Multi-Locus variável-número tandem-repita a análise do peixe-patogénico bactéria Yersinia ruckeri pela PCR multiplex e pela electroforese capilar

Summary

O ensaio de análise em tandem-repetição de número variável multi-Locus (MLVA) apresentado aqui permite a genotipagem de alta resolução barata, robusta e portátil da bactéria patogênica Yersinia ruckeri. Partindo das culturas puras, o ensaio emprega o PCR multiplex e a electroforese capilar para produzir os perfis do MLVA do dez-loci para aplicações a jusante.

Abstract

Yersinia ruckeri é um importante patógeno de salmonídeos cultivados em todo o mundo, mas ferramentas simples adequadas para investigações epizootiológicas (rastreamento de infecção, etc.) desta bactéria têm sido falta. Um ensaio de análise de repetição em tandem de número variável (MLVA) de múltiplos lócus foi, portanto, desenvolvido como uma ferramenta de fácil acesso e inequívoca para genotipagem de alta resolução de isolados recuperados. Para o ensaio MLVA aqui apresentado, o DNA é extraído de amostras cultivadas de Y. ruckeri por células bacterianas fervente em água, seguida pelo uso de sobrenadante como modelo para PCR. Os pares da primeira demão que alvejam dez loci do tandem-repeat do número variável (VNTR), intercalados durante todo o genoma de Y. ruckeri , são distribuídos ingualmente entre as reações do PCR do 2 5-Plex que funcionam circunstâncias de ciclagem idênticas. Os primers para frente são rotulados com qualquer uma das três corantes fluorescentes. Após a confirmação do amplicon pela electroforese do gel, os produtos do PCR são diluídos e sujeitados à electroforese capilar. Dos perfis resultantes do electroferograma, os picos que representam cada um dos locus de VNTR são tamanho-chamados e empregado para calcular contagens da repetição de VNTR no silico. Os perfis de MLVA de dez dígitos resultantes são usados para gerar árvores de abrangência mínima permitindo avaliação epizootiológica por análise de cluster. Os dados de saída altamente portáteis, na forma de perfis numéricos de MLVA, podem ser comparados rapidamente entre laboratórios e colocados em um contexto espaciotemporal. O procedimento inteiro da colônia cultivada à avaliação epizootiológica pode ser terminado para até 48 Y. os isolados de ruckeri dentro de um único dia de trabalho.

Introduction

Yersinia ruckeri, uma bactéria Gram-negativa e membro da família yersiniaceae, causa Yersiniose em peixes de salmonídeo cultivados no mundo inteiro¹. É prontamente diagnosticada a partir de peixes infectados por cultivo em muitos tipos de meios de agar, mas até recentemente, pouco se sabe sobre a estrutura populacional e epizootiologia de Y. ruckeri em todo o mundo e em diferentes habitats (espécies hospedeiras, etc.). Os sistemas de sorodigitação existentes para Y. ruckeri são inconsistentes, não têm compatibilidade mútua e oferecem baixa resolução epidemiológica. Alguns estudos moleculares sobre a bactéria têm sido conduzidos, empregando técnicas como a tipagem de sequências multilocus (MLST), a eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) ou a análise da sequência do genoma inteiro (WGS)^{2,3,4 ,5}. No entanto, MLST não fornece uma resolução suficientemente alta para rastreamento de infecção de rotina, enquanto PFGE é exigente trabalho e produz resultados que não são prontamente portáteis através de laboratórios. Embora a análise da WGS forneça uma resolução definitiva, o estabelecimento e a implementação de tais análises seriam pré-requisitos de recursos técnicos e de Bioinformática que ainda permanecem restritos a um número relativamente pequeno de laboratórios.

A análise do tandem-repeat do número variável do multi-Locus (MLVA) representa uma ferramenta de digitação molecular simples e fàcilmente acessível, que ofereça uma definição genética em alguns casos que combinam quase aquela da análise de WGS^6,7. A técnica é baseada na variação numérica repetida em loci de repetição em tandem (VNTR) de número variável selecionado, resultando em dados de saída que são altamente transportáveis, fazendo a comparação de isolados perfilados em bancos de dados on-line e em laboratórios diretos. Embora o MLST permaneça como padrão-ouro para a digitação epidemiológica de muitos patógenos bacterianos, um número crescente de estudos identifica um poder discriminatório significativamente maior de MLVA^8,9,10. Vários protocolos também foram publicados visando bactérias patogênicas de peixes, como Francisella noatunensis, Edwardsiella Piscicida e Renibacterium salmoninarum^11,12, ^trezeanos.

