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Artigo de método

VirWaTest, um método de ponto de uso para a detecção de vírus em amostras de água

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DOI:

10.3791/59463

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11 de maio de 2019

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1Laboratory of Viruses Contaminants of Water and Food (VIRCONT), Department of Genetics, Microbiology and Statistics, Section of Microbiology, Virology and Biotechnology, University of Barcelona, 2Grupo de Investigación Biodiversidad, Medio Ambiente y Salud (BIOMAS), Facultad de Ingenierías y Ciencias Agropecuarias (FICA), Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Américas, 3Municipal Laboratory - Waters of Mataró, 4GenIUL

Neste artigo

Resumo

Aqui nós apresentamos VirWaTest, que é um método simples, disponível e portátil para a concentração e a deteção dos vírus das amostras da água no ponto do uso.

Resumo

Vírus excretados por seres humanos e animais podem contaminar fontes de água e representam um risco para a saúde humana quando esta água é usada para beber, irrigação de alimentos, lavagem, etc. O indicador clássico de bactérias fecais nem sempre verifica a presença de patógenos virais para que a detecção de patógenos virais e indicadores virais seja relevante para adotar medidas de mitigação de riscos, especialmente em cenários humanitários e em áreas onde as manifestações virais transmitidas pela água são freqüentes.

Atualmente, vários testes comerciais que permitem a quantificação de bactérias indicadoras fecais (FIB) estão disponíveis para testes no ponto de uso. No entanto, tais testes comerciais não estão disponíveis para a detecção de vírus. A detecção de vírus em amostras de água ambiental requer a concentração de vários litros em volumes menores. Além disso, uma vez concentrada, a detecção de vírus depende de métodos como extração de ácidos nucleicos e detecção molecular (por exemplo, reação em cadeia da polimerase [PCR]-ensaios baseados) dos genomas virais.

O método descrito aqui permite a concentração de vírus de amostras de água de 10 L, bem como a extração de ácidos nucleicos virais no ponto de uso, com equipamentos simples e portáteis. Isso permite o teste de amostras de água no ponto de uso para vários vírus e é útil em cenários humanitários, bem como em qualquer contexto onde um laboratório equipado não está disponível. Alternativamente, o método permite concentrar os vírus presentes em amostras de água e o transporte do concentrado para um laboratório à temperatura ambiente para posterior análise.

Introdução

Durante as primeiras fases de qualquer emergência humanitária, o acesso a fontes de água potável, saneamento e higiene são fundamentais para a sobrevivência dos afetados. Portanto, a monitorização da qualidade da água é uma prioridade para prevenir surtos de águas. É bem sabido que a água contaminada é freqüentemente a origem das doenças, mas muitas vezes é difícil determinar as fontes de surtos virais, como o vírus da hepatite E (HEV), mesmo com a disponibilidade de métodos laboratoriais convencionais. O controle da qualidade da água é baseado na quantificação de FIB1,2,3,4. No entanto, tem sido extensivamente documentado que não há correlação entre a ausência de FIB e a presença de patógenos transmitidos por água viral, como rotavírus (RoV), norovírus (NoV) ou HEV5,6. Assim, o uso dos critérios de qualidade da água baseados em FIB pode resultar em uma subestimação dos riscos associados à presença de patógenos virais transmitidas por águas. A vigilância de vírus indicativos, tais como adenovírus humanos (hadv), ou patógenos específicos seria útil na definição da exposição a patógenos virais e identificando a fonte potencial de infecção humana7,8, 9,10 e na validação da eficácia das medidas sanitárias11.

Até agora, a detecção de vírus nesses cenários dependia de pessoal qualificado e logística complexa. VirWaTest (virwatest.org) destina-se ao desenvolvimento de um método simples, acessível e portátil para a concentração e subsequente detecção de vírus de amostras de água no ponto de uso.

A concentração de vírus é baseada no princípio da floculação orgânica de amostras de água de 10 L, pelas quais os vírus são recuperados em volumes menores12,13. Os flocos são recolhidos e adicionados a um tampão que lise os vírus e impede que os ácidos nucleicos da degradação quando armazenados na temperatura ambiente por não mais de 2 semanas.

