Avaliação da multiplicidade sináptica usando células inteiras Patch-clamp eletrofisiologia

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a multiplicidade sináptica funcional usando eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras em fatias cerebral aguda.

Abstract

No sistema nervoso central, um par de neurônios formam frequentemente múltiplos contatos sinápticos e/ou sites de liberação de neurotransmissor funcional (multiplicidade sináptica). Sináptica multiplicidade é plástico e mudanças ao longo do desenvolvimento e em diferentes condições fisiológicas, sendo um importante determinante para a eficácia da transmissão sináptica. Aqui, nós esboçamos experimentos para estimar o grau de multiplicidade das sinapses de terminação para um determinado neurônio pós-sináptico usando eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras em fatias cerebral aguda. Especificamente, a gravação de tensão-braçadeira é usada para comparar a diferença entre a amplitude das correntes pós-sináptico excitatórias espontâneas (sEPSCs) e correntes de pós-sinápticos excitatórios em miniatura (mEPSCs). A teoria por trás deste método é que entradas aferentes que apresentam multiplicidade mostrará sEPSCs grande, dependente do potencial de ação, devido à liberação de síncrona que ocorre em cada contato sináptico. Em contraste, o lançamento independente de potencial de ação (que é assíncrono) irá gerar menor amplitude mEPSCs. Este artigo descreve um conjunto de experiências e análises para caracterizar a existência de multiplicidade sináptica e discute os requisitos e limitações da técnica. Esta técnica pode ser aplicada para investigar como diferentes intervenções comportamentais, farmacológicas ou ambientais em vivo, afectar a organização de contatos sinápticos em áreas diferentes do cérebro.

Introduction

Transmissão sináptica é um mecanismo fundamental para a comunicação entre os neurônios e, portanto, funcionamento do cérebro. Transmissão sináptica também é lábil e pode alterar sua eficácia de forma dependente da atividade, bem como em resposta a sinais moduladora¹. Assim, examinando a função sináptica tem sido um foco importante de pesquisa da neurociência. Eletrofisiologia do grampo de remendo de célula inteira é uma técnica versátil que permite-nos compreender, pela elaboração de projetos experimentais e análises de dados, em profundidade mecanismos biofísicos e moleculares da transmissão sináptica. Uma abordagem comumente usada, talvez dev....

Protocol

Todas as experiências com animais são aprovadas na Comissão de cuidado Animal da Universidade de Ontário ocidental em conformidade com o Conselho canadense sobre orientações de cuidado Animal (AUP #2014-031).

1. soluções

1. Solução de corte
   1. Consulte a tabela 1 para a composição da solução de corte.
   2. Preparar uma solução stock de 20x com antecedência e armazená-lo em 4 ° C por até 1 mês.
   3. Para 1 x solução fatiamento, dissolver NaHCO₃, glicose e sacarose em ddH₂O e adicione o caldo de 20x. Garantir que a osmolaridade é entre 315-320 mOsm e armazenar ....

Results

O protocolo acima descreve um método para usar eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras para examinar o grau de multiplicidade sináptica, usando hipotalâmico neurônios de rato como exemplo. Esta técnica de preparação de fatia deve produzir células viáveis saudáveis que não possuem uma membrana inchada ou núcleo (Figura 1). Cada passo no protocolo é importante para a saúde do tecido e da qualidade das gravações.

Discussion

Um requisito importante para um experimento de eletrofisiologia braçadeira remendo bem sucedida é a obtenção de fatias/células saudáveis. Nosso protocolo descrito é otimizado para fatias hipotalâmicas que contêm neurônios PVN. Outro áreas podem exigir de cérebro modificado soluções e fatiamento métodos^21,22,23,24. Para a gravação, é fundamental para aceitar apenas gravações estáveis monitorando.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringa de 1 mL	BD	309659
10 lâminas	Fisher Scientific/outros	35698
22 lâminas	VWR/outros	21909-626
22 μ Filtros de seringa	M Milipore	09-719-000
Adson foreceps	Harvard Instruments	72-8547
Tesoura afiada angular	Harvard Instruments	72-8437
Clampex	Molecular Devices	pClamp 10
Lâmina de borda dupla	VWR	74-0002
Papel de filtro	Sigma/outros	1001090
Pincel fino	Fisher / vários	15-183-35 / vários
tubo de dispersão de gás	VWR	LG-8680-120
Isoflurano	Fresenius Kabi / outros	M60303
Krazy cola	vários	vários Mini
análise	Synaptosoft	MiniAnalysis 6
Osmomoter	Wescor Inc	Modelo 5600
Parafilm	Sigma	PM-996
Pipeta Pasteur	VWR	14672-200
medidor de ph	Mettler Toledo	FE20-ATC
Bulbo de borracha	VWR	82024-550
Cabo de bisturi nº 3	Harvard Instruments	72-8350
Cabo de bisturi nº 4	Harvard Instruments	72-8356
Lâmina de borda única	VWR	55411-050
Cortador de vibratome	Leica	VT1200S
Sistema de purificação de água	Millipore Milli-Q	Academic A10
Tampa da placa do poço	Fisher / various	07-201-590 / vários
< forte > produtos químicos / reagentes < / forte>
4-AP	Sigma	275875
BAPTA	sondas moleculares	B1204
CaCl2*2H2O	Sigma	C7902
CdCl2	sigma	202908
DNQX	Tocris	189
EGTA	Sigma	E3889
glicose	Sigma	G5767
HEPES	Sigma	H3375
K2-ATP	Sigma	A8937
KCl	Sigma	P9333
K-gluconato	Sigma	G4500
MgCl2*6H2O	Sigma	M2670
Grau de biologia molecular água	Sigma	W4502-1L
Na3GTP	Sigma	G8877
NaCl	Bioshop	SOD001.1
Na-gluconato	Sigma	S2054
NaH2PO4	Sigma	71504
NaHCO3	Sigma	S6014
Picrotoxina	sigma	P1675
SrCl	Sigma	255521
sacarose	Bioshop	SUC507.1
TTX	Alamone Labs	T-550
yDGG	Tocris	6729-55-1