O protocolo MLVA de dez Locos apresentado aqui, que recentemente formou a base para um extenso estudo populacional de Y. ruckeri ¹⁴, envolve a extração de DNA de colônias cultivadas em ágar, PCR multiplex e eletroforese capilar (CE), seguido de jusante em aplicações de silico. Para cada isolado examinado, dois PCRs multiplex, ambos contendo cinco pares de primers fluorescentamente rotulados (6FAM, NED ou VIC), cada um visando regiões individuais de VNTR, são executados em paralelo em condições idênticas. Depois da verificação de amplicões do PCR pela electroforese do gel (GE), os produtos do PCR são diluídos antes da análise do CE, e os picos que representam os Locus respectivos de VNTR são tamanho-chamados dos arquivos resultantes do electroferograma. Junto com as fórmulas Locus-specific que esclarecendo discrepâncias menores, específicas da seqüência em testes padrões migratórios do CE, as chamadas do tamanho do CE de VNTR são empregadas então calculando contagens da repetição de VNTR que são concatenadas em perfis do MLVA do dez-dígito. Estes são usados como a entrada para avaliações epizootiológica (por exemplo, pela análise do conjunto em diagramas de Spanning Tree mínimo (MST)).

Protocol

Cuidado: para a totalidade do protocolo, é aconselhável realizar todos os procedimentos de laboratório molhado de forma estéril pelo uso de casacos de laboratório, luvas descartáveis e reagentes estéreis e equipamentos. É igualmente aconselhável preparar reações do PCR em uma sala separada (pre-PCR) não usada para a amplificação do PCR e/ou o tratamento de produtos do PCR (borne-PCR). Guarde todos os reagentes recomendados pelo fabricante. Consulte a tabela de materiais para obter mais detalhes sobre reagentes, equipamentos e softwares usados.

1. cultivo bacteriano e extração de DNA genómico

1. Semeie as culturas puras de Y. ruckeri em todo o tipo apropriado do agar (os autores usaram o agar de sangue bovino de 5%) e incubar em 22 ° c por 1-2 dias, ou 15 ° c por 3-4 dias.
2. De cada placa de agar, escolha uma colônia representativa única com um laço de inoculação e transfira para 1,5 mL tubos de centrifugação contendo 50 μL de água ultrapurificada. Suspender, vórtice brevemente, e incubar por 7 min em um bloco de aquecimento a 100 ° c.
3. Centrifugue a 16 000 x g durante 3 min e utilize uma pipeta para transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo de centrifugação vazio de 1,5 ml. Prossiga para o próximo passo usando o sobrenadante como DNA do modelo ou armazene a-20 ° c até o momento.

2. configuração de PCR multiplex e condições de ciclismo

Nota: Cada reacção de PCR multiplex (dois por Y. ruckeri isolate) deve conter 12,5 μL de 2x multiplex PCR Plus Master mix, 0,1 a 0,2 μm de cada par primário apropriado (tabela 1) e 3 μL de ADN do modelo, ajustados a um volume de reacção final de 25 μL por adição de água RNase-livre. Visam manter a exposição à luz das primeiras iniciadores com rótulo fluorescentamente rotulados no mínimo (por exemplo, envolvendo os tubos de armazenamento em folha de alumínio).

1. Para cada um dos dois ensaios multiplex do PCR (tabela 1), prepare misturas mestras como descrito acima (sem ADN do molde) de acordo com o número de amostras mais um positivo e um controle negativo. Além disso, permitir 10% de volume excedente. Vortex o mestre preparado mistura suavemente em baixa velocidade.
2. Distribuir 22 μL de cada mistura mestra separadamente em poços individuais em tiras ou placas de PCR, conforme apropriado para o número de amostras, e adicionar 3 μL de modelo a cada poço (para controles positivos e negativos, respectivamente, use DNA de um Y. ruckeri verificado estirpe e água ultrapurificada). Selar e centrifugar brevemente.
3. Execute todas as amostras num termociclador de PCR com o seguinte programa: (i) 5 min a 95 ° c (II) 30 ciclos de 0,5 min a 95 ° c, 1,5 min a 60 ° c e 1 min a 72 ° c e (III) 60 min a 68 ° c, seguidos de arrefecimento a 4 ° c indefinidamente. O programa será concluído em menos de 3 h.