O método da extração do ácido nucleico é baseado no uso de partículas magnéticas a que os ácidos nucleicos começ adsorbed. Eles podem ser transferidos de um tampão de lavagem para outro e, finalmente, para o tampão de eluição usando uma pipeta magnética à qual as partículas se unem. As suspensões de ácidos nucleicos virais obtidas podem ser enviadas para um laboratório de referência, onde a detecção pode ser realizada usando métodos moleculares baseados em PCR. Para cada extração de ácido nucleico, duas quantidades diferentes são testadas para descartar a inibição enzimática originada pela amostra. Alternativamente, com a disponibilidade mínima do equipamento, os testes de PCR podem ser executados no ponto de uso. Todo o processo é projetado para ser realizado independentemente de uma fonte de alimentação (Figura 1).

Um ensaio quantitativo de PCR para detectar HAdV, excretado por humanos e encontrado em amostras de águas residuais em altas concentrações, foi adaptado para ser executado no ponto de uso. HAdV são usados como indicadores virais fecais humanos. Um PCR para a quantificação do bacteriófago de MS2 foi adaptado igualmente desde que MS2 é usado em VirWaTest como o controle do processo. O método pode ser personalizado para a detecção de qualquer vírus de interesse.

Após o desenvolvimento, o método VirWaTest tem sido aplicado pelos usuários em duas configurações diferentes na República da África Central (RCA) e no Equador, fornecendo feedback sobre a aplicação do protocolo em situações reais.

A nosso conhecimento, este é o primeiro procedimento que permite a concentração e a deteção dos vírus no ponto de uso, independente de toda a fonte de alimentação, equipamento grande, e condições de congelação/refrigerando. Recomenda-se a coleta de duas repetições de cada amostra de água, a fim de obter resultados robustos.

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Protocolo

1. preparação e embalagem

Nota: os materiais/equipamentos a serem embalados estão listados na tabela 1. Use luvas para manusear os reagentes necessários para o controle do processo, os reagentes de concentração, os reagentes de extração de ácido nucleico e os reagentes de detecção. Use óculos protetores para manusear os reagentes necessários para a extração de ácido nucleico.

