respostas imunes desencadeadas por padrão em Arabidopsis, oferecendo abordagens quantitativas para avaliar a produção imune sem o uso de equipamentos especializados. Em combinação, ROS e SGI acionados por padrão podem ser usados para avaliar respostas precoces e tardias à percepção de micródios, respectivamente.
A maior limitação do ensaio de explosão oxidativa é a variabilidade. Por razões que não são completamente compreendidas.......
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Agradecimentos
O trabalho em nosso laboratório é financiado através do programa de descoberta de recursos naturais e engenharia de pesquisa do Canadá (NSERC), a Fundação Canadense para a inovação John R. Evans Leader ' s Fund, e da Queen ' s University. KS e é são apoiados por tandem Ontario bolsas de pós-graduação e NSERC Canadá bolsas de pós-graduação para estudantes de mestrado (CGS-M).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 20-20-20 Fertilizante | Plant Prod | 10529 | Misture 1g/L em água e aplique nas plantas a cada 2 semanas para um crescimento ideal. |
| Punção de biópsia de 4 mm | Medical Mart | 232-33-34-P | Um conjunto de brocas de cortiça com uma área de superfície de 0,125 cm^2 também pode ser usado. |
| Placas estéreis de 48 poços com tampa | Balança analítica Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
| com suíte de tração | VWR | VWR-225AC | Qualquer balança analítica padrão pode ser usada para ensaios de inibição de crescimento, no entanto, uma saída direta de computador é ideal. |
| Pipeta Multicanal Mecânica BioHit mLine 12 (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | Qualquer pipeta multicanal pode ser usada, assim como uma única pipetadora, se necessário. |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Armazene 10 mM de peptídeo estoque a -80C em tubos de baixa ligação a proteínas. Quando descongelado, armazene 100 uM de estoque de giro a -20C. |
| Fórceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Peroxidase de Rábano | Sigma-Aldrich | P6782 | Dissolver em água pura. Armazene a -20C e longe da luz. |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | dissolver em DMSO. Armazene a -20C e longe da luz. |
| Murisage e Skoog Basal Salts | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Loja a 4C. |
| Soil | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Outros tipos de solo também podem ser usados para cultivar Arabidopsis. Misture com água ao encher panelas. |
| Leitor de microplacas multimodo SpectraMax Paradigm com módulo LUM | Dispositivos moleculares | Deve solicitar um orçamento | Qualquer leitor de placas capaz de detectar luminescência pode ser usado para esses ensaios. |
| Sacarose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Armazenar em temperatura ambiente. |
| Placas de Poliestireno Branco de 96 Poços | Fisher Scientific | 07-200-589 |
Referências
- Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
- Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Per....
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Reimpressões e permissões