3. confirmação do amplicon do PCR pela electroforese do gel

1. De acordo com as recomendações do fabricante, prepare um volume de 1,5% (w/v) gel de agarose em 1x Tris-borato-EDTA (TBE) tampão apropriado para o número de reações de PCR a ser testado. Antes da fundição, adicione 5 μL de corante ácido nucleico fluorescente por 50 μL de solução de gel e misture. Use bandejas e pentes como apropriado para a carcaça, deixando um número apropriado de poços livres para escadas da referência do ADN.
2. Depois de definir, mergulhe o gel em 1x TBE-buffer em um sistema GE. Misture 5 μL de produto de PCR juntamente com 2 μL de corante de carga e transfira para poços de gel. Adicionar 5 μL de escada de DNA em poços vazios para referência.
3. Execute o gel a 110 V por 15 cm por aproximadamente 1 h e use um sistema de imagem/visualização de gel com base em UV para verificar a presença de várias bandas (até cinco) representando amplicões de PCR (ver exemplo na Figura 1). Descarte o gel. Prossiga para a próxima etapa ou armazene os produtos restantes do PCR em 4 ° c até o processamento mais adicional.

4. instalação de electroforese capilar e condições de funcionamento

1. Depois da confirmação de amplicons do PCR, diluir produtos do PCR 1:10 (v/v) na água purified. Selar, misturar e centrifugar brevemente.
2. Trabalhando em um armário das emanações, prepare um volume da mistura mestra que consiste em 9 μL de formamida e de 0,5 μl do padrão do tamanho por o produto do PCR (permita o volume excedente de 10%). Vórtice brevemente e distribuir 9,5 μL em poços em uma placa apropriada para o sistema disponível do CE, antes de adicionar 0,5 μL do produto diluído do PCR. Selar, misturar e centrifugar brevemente.
   Atenção: Manuseie com cuidado. A mistura de formamida com água gera ácido fórmico, que é tóxico.
3. Usando um termociclador de PCR, desnaturar as amostras a 95 ° c por 3 min antes de refrigerar a 4 ° c indefinidamente. Centrifugue brevemente e carregue a placa sobre um sistema calibrado CE de acordo com as instruções do fabricante.
4. Executar análise de fragmento CE usando reagentes conforme apropriado para o aparelho de escolha e as seguintes configurações: 60 ° c; injeções de 5 s a 1,6 kV (32 V por cm); 32 min tempo de execução em 15 kV (300 V por cm). A análise do fragmento do CE de 24 poços em um 24-capilar (50 cm) tomará tipicamente aproximadamente 50 minutos.

5. VNTR tamanho chamando, repita contagem cálculo e MLVA perfilação

Nota: Etapa 5,1 descreve Y. ruckeri VNTR CE tamanho chamando de arquivos de electroferograma, usando o software específico listado na tabela de materiais. Consulte o manual do software para obter mais detalhes e resolução de problemas. Para o uso de outro software, consulte os manuais apropriados.

1. Importe arquivos de resultado CE (dois por Y. ruckeri isolate). Defina o método de análise para o padrão de microssatélites e selecione a opção de produto apropriada em tamanho padrão, antes de pressionar o botão analisar. Verifique a identificação correta dos fragmentos padrão de tamanho por meio do editor de correspondência de tamanho e corrija quaisquer alocações visivelmente erradas.
   1. Tendo selecionado o exemplo (s) a ser lido, aperte o botão Exibir plotagens e pressione Ctrl + a para habilitar a exibição da tabela de dimensionamento. Enquanto estiver no painel superior, mantenha pressionada a tecla CTRL enquanto clica nos cinco picos que representam os amplicões do VNTR (use a ferramenta de zoom conforme necessário).
      Nota: Para cada um dos produtos de PCR multiplex, o electroferograma mostrará cinco picos distribuídos entre os três corantes empregados (ver 5 ' rotulagem corante de primers para frente na tabela 1 e os dois exemplos na Figura 2).
   2. Pressione Ctrl + G para filtrar a tabela de dimensionamento, mostrando apenas as características dos cinco picos destacados e registre as chamadas de tamanho CE para cada Locus VNTR (com referência à tabela 1) para o aplicativo downstream.
2. A fim de contabiliza os padrões de mobilidade tendenciosos do amplicon durante o CE, calcule contagens precisas de repetição de VNTR de acordo com a fórmula fornecida abaixo, empregando chamadas de tamanho de VNTR CE em conjunto com variáveis Locus-específicas (ver tabela 1). Para eficiência, é aconselhável automatizar esse processo (por exemplo, usando um modelo de planilha).
   