  1. Controle de processo
    1. Prepare a cultura de ações do bacteriófago de MS2 (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) contendo 1 x 1010 pfu/ml em laboratório seguindo o procedimento ISO 10705-1:199514.
    2. Em seguida, alíquota 10 μL da suspensão por tubo contendo 1 x 108 Pfu em tubos de 10 ml e deixe a água evalhar a 37 ° c. Use um tubo por amostra de água.
    3. Além disso, prepare um tubo contendo 10 mL de água destilada estéril por amostra coletada.
  2. Reagentes de concentração
    1. Para a solução de leite desnatado pré-floculada (PSM), use as seguintes quantidades para concentrar amostras de água de 5 10 L.
      1. Prepare um tubo de plástico contendo 5 g de leite desnatado.
      2. Prepare um saco de plástico com zíper contendo 16,66 g de sais marinhos.
      3. Prepare uma garrafa plástica contendo 500 mL de água destilada.
    2. Prepare os reagentes necessários para o ajuste do pH. Use as seguintes quantidades para ajustar o pH do PSM e de amostras de água de 5 10 L.
      1. Adicionar 5 g de ácido cítrico 1-hidrato a um tubo de plástico de 10 mL.
        PRECAUÇÃO: o ácido cítrico provoca irritação grave quando entra em contacto com os olhos. Se isto ocorrer, lave o olho cautelosamente com água durante vários minutos. Se a irritação persistir, procure aconselhamento médico.
      2. Colocar 2 g de hidróxido de sódio num tubo plástico de 10 mL.
        PRECAUÇÃO: o hidróxido de sódio pode provocar queimaduras cutâneas graves e danos oculares. Se ingerido, lave a boca. Não induzir o vômito. Se ele entra em contato com os olhos, enxaguar com cautela com água por vários minutos. Em seguida, procure aconselhamento médico.
      3. Coloque 25 mL de água destilada estéril em um recipiente de plástico.
      4. Colocar 50 mL de água destilada estéril num recipiente de plástico.
    3. Prepare a saqueta de condicionamento da amostra utilizada para a floculação, a solução conservante utilizada para preservar os ácidos nucleicos e a saqueta neutralizadora para neutralizar a água e os materiais descartados. Use as seguintes quantidades para cada amostra de água de 10 L a ser testada.
      1. Coloque 15 g de sais marinhos e 8 g de ácido cítrico 1-hidrata em um saco de plástico com zíper para a saqueta de condicionamento.
      2. Adicionar 2 mL de tampão de lise (tabela de materiais) e 0,3 ml de agente de preservação de ácidos nucleicos (tabela de materiais) a um tubo de 5 ml.
        PRECAUÇÃO: o tampão de Lise contém tiocianato de guanidina e Triton X-100. Contato com ácido liberta gás tóxico, e é prejudicial se ingerido, inalado, ou entra em contato com a pele. Se ingerido, lave a boca. Não induzir o vômito. Se ele entra em contato com a pele, lave com muita água. Em seguida, procure aconselhamento médico. O agente de preservação do ácido nucleico causa a irritação da pele e do olho e é prejudicial se engolido. Se ele entra em contato com a pele ou os olhos, enxaguar com água abundante por vários minutos. Em qualquer caso, especialmente se ingerido e sentindo-se mal, procurar aconselhamento médico.
      3. Põr 40 g do pó detergente em quatro sacos plásticos do zipper.
