Ensaios de explosão oxidativa desencadeada por padrão e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis Arabidopsis thaliana

Summary

Este trabalho descreve dois métodos para quantificar as respostas de defesa em Arabidopsis Arabidopsis thaliana após a exposição aos elicitors imunes: o estouro oxidativo transiente, e a inibição do crescimento de plântulas.

Abstract

As plantas evoluíram um sistema imunológico robusto para perceber patógenos e proteger contra a doença. Este papel descreve dois ensaios que podem ser usados para medir a força da ativação imune no Arabidopsis thaliana de Arabidopsis que segue o tratamento com moléculas do elicitores. Apresentado em primeiro lugar é um método para capturar o estouro oxidativo rápido-induzido e dinâmico, que pode ser monitorado usando um ensaio luminol-baseado. O segundo apresentado é um método que descreve como medir a inibição imune-induzida do crescimento de plântulas. Estes protocolos são rápidos e de confiança, não exigem o treinamento ou o equipamento especializado, e são amplamente utilizados compreender a base genética da imunidade da planta.

Introduction

Para perceber e se defender contra patógenos, as plantas evoluíram com receptores de reconhecimento de padrões ligados à membrana (PRRs) que detectam moléculas microbianas conservadas fora da célula conhecida como padrões moleculares associados a micróbios (MAMPs)¹. A ligação de mamps a seus PRRS cognato inicia a sinalização imune quinase-negociada proteína tendo por resultado a resistência de doença do largo-espectro². Uma das primeiras respostas após a ativação do PRR é a fosforilação e a ativação de proteínas integrais de membrana plasmática respiratória BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) que catalisam a produção de espécie....

Protocol

1. detecção de ROS estourou em discos de folhas de Arabidopsis após Elicitação imunológica

1. Crescimento e manutenção de plantas.
   1. Para sincronizar a germinação, estratifique as sementes de Arabidopsis suspendendo aproximadamente 50 sementes em 1 ml de agar estéril 0,1% [w/v] e armazene a 4 ° c (sem luz) por 3-4 dias.
      Nota: estratifique um controle de fundo de tipo selvagem (por exemplo, Col-0) e genótipos com saídas imunes altas e baixas (por exemplo, cpk28-1 e bak1-5, respectivamente) para servir como controles internos.
   2. Semear sementes no solo e germinar padrão de curto-dia condições (22 ° c, 10 h luz....

Results

Mutantes cpk28-1^19,25 e bak1-5^17,18 plantas foram utilizadas para demonstrar os desfechos esperados para genótipos com respostas imunes altas e baixas, respectivamente, em burst oxidativo e SGI ensaios em relação a um controle de fundo de tipo selvagem (Col-0). Para avaliar os efeitos dose-dependentes, uma série de diluição do peptide 10-fold (1-1000 nanô.......

Discussion

Este trabalho descreve dois métodos para a avaliação de respostas imunes desencadeadas por padrão em Arabidopsis, oferecendo abordagens quantitativas para avaliar a produção imune sem o uso de equipamentos especializados. Em combinação, ROS e SGI acionados por padrão podem ser usados para avaliar respostas precoces e tardias à percepção de micródios, respectivamente.

A maior limitação do ensaio de explosão oxidativa é a variabilidade. Por razões que não são completamente compreendidas.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
20-20-20 Fertilizante	Plant Prod	10529	Misture 1g/L em água e aplique nas plantas a cada 2 semanas para um crescimento ideal.
Punção de biópsia de 4 mm	Medical Mart	232-33-34-P	Um conjunto de brocas de cortiça com uma área de superfície de 0,125 cm^2 também pode ser usado.
Placas estéreis de 48 poços com tampa	Balança analítica Sigma-Aldrich	CLS3548
com suíte de tração	VWR	VWR-225AC	Qualquer balança analítica padrão pode ser usada para ensaios de inibição de crescimento, no entanto, uma saída direta de computador é ideal.
Pipeta Multicanal Mecânica BioHit mLine 12 (30-300 uL)	Sartorius	725240	Qualquer pipeta multicanal pode ser usada, assim como uma única pipetadora, se necessário.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	cp7211	Armazene 10 mM de peptídeo estoque a -80C em tubos de baixa ligação a proteínas. Quando descongelado, armazene 100 uM de estoque de giro a -20C.
Fórceps	Fisher Scientific	22-327379
Peroxidase de Rábano	Sigma-Aldrich	P6782	Dissolver em água pura. Armazene a -20C e longe da luz.
Luminol	Sigma-Aldrich	A8511	dissolver em DMSO. Armazene a -20C e longe da luz.
Murisage e Skoog Basal Salts	Cedarlane Labs	MSP09-100LT	Loja a 4C.
Soil	SunGrow Horticulture	Sunshine Mix #1	Outros tipos de solo também podem ser usados para cultivar Arabidopsis. Misture com água ao encher panelas.
Leitor de microplacas multimodo SpectraMax Paradigm com módulo LUM	Dispositivos moleculares	Deve solicitar um orçamento	Qualquer leitor de placas capaz de detectar luminescência pode ser usado para esses ensaios.
Sacarose	Sigma-Aldrich	S0389-1KG	Armazenar em temperatura ambiente.
Placas de Poliestireno Branco de 96 Poços	Fisher Scientific	07-200-589