3. Round calculado VNTR repetição contagens fora para o inteiro mais próximo e concatenar em seqüências de dez dígitos, cada representando o perfil MLVA de um único Y. ruckeri isolar.

6. análise de cluster de Spanning Tree mínima de dados MLVA

Nota: A etapa 6 descreve a criação de diagramas MST a partir de dados MLVA Y. ruckeri , usando o software específico listado na tabela de materiais. Consulte o manual do software para obter mais detalhes e resolução de problemas. Para o uso de outro software, consulte os manuais apropriados.

1. Crie um novo banco de dados e opte por ativar o plugin MLVA.
2. Importe perfis e metadados de Y. ruckeri MLVA selecionando dados de tipo de caractere seguidos por campos de importação e caracteres (Subseleção adicional dependendo do formato de armazenamento). Quando solicitado, especifique as regras de importação de acordo com o conteúdo do arquivo de importação: na coluna tipo de destino , classifique as contagens de repetição de VNTR como valor de caractere: VNTRe os metadados diversos como informações de entrada: campo informações de entrada .
   Nota: Para comparação e contexto, também é possível importar todo o conjunto de dados publicado (acesso aberto) juntamente com o documento original empregando o presente protocolo MLVA¹⁴. Os perfis e metadados de MLVA na coleção diversa de isolados de Y. ruckeri (n = 484) examinados nesse estudo estão disponíveis a partir de seu material suplementar (tabelas S1 e S2) através do seguinte link: https://AEM.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files
3. No painel tipo de experimento , abra a entrada VNTR e defina valores mínimos e máximos para cada Locus VNTR como 0 e 100, respectivamente. Em configurações gerais, defina o número de dígitos decimais como 0 e selecione números em tipo de dados. Verifique para considerar valores ausentes como zero.
4. Selecione amostras importadas destinadas à análise de cluster MST e clique no botão Criar nova comparação (no painel comparação).
   1. Se desejar para a apresentação visual do MST, alocar as amostras para grupos coloridos (por exemplo, de acordo com uma característica específica de metadados) empregando as várias opções disponíveis no painel grupos .
      Nota: Os grupos também podem ser criados/alterados retrospectivamente, após as etapas a seguir.
   2. Selecione análise de cluster avançada... e MST para dados categóricos para gerar um diagrama MST com base nas amostras escolhidas.
   3. Modifique ainda mais a apresentação visual do MST como preferencial (por exemplo, adicionando parâmetros de particionamento, rotulagem de nó/ramificação, crosslinks, legendas, etc.). Veja o exemplo na Figura 3.
      Nota: Um limite de particionamento de cluster (complexo clonal) de ≤ 4/10 loci de VNTR não idênticos, além de ocultar conexões de filial representando > 5/10 loci VNTR não idênticos, tem sido empregado anteriormente para análise de cluster MST com base em dados MLVA gerados usando este protocolo¹⁴. Desde que o conjunto de dados acima mencionado de 484 Y. ruckeri MLVA perfis foi importado, essas amostras também podem ser incluídas para análise de cluster MST (como descrito acima) para fornecer um contexto global e histórico. Isto facilitará por exemplo a identificação de todas as amostras afiliadas com os complexos clonal previamente descritos, assim como aqueles que representam ainda linhagens não descritas. Dependendo dos metadados disponíveis, o diagrama MST resultante pode ser examinado de maneiras diferentes, por exemplo, para descobrir eventuais padrões de agrupamento vinculados a traços específicos (Geografia, host, tempo, etc.).
   4. Se necessário, exporte o MST finalizado em um formato desejado usando a seleção de imagem de exportação .