        PRECAUÇÃO: o detergente em pó provoca irritação ocular. Se vier em contacto com os olhos, enxague com água abundante durante vários minutos. Se a irritação persistir ou se engolida, procure aconselhamento médico.
  3. Reagentes de extração de ácido nucleico
    1. Coloque 50 μL de partículas magnéticas (tabela de materiais) e 1 ml de etanol 96% em um tubo de 5 ml que constituem o tampão de ligação.
      PRECAUÇÃO: o tampão de partículas magnéticas contém azida sódica, que forma um gás tóxico quando entra em contacto com ácidos ou íons metálicos pesados e é tóxico se ingerido ou quando entra em contacto com a pele. Se ingerido ou em contacto com a pele, enxague a boca ou a pele com água abundante e procure aconselhamento médico. O etanol é um líquido altamente inflamável e vapor e provoca irritação ocular grave. Manter afastado do calor, superfícies quentes, faíscas, e qualquer outra fonte de ignição. Se ele entra em contato com a pele ou os olhos, enxaguar com água abundante. Em caso de ingestão de grandes quantidades de água e/ou se inalado, ir para fora para o ar fresco. Em qualquer caso, procure aconselhamento médico.
    2. Adicionar 500 μl, 600 μL, e 200 μL de tampões de lavagem 1, 2, e 3, respectivamente (tabela de materiais), a três tubos de 2 ml.
      Cuidado: os tampões de lavagem contêm o tiocianato do guanidina e o cloreto do guanidina, que são prejudiciais se inalados ou engolidos e irrigar a pele e os olhos. Contato com ácidos libera gás muito tóxico. Se eles entram em contato com a pele ou os olhos, enxaguar com água abundante. Se ingerido, lave a boca com água abundante. Não induzir o vômito. Procure sempre aconselhamento médico.
    3. Adicionar 120 μL de tampão de eluição (tabela de materiais) a um tubo de 0,5 ml.
  4. Reagentes de detecção de HAdV e MS2
    Nota: duas reações diferentes da extração do ácido nucleico podem ser analisadas simultaneamente em cada ensaio do PCR se um termociclador 8-well é usado. Para todos os ensaios de PCR, prepare a água da biologia molecular alicitado em 1,5 tubos de mL.
    1. Detecção de HAdV
      1. Prepare uma mistura contendo 10 μL de primer para a frente do AdF de 22,5 μM, 10 μL de primer reverso de 22,5 μM AdR e 5 μL de sonda AdP de 11,25 μM (tabela 2).
      2. Adicionar 2,5 μL da mistura aos tubos de 1 a 8 de uma tira de tubo. Deixe secar à temperatura ambiente, feche os tubos e mantenha-os protegidos da luz.
      3. Corte a tira dividindo-a em duas tiras: tubos 1-5 e tubos 6-8.
      4. Prepare uma diluição em série de suspensões de DNA contendo a sequência de nucleotídeo da região HAdV amplificada. Ar-seco 1 μL de suspensões contendo 1 x 105, 1 x 107e 1 x 109 GC/ml em tubos 6-8.
        Nota: Mantenha os tubos contendo os primers, a sonda e as suspensões secas ao ar protegidas da luz.
    2. Detecção de MS2
      1. Prepare uma mistura contendo 10 μL de primer para a frente Pecson-2F de 25 μM, 10 μL de primer reverso Pecson-2R de 25 μM e 2,5 μL de sonda PecP-2 de 25 μM (tabela 2).
      2. Adicionar 2,25 μL da mistura aos tubos de 1 a 8 de uma tira de tubo. Deixe secar à temperatura ambiente, feche os tubos e mantenha-os protegidos da luz.
      3. Corte a tira dividindo-a em duas tiras: tubos 1-5 e tubos 6-8.
      4. Prossiga como na etapa 1.4.1.4 mas use uma suspensão padrão projetada para o MS2 preferivelmente.

2. concentração viral

Nota: use luvas em todos os momentos durante a coleta de amostras, preparação de reagentes, floculação, coleta de flocos e procedimentos de descarte de resíduos. Use óculos de proteção durante o procedimento de preparação do reagente.

  1. Coleta de amostra
    1. Colete uma amostra de água de 10 L em um balde de fundo plano com uma tampa. Colete um mínimo de duas repetições para cada amostra.
      Nota: é importante usar baldes claros para visualizar o pellet. Se a amostra de água contiver material suspenso (por exemplo, areia, algas), deixe-o sedimento e, em seguida, colete o sobrenadante de água em um novo balde.
    2. Registre o volume coletado, bem como a data de localização e coleta, para cada amostra de água.
    3. Põr um agitador magnético conectado a uma bateria um apoio da cubeta e coloc a cubeta que contem a amostra da água em seu apoio.
      Observação: Procure uma superfície plana em um local fresco e mantenha os baldes contendo as amostras de água da luz solar direta.
  2. Preparação de reagentes
    1. reagentes de ajuste de pH
      1. Despeje o pó de ácido cítrico e as pelotas de hidróxido de sódio nos vasos contendo 25 e 50 mL de água destilada, respectivamente.
      2. Agitar suavemente à mão até que o ácido cítrico e o hidróxido de sódio sejam completamente dissolvidos.
        Atenção: não deite a água sobre as pastilhas de hidróxido de sódio. Em vez disso, Despeje as pelotas de hidróxido de sódio sobre a água.
    2. Leite desnatado preflocculated
      1. Coloque um saco de stand-up em um agitador magnético e despeje 500 mL de água destilada nele. Deixe cair um ímã de agitação dentro do saco e gire sobre o agitador magnético.
      2. Despeje o conteúdo de um saquinho de sal marinho e de um tubo de leite desnatado no saco de stand-up e mexa por 5 min em velocidade média para dissolvê-los.
      3. Adicione 3 mL de ácido cítrico à solução de PSM usando uma pipeta de Pasteur para certificar-se que o pH está entre 3,4 e 3,6. Meça o pH da solução PSM usando tiras indicadoras de pH. Adicionar pequenas quantidades de ácido cítrico e hidróxido de sódio como o pH se aproxima de 3,5.
      4. Desligue o agitador magnético e certifique-se de que os flocos estão visíveis. Use uma lanterna para ajudar a visualizar os flocs.
  3. Floculação
    1. Deixe cair um ímã de agitação na água, ajuste o agitador magnético na velocidade máxima, e gire-o sobre. Certifique-se de que o íman de agitação começa a girar.
    2. Adicione 10 mL de água destilada a um tubo de controle de processo. Inverta o tubo algumas vezes para Rehidratar o estoque viral e despeje a solução na água.
    3. Despeje o conteúdo de um saquinho de condicionamento da amostra na água e mexa por 5 min.
    4. Meça o pH da amostra de água usando tiras indicadoras de pH. Adicione algumas gotas de ácido cítrico ou hidróxido de sódio para a amostra de água para se certificar de que o pH está entre 3,4 e 3,6. Adicionar pequenas quantidades de ácido cítrico e hidróxido de sódio como o pH se aproxima de 3,5.
    5. Adicione 100 mL da solução PSM usando um recipiente de 100 mL.
    6. Sele a cubeta com a tampa, ajuste o agitador magnético na velocidade mínima, e deixe a agitação da água por 8 h.
    7. Desligue o agitador magnético e deixe a água ainda por pelo menos 5 h para permitir que os flocos se instalem.
  4. FLOC coleção
    1. Construa um sistema desviando compor de um controlador da pipeta, de duas pipetas, e de um tubo plástico, para aspirar o sobrenadante da água para descarregar a água nos flocs.
      1. Fixe uma pipeta de 10 mL de fita no controlador da pipeta. Em seguida, prenda a ponta da pipeta ao tubo de plástico.
      2. Retire o filtro de uma pipeta de ponta aberta de 10 mL com uma pinça e prenda a pipeta ao tubo de plástico.
    2. Coloque um balde vazio no chão.
    3. Mergulhe a ponta da pipeta de ponta aberta na água. Certifique-se de mantê-lo perto da superfície da água para evitar perturbar os flocs. Aspirar o sobrenadante de água até atingir a pipeta de fita-final.
    4. Aperte o tubo de plástico na extremidade fixada à pipeta de fita e retire-a da pipeta.
    5. Coloque o tubo em um balde vazio. Libere a pressão no tubo para deixar o fluxo de água no balde vazio.
    6. Aperte o tubo de plástico para parar o fluxo de água quando o nível da água está prestes a chegar ao ímã de agitação e mova a pipeta para longe da caçamba.
    7. Agitar o balde para ressuscita os flocos e despeje-os em um saco plástico stand-up de 500 mL. Permita que os flocos se instalem por mais 1 h.
    8. Aspirar com cuidado o sobrenadante da água usando uma pipeta de 50 mL e um controlador manual da pipeta, evitando perturbar os flocs.
    9. Aspirar os flocos usando uma pipeta de 100 mL e transferi-los para um tubo de centrifugação graduado de 50 mL. Anote o volume final do concentrado de amostra e transfira 1 mL do mesmo para um tubo de 5 mL contendo a solução conservante, utilizando uma pipeta Pasteur.
      Nota: é importante que o tubo de centrifugação seja graduado para que o volume final da amostra concentrada possa ser medido da forma mais precisa possível e registado.
    10. Realize a extração de ácido nucleico no campo. Alternativamente, armazene a solução conservante contendo os vírus a 20-30 ° c por até 15 dias ou envie-os para um laboratório de referência para posterior análise.
  5. Descarte de resíduos e reutilização de materiais
    1. Adicione o conteúdo de um saquinho de agente neutralizador ao balde que contém a água descartada. Misture a água, e então, deixá-lo ainda por 30 min.
    2. Elimine a água tratada como resíduo geral.
    3. Coloque as pipetas e o tubo de plástico no interior da caçamba. Encha o balde com água e despeje o conteúdo de uma saqueta agente neutralizante.
    4. Lave-os por pelo menos 30 minutos para esterilizá-los e enxágüe-os com água limpa abundante para remover qualquer agente neutralizador remanescente.

3. extração de ácido nucleico

Nota: usar luvas e sempre usar óculos protetores durante o procedimento de extração de ácido nucleico.