Results

Após a PCR multiplex descrita aqui, uma imagem típica da GE verificando a presença de múltiplos amplicões de cada reação de PCR é mostrada na Figura 1. A análise de fragmento de CE a jusante realizada em produtos de PCR verificados, para cada isolado Y. ruckeri examinado, resulta em dois arquivos de eletroferograma usados para a chamada de tamanho dos respectivos Locos VNTR (Figura 2). A partir da análise de 484 diversos isolados de Y. ruckeri , não se observou Sobreposição na faixa de tamanho do amplicon entre os Locos VNTR rotulados com o mesmo corante na mesma reação Multiplex (tabela 1)¹⁴. Cada um dos picos electrophoretic pode, conseqüentemente, ser identificado inequivocamente pela cor.

Após a importação de perfis MLVA e metadados relevantes para o software preferencial, diagramas MST podem ser construídos como descrito para análise de quaisquer padrões epidemiológicos de interesse no material. Consulte os manuais adequados para opções adicionais disponíveis no respectivo software. Como exemplo, a Figura 3 mostra a comparação por MST de perfis MLVA para isolados de Y. ruckeri recuperados de peixes associados a cinco diferentes fazendas de salmão na Noruega.

Os tamanhos consistentes da repetição dos dez locus de VNTR, assim como sua estabilidade in vitro e in vivo, foram verificados previamente no estudo original baseado neste protocolo¹⁴. Momentaneamente, isto foi feito usando o sequenciamento de Sanger (tamanho da repetição), e por datilografar MLVA de isolados múltiplos que seguem passagens de série (in vitro) e dentro dos surtos individuais da doença (in vivo). Além disso, a estabilidade ambiental do loci ao longo do tempo foi examinada digitando vários isolados de "Strain House" recuperados ao longo de vários anos de locais de produção de água doce persistentemente infectados para o salmão do Atlântico.

Figura 1 : Electroforese do gel que verifica a presença de produtos múltiplos do PCR. A imagem confirma a presença de múltiplos amplicões do PCR em todas as 12 pistas que contêm amostras, com a primeira pista que representa a escada do ADN usada. Os tamanhos dos fragmentos selecionados da escada foram indicados, como têm o ensaio e a tensão do PCR (veja tabela S1 em Gulla et al. 2018¹⁴) afiliação de cada pista. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Electropherograms que mostra os picos que correspondem aos amplicões de VNTR. Os nomes dos diferentes Locos VNTR são indicados, com rótulos de corante (VIC = verde; NED = preto; 6FAM = azul) entre parênteses. Os dois eletroferogramas (teste 1 superior do PCR; A parte inferior do ensaio 2 do PCR) origina da digitação de um único isolado de Y. ruckeri . Os picos alaranjados (tintura LIZ) representam o padrão do tamanho empregado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Exemplo de árvore de abrangência mínima para avaliação epidemiológica. O diagrama é baseado em perfis MLVA de isolados de Y. ruckeri recuperados do salmão do Atlântico em cinco diferentes fazendas norueguesas (1-5; Ver legenda) experimentando surtos recorrentes de yerisniose. Pode ser observada uma tendência clara de agrupamento associada à origem da exploração. As ligações cruzadas mostram todas as conexões possíveis que envolvem ≤ 1/10 loci não-idênticos de VNTR (veja a legenda). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Electropherogram que visualiza gaguejar e rachar picos. Neste caso, ambos ocorrem simultaneamente, o que nem sempre é o caso. O pico mais longo e mais alto, representando o locus YR1070 VNTR, pode ser facilmente distinguido. A tela é ampliada e mostra apenas picos de corante azul. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: características do locus VNTR. Características relevantes das dez regiões de Y. ruckeri VNTR visadas no presente protocolo MLVA.

Discussion

Ambos os PCRs multiplex apresentados aqui apareceram relativamente robustos na cara da qualidade pobre do ADN do molde, mas a falta da amplificação do PCR foi observada não obstante ocasionalmente ao usar moldes com concentrações extremamente elevadas do ADN. Estes problemas foram resolvidos prontamente diluindo os moldes antes do PCR. Outros métodos para a extração do ADN do que esse empregado aqui podem igualmente ser usados (por exemplo, jogos comerciais).