  1. Operação de pipeta magnética
    1. Familiarize-se com a operação da pipeta magnética antes de realizar a extração.
  2. Extração de ácido nucleico
    1. Organize os tubos contendo os reagentes necessários para a extração em um rack, da esquerda para a direita: tampão de ligação, buffers de lavagem e tampão de eluição. Defina o número apropriado de tubos de acordo com o número de amostras ou repetições que estão sendo analisadas.
    2. Transfira 1 mL de concentrado de amostra para o tubo que contém o tampão de ligação, utilizando uma pipeta Pasteur descartável. Inverta o tubo 8x a 10x para homogeneizar a solução.
    3. Incubar a solução à temperatura ambiente durante 10 min enquanto mistura continuamente, seja usando um orbital movido a energia solar ou manualmente.
    4. Colete as partículas magnéticas usando a pipeta magnética e uma ponta limpa, que possa ser reutilizada para os três amortecedores de lavagem.
    5. Liberte as partículas magnéticas no tubo contendo 500 μL de tampão de lavagem 1. Lave-os agitando suavemente a solução com a ponta por 30 s e recolhê-los.
    6. Transfira as partículas magnéticas para o tubo contendo 600 μL de tampão de lavagem 2. Lave-os agitando suavemente a solução com a ponta por 30 s e recolhê-los.
    7. Transfira as partículas magnéticas para o tubo contendo 200 μL de tampão de lavagem 3. Lave-os agitando suavemente a solução com a ponta por 30 s e recolhê-los.
    8. Solte as partículas magnéticas no tubo que contém o tampão de eluição e descarte a ponta.
    9. Incubar a solução à temperatura ambiente durante 5 min enquanto mistura continuamente, utilizando o orbital movido a energia solar.
      Nota: a mistura das partículas magnéticas no tampão de eluição é uma etapa crucial. Em caso de falta de um orbital, misture continuamente à mão durante o tempo de incubação.
    10. Substitua a ponta na pipeta magnética por uma nova e colete as partículas magnéticas do tampão de eluição. Certifique-se de remover completamente as partículas magnéticas do tampão de eluição, uma vez que podem interferir com os métodos de detecção molecular.
    11. Descarte a ponta com as partículas anexadas a ela. Prossiga com a análise de PCR, envie o tampão de eluição para um laboratório de referência ou armazene o tampão de eluição em 4 ° c para análise posterior.

4. detecção viral com uma bateria-operado oito-tubo em tempo real termociclador

Nota: usar luvas e sempre usar óculos protetores durante o procedimento de detecção de ácidos nucleicos. Substitua as luvas para os novos ao realizar um novo experimento de PCR para evitar a contaminação cruzada.

  1. PCR quantitativo de HAdV
    1. Adicionar 14 μL de água sem nuclease aos tubos 2, 4 e 5.
    2. Adicionar 4 μL de mistura de PCR aos tubos 1-5.
    3. Adicionar 14 μL de extração de ácido nucleico da amostra a ao tubo 1 e 14 μL da amostra B ao tubo 3.
    4. Adicionar 2 μL de ácidos nucleicos extraídos da amostra a ao tubo 2 e 2 μL da amostra B ao tubo 4. Feche a tira de cinco tubos.
    5. Adicionar 14 μL de água sem nuclease aos tubos 6, 7 e 8.
    6. Adicione 4 μL desta mistura aos tubos 6, 7 e 8 e feche-os.
    7. Coloque as duas tiras no termocicer e selecione a corrida apropriada (tabela 3).
    8. Descarte o tubo de água e mantenha o ácido nucleico extraído no congelador, se possível, ou, se não, em um lugar fresco protegido da luz caso que um segundo teste precisa de ser executado.
    9. Limpe as micropipetas, a cremalheira, o material de trabalho, e todo o material corretamente com um líquido de limpeza ácido nucleico, e descarte o saco de plástico que contem a ponta, as luvas, e os tubos usados.
      Cuidado: o removedor de ácido nucleico é um líquido e um vapor muito inflamáveis. Não respire na névoa de pulverização e evite qualquer contato do líquido com os olhos ou a pele. Caso contrário, enxaguar imediatamente com água abundante e procurar aconselhamento médico.
    10. Colete os resultados e analise os dados obtidos.
  2. MS2 PCR quantitativo
    1. Adicionar 14 μL de água sem nuclease aos tubos 2, 4 e 5.
    2. Adicionar 4 μL de mistura de PCR e 0,5 μL de enzima transcriptase reversa em tubos 1-5.
    3. Adicionar 14 μL de extração de ácido nucleico da amostra a ao tubo 1 e 14 μL da amostra B ao tubo 3.
    4. Adicionar 1 μL de ácidos nucleicos extraídos da amostra a ao tubo 2 e 1 μL da amostra B ao tubo 4. Feche a tira de cinco tubos.
    5. Adicione 15,5 μL de água sem nuclease aos tubos 5, 6, 7 e 8 e feche-os.
    6. Adicionar 4 μL de mistura de PCR e 0,5 μL de enzima transcriptase reversa nos tubos 6, 7 e 8.
    7. Coloque as duas tiras no termocicer e selecione a corrida apropriada (tabela 3).
    8. Proceda conforme descrito nas etapas 4.1.8 a 4.1.10.

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Resultados

Desenvolvimento de método

Este procedimento foi desenvolvido no laboratório de contaminantes de vírus de água e alimentos com a colaboração de GenIUL e Oxfam Intermón. Compreende de três etapas diferentes. A primeira, a concentração de partículas virais, é uma adaptação de um método de floculação de leite desnatado previamente descrito12,17

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Discussão

O método VirWaTest permite a concentração de vírus e extração de ácido nucleico de amostras de água no ponto de uso por usuários não experientes. É um protocolo acessível, rápido e simples. A concentração baseia-se no princípio da floculação orgânica utilizando leite desnatado, pelo qual o pH baixo e as condições de alta condutividade tornam as proteínas do leite desnatadas agregadas em flocos os vírus adsorver. Quando o sedimento do flocos, é fácil recolhê-los, fazendo o possível concentrar 10 litros da água, visto que ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

O VirWaTest foi um projeto de pesquisa financiado pelo programa de fundos de inovação humanitária (HIF) da ELHRA (aprimorando o aprendizado & pesquisa para assistência humanitária). Os autores reconhecem as equipes de WASH que gentilmente colaboraram neste estudo. A análise de amostras no Equador foi financiada pela Oxfam Ecuador e Dirección de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-mas é um companheiro da Serra-caçador na Universidade de Barcelona.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)Solis BioDyne08-14-00001Inclui Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reações
8-Microtube Strips com CapsdD Biolab840637Perfil Baixo, Paredes Finas, Adaptadas para Baterias PCR Quantitativas e
Qualitativas e Adaptadores de Energia para AgitadorMagnético GenIUL900011674Inclui energia de carro de 12V adaptador
Balde de suporteGenIUL900011648de suporte de alumínio
, 10 LCater4You10LTRPolipropileno, inviolável, Tubo
centrífuga de cor clara, 50 mLLabBoxCTSP-E50-050Polipropileno, Estéril, Graduado, Com Saia
Ácido Cítrico 1-Hidrato, 500 gPanReac AppliChem1410181211Puro, Grau Farmacêutico, 1 Quilograma
Garrafa PET TransparenteLabBoxFPET-500-088Cor Transparente, PET, Tampa Não Incluída
Leite Desnatado Difco, 500 gBecton Dickinson232100Desidratado
, 250 mLZymo ResearchR1100-250de 250 mL
LabBoxEAS9-001-0010,3 μ m filtro, pipetas de 0,1 a 100 mL, suporte de pipeta de silicone autoclavável
Eppendorf Tube, 0,5 mLEppendorf0030121023Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 2 mLEppendorf0030120094Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 5 mLdD Biolab999542Polipropileno, Estéril, Etanol graduado
96% V/V, 1 LPanreac AppliChem361085-1611Para UV, IR  e HPLC
Pinças de LaboratórioLabBoxFORS-007-002Fino, Extremidade Curvada, L= 120 mm
Agitador MagnéticoGenIUL900017000Marcador alimentado por
bateriadD Biolab929203Preto, Ponta extra fina, Resistente à água, Secagem rápida, Para Plástico e Vidraria