Embora cinco amplicões sejam esperados de cada reação multiplex do PCR, cinco bandas visualmente distinguíveis não devem sempre ser esperadas de GE, porque algum (etiquetado diferentemente) loci de VNTR dentro da mesma reação tem escalas de tamanho de sobreposição. O tempo final da extensão do PCR de 60 de minuto pode ser encurtado se requerido, mas conduzirá provavelmente à ocorrência aumentada de picos rachados em eletroferogramas subseqüentes do CE (veja abaixo). Notavelmente, como a finalidade da etapa do GE é puramente para a verificação qualitativa de amplicons do PCR, o tempo de execução, a tensão e/ou a receita do gel podem ser ajustados como preferiu. Se as bandas particularmente fracas forem observadas pela GE, pode ser aconselhável reduzir o fator de diluição dessas amostras antes da CE.

Quando o protocolo do CE descrito aqui foi funcionado em um instrumento capilar comercial específico da electroforese (veja a tabela dos materiais), os sistemas diferentes do CE podem ter exigências diferentes da amostra, que podem por sua vez alertar algumas modificações ao protocolo . Consulte o manual do respectivo fabricante do sistema CE para obter instruções sobre os reagentes/equipamentos apropriados, calibração etc. para análise de fragmentos. Há também a possibilidade de que os padrões de mobilidade tendenciosos amplicon observados durante a CE podem diferir, relativamente, através de sistemas CE e/ou máquinas, como tem sido previamente documentado para outros protocolos MLVA^15,16. Se ocorrer em uma medida em que as contagens de repetição VNTR finais (arredondadas) sejam afetadas, isso significa que as variáveis Locus-específicas s e i (tabela 1), usadas para determinar contagens de repetição de VNTR, devem ser recalibradas. Isso envolve a regressão linear em parcelas comparando tamanhos de sequência precisos versus chamadas de tamanho CE, conforme descrito por Gulla et al. 2018¹⁴.

Picos divididos e picos de gaguejar, ambos os artefatos bem conhecidos na MLVA baseada em CE digitando¹⁷, podem ser observados em eletroferogramas durante a chamada de tamanho (Figura 4). Embora os picos de gaguejar devam ser desconsiderados, o pico mais longo deve ser consistentemente selecionado para aplicações downstream no caso de picos divididos separados por um único par base. Além disso, os picos ausentes que indicam a falta de Locus específicos de VNTR são raros, mas podem ocorrer, caso em que uma contagem da repetição de ' 0 ' deve ser atribuída. Se a cultura inicial a partir da qual o DNA é extraído não é pura (ou seja, contém mais de um subtipo Y. ruckeri ), vários picos altos correspondentes a diferentes alelos do mesmo locus/loci podem ser observados após a CE. Os cultivos secundários devem então ser executados das únicas colônias antes da extração nova do ADN para re-typing.

Como indicado no protocolo, o ADN do molde para o PCR deve por padrão ser extraído das culturas puras de Y. ruckeri. Em alguns casos, entretanto, as amostras do ovo-líquido que testam o positivo para Y. ruckeri por qPCR (CT-valores < 27) eram com sucesso MLVA datilografado diretamente, sem cultivo prévio, usando uma quantidade aumentada de ADN genomic (extraído com o jogo comercial) como o molde. Embora esta aproximação não seja testada extensivamente nem verificada, indica o potencial deste ensaio de MLVA para a examinação de matrizes biológicas complexas que contêm o ADN de uma escala de organismos diferentes além do que Y. ruckeri.

Todo o procedimento de digitação do MLVA aqui apresentado, desde a extração do DNA até a avaliação epizootiológica, pode ser completado em um único dia de trabalho. Entretanto, o número de amostras examinadas está em uma relação sublinear com o tempo exigido para a extração do ADN, o PCR e o CE, e o método é conseqüentemente muito mais tempo eficiente ao executar amostras múltiplas simultaneamente. Este é, no entanto, o caso para a maioria dos métodos baseados em laboratório, e como uma ferramenta para a subdigitação epidemiológica de Y. ruckeri, a combinação de alta resolução, simplicidade e portabilidade torna este ensaio MLVA superior aos protocolos publicados anteriormente^{4 ,5}. Também tem sido utilizada para verificar a relevância epidemiológica limitada de Y. ruckeri sorotipagem¹⁴.