Micro Rota-Rack para MicrotubosdD Biolab377824 Módulos, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm
Mini8 Ciclador de PCR em Tempo RealCoyote Biosciences, ChinaMini-8Portátil, Funciona com Fontes de Alimentação de 12V ou Baterias Externas, Dois canais, Capacidade para 8 Tubos
NucliSens Lysis BufferBiomerieux200292Reagentes para até 48 Isolamentos, Armazenar à Temperatura Ambiente
Pipeta Sorológica de Ponta Aberta, 10 mLDeltalab900136NEstéril, Embalado Individualmente (Papel/Plástico)
Tampa de Rosca PE PP28LabBoxTP28-004-020Para Garrafas PET
Faixa Indicadora de pHLabBoxWSPH-001-001Faixa pH 2.8 a pH 4.4, 50 Tiras por Pacote
Tubo de Ensaio de PlásticoQuimikals300913Inclui
Tampa Pipeta de Polietileno PasteurLabBoxPIPP-003-500Graduado, 7 mL Volume Total, Frasco de rosca de polipropileno não estéril
com tampa de rosca, 150 mLDeltalab 409726Tampa de rosca, estéril, graduado até 100 mL
Frasco de rosca de polipropileno com tampa de rosca, 60 mLDeltalab409526GTampa de rosca, estéril, graduada até 50 mL Detergente
em pó em pó-Sabão em pó comum para lavar roupas
Cabos de alimentação para agitador magnéticoGenIUL900011692Conexão entre baterias e agitadores magnéticos
QuickPick Ferramenta MagnéticaBioNobile24001Ferramenta portátil para partículas magnéticas
Pontas QuickPick na CaixaBioNobile24296Livre de RNase, Autoclavado, 96 Unidades
QuickPick XL gDNA Partículas MagnéticasBioNobileSN511003.2 mL
Sais MarinhosSigma-AldrichS9883-500GUma mistura de sal artificial que se assemelha muito à composição dos sais dissolvidos da água do oceano
Tubo de SiliconeLabBoxSILT-006-005Rolo de 5 Metros, Interno  ø x Externo  ø= 6 x 10 mm
Pellets de Hidróxido de Sódio, 98,5 - 100,5%VWR Produtos Químicos28244295Pellets,
Plataforma Rotativa SolarSOL-EXPERT Group70020Placa de Acrílico, 10 RPM, Suporta até 300 Gramas
SOLIScript Kit de Sonda de 1 passoSolis BioDyne08-57-00250Inclui Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) e 40x One-Step SOLIScript Mix (Enzima Transcriptase Reversa), 250 Reações
SPEEDTOOLS Kit de Extração de Vírus RNABioTools21.141-4197Inclui o tampão BAW (tampão de lavagem 1), o tampão BAV3 (tampão de lavagem 2 e 3) e o tampão BRE (tampão de eluição) da BioTools.
Ímã de agitação octoédrico SpinBardD Biolab045926Pivot Ring, L x  ø = 38 x 8 mm,
Pipeta sorológica com ponta de fita azul, 10 mLDeltalabPN10E1Estéril, Embalada Individualmente (Papel/Plástico)
Pipeta sorológica com ponta de fita, 50 mLDeltalab900043Estéril, Embalada individualmente (Papel/Plástico)
Termi-DNA-Tor - Removedorde Ácido NucleicoBioTools22001-4291Removedor de ácidos nucleicos, bactérias, fungos e micoplasma de materiais e superfícies, 450 mL
de Reagente de Biologia Molecular de Água, 1LSigma-AldrichW4502-1LLivre de Nuclease e Protease, 0.1 μ m Saco
Whirl-Pak filtrado, 540 mLDeltalab200361Fundo estável
Saco liso com fecho de correrLabBoxBZIP-080-100Polietileno, C x L= 120 x 80 mm
Balde de Escudo de DNA/RNA Meio de Preservação de DNA/RNA , Controlador de Pipeta Easy9 de 1 Kg

Referências

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