Através de um abrangente estudo populacional baseado em MLVA envolvendo 484 Y. ruckeri isolados recuperados de uma variedade de origens e habitats espaciotemporais (peixes hospedeiros, meio ambiente, etc.), nosso entendimento sobre a epizootiologia e população a estrutura deste patógeno importante dos peixes foi aumentada substancialmente¹⁴. A digitação de MLVA permitiu o rastreamento de clones disseminados antropogenicamente ao longo de décadas, presumivelmente através do transporte de peixes, bem como identificação de cepas confinadas localmente. Além disso, enquanto alguns complexos clonais da bactéria poderiam ser claramente associados com a doença em particular hospedeiros de peixes (truta arco-íris e salmão do Atlântico, respectivamente), outros foram recuperados apenas de fontes ambientais e/ou peixes clinicamente não afetados Espécimes. A aplicabilidade do método é, portanto, não apenas limitada ao rastreamento de infecção, pois também pode fornecer informações de relevância potencial, por exemplo, para o desenvolvimento de vacinas, avaliação de riscos e manutenção da Biossegurança nacional. Atualmente, está em uso ativo no Instituto veterinário norueguês como uma ferramenta para investigar os diagnósticos de Y. ruckeri na aquicultura norueguesa.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
22° C/15° C incubadora	Como preferido.	Primer
5', 10K PMOL, dessalgado, seco	Thermo Fisher Scientific	450007	Sequências e rotulagem na Tabela 1. Prepare os aliquouts de trabalho no TE-buffer.
Agarose, universal, peqGOLD	VWR	732-2789P/732-2788	Utilizado durante a eletroforese em gel.
Analisador Genético Avant 3500xL	Thermo Fisher Scientific	A30469	Usado para análise de fragmentos de eletroforese capilar.
Módulos BioNumerics7	Applied Maths	NA	Usado para gerar árvores de abrangência mínima a partir de dados MLVA.
Centrífuga(s)	De preferência.	NA
Custom DNA Oligo, 25N, dessalgado, seco	Thermo Fisher Scientific	A15612	Sequências na Tabela 1. Prepare os aliquouts de trabalho no TE-buffer.
Corante de carregamento de gel de DNA (6X)	Thermo Fisher Scientific	R0611	Corante de carregamento usado durante a eletroforese em gel.
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 mL	Eppendorf	30120086	Tubos de centrífuga usados durante a extração de DNA.
Freezer	Como preferido.	NA
Armário de exaustão	Como preferir.	Sistema de
	conforme preferido.	Mancha
GelRed, 10.000X em água	Biotium	41003	Corante de ácido nucleico fluorescente usado durante a eletroforese em gel.
Software GeneMapper 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	Usado para leitura de eletroferogramas de eletroforese capilar.
Escada de DNA GeneRuler 50 bp, pronta para uso	Thermo Fisher Scientific	SM0373	Escada de DNA usada durante eletroforese em gel.
Corante GeneScan 600 LIZ Tamanho Padrão v2.0	Thermo Fisher Scientific	4408399	Tamanho padrão usado durante a eletroforese capilar.
Bloco de aquecimento	Como preferido.	NA
Hi-Di Formamida	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	Formamida deionizada usada durante a eletroforese capilar. Prepare aliquouts de trabalho.
Água Milli-Q	NA	NA	Água purificada usada durante PCR e eletroforese capilar. Receita padrão; produzido internamente.
PCR multiplex  Mais  Kit	Qiagen	206151/206152
PCR termociclador	Como preferido.	Polímero NA
POP-7 para analisadores genéticos 3500 Dx/3500xL Dx	Thermo Fisher Scientific	A26077/4393713/4393709	Matriz de separação usada durante a eletroforese capilar.
Cultura pura Yersinia ruckeri	NA	NA	Por exemplo, criopreservado ou fresco.
Água livre de RNase	Qiagen	NA	In: Multiplex PCR  Mais  Kit
Tris-borato-EDTA (TBE)  tampão	NA	NA	Receita padrão; produzido internamente.
Ágar tripsina de soja / ágar sangue bovino	NA	NA	Receita padrão; produzido internamente.
Sistema de imagem/visualização em gel baseado em UV,	conforme preferido.	NA
Vortexer	Como preferido.	NA