VirWaTest, um método de ponto de uso para a detecção de vírus em amostras de água

Resumo

Aqui nós apresentamos VirWaTest, que é um método simples, disponível e portátil para a concentração e a deteção dos vírus das amostras da água no ponto do uso.

Resumo

Vírus excretados por seres humanos e animais podem contaminar fontes de água e representam um risco para a saúde humana quando esta água é usada para beber, irrigação de alimentos, lavagem, etc. O indicador clássico de bactérias fecais nem sempre verifica a presença de patógenos virais para que a detecção de patógenos virais e indicadores virais seja relevante para adotar medidas de mitigação de riscos, especialmente em cenários humanitários e em áreas onde as manifestações virais transmitidas pela água são freqüentes.

Atualmente, vários testes comerciais que permitem a quantificação de bactérias indicadoras fecais (FIB) estão disponíveis para testes no ponto de uso. No entanto, tais testes comerciais não estão disponíveis para a detecção de vírus. A detecção de vírus em amostras de água ambiental requer a concentração de vários litros em volumes menores. Além disso, uma vez concentrada, a detecção de vírus depende de métodos como extração de ácidos nucleicos e detecção molecular (por exemplo, reação em cadeia da polimerase [PCR]-ensaios baseados) dos genomas virais.

O método descrito aqui permite a concentração de vírus de amostras de água de 10 L, bem como a extração de ácidos nucleicos virais no ponto de uso, com equipamentos simples e portáteis. Isso permite o teste de amostras de água no ponto de uso para vários vírus e é útil em cenários humanitários, bem como em qualquer contexto onde um laboratório equipado não está disponível. Alternativamente, o método permite concentrar os vírus presentes em amostras de água e o transporte do concentrado para um laboratório à temperatura ambiente para posterior análise.

Introdução

Durante as primeiras fases de qualquer emergência humanitária, o acesso a fontes de água potável, saneamento e higiene são fundamentais para a sobrevivência dos afetados. Portanto, a monitorização da qualidade da água é uma prioridade para prevenir surtos de águas. É bem sabido que a água contaminada é freqüentemente a origem das doenças, mas muitas vezes é difícil determinar as fontes de surtos virais, como o vírus da hepatite E (HEV), mesmo com a disponibilidade de métodos laboratoriais convencionais. O controle da qualidade da água é baseado na quantificação de FIB^1,2,3,4<....

Protocolo

1. preparação e embalagem

Nota: os materiais/equipamentos a serem embalados estão listados na tabela 1. Use luvas para manusear os reagentes necessários para o controle do processo, os reagentes de concentração, os reagentes de extração de ácido nucleico e os reagentes de detecção. Use óculos protetores para manusear os reagentes necessários para a extração de ácido nucleico.

1. Controle de processo
   1. Prepare a cultura de ações do bacteriófago de MS2 (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) contendo 1 x 10¹⁰ pfu/ml em laboratório seguindo o procedimento ISO 10705-1:1995

Resultados

Desenvolvimento de método

Este procedimento foi desenvolvido no laboratório de contaminantes de vírus de água e alimentos com a colaboração de GenIUL e Oxfam Intermón. Compreende de três etapas diferentes. A primeira, a concentração de partículas virais, é uma adaptação de um método de floculação de leite desnatado previamente descrito^12,17

Discussão

O método VirWaTest permite a concentração de vírus e extração de ácido nucleico de amostras de água no ponto de uso por usuários não experientes. É um protocolo acessível, rápido e simples. A concentração baseia-se no princípio da floculação orgânica utilizando leite desnatado, pelo qual o pH baixo e as condições de alta condutividade tornam as proteínas do leite desnatadas agregadas em flocos os vírus adsorver. Quando o sedimento do flocos, é fácil recolhê-los, fazendo o possível concentrar 10 litros da água, visto que .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)	Solis BioDyne	08-14-00001	Inclui Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reações
8-Microtube Strips com Caps	dD Biolab	840637	Perfil Baixo, Paredes Finas, Adaptadas para Baterias PCR Quantitativas e
Qualitativas e Adaptadores de Energia para Agitador	Magnético GenIUL	900011674	Inclui energia de carro de 12V adaptador
Balde de suporte	GenIUL	900011648	de suporte de alumínio
, 10 L	Cater4You	10LTR	Polipropileno, inviolável, Tubo
centrífuga de cor clara, 50 mL	LabBox	CTSP-E50-050	Polipropileno, Estéril, Graduado, Com Saia
Ácido Cítrico 1-Hidrato, 500 g	PanReac AppliChem	1410181211	Puro, Grau Farmacêutico, 1 Quilograma
Garrafa PET Transparente	LabBox	FPET-500-088	Cor Transparente, PET, Tampa Não Incluída
Leite Desnatado Difco, 500 g	Becton Dickinson	232100	Desidratado
, 250 mL	Zymo Research	R1100-250	de 250 mL
	LabBox	EAS9-001-001	0,3 μ m filtro, pipetas de 0,1 a 100 mL, suporte de pipeta de silicone autoclavável
Eppendorf Tube, 0,5 mL	Eppendorf	0030121023	Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 2 mL	Eppendorf	0030120094	Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 5 mL	dD Biolab	999542	Polipropileno, Estéril, Etanol graduado
96% V/V, 1 L	Panreac AppliChem	361085-1611	Para UV, IR  e HPLC
Pinças de Laboratório	LabBox	FORS-007-002	Fino, Extremidade Curvada, L= 120 mm
Agitador Magnético	GenIUL	900017000	Marcador alimentado por
bateria	dD Biolab	929203	Preto, Ponta extra fina, Resistente à água, Secagem rápida, Para Plástico e Vidraria
Micro Rota-Rack para Microtubos	dD Biolab	37782	4 Módulos, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm
Mini8 Ciclador de PCR em Tempo Real	Coyote Biosciences, China	Mini-8	Portátil, Funciona com Fontes de Alimentação de 12V ou Baterias Externas, Dois canais, Capacidade para 8 Tubos
NucliSens Lysis Buffer	Biomerieux	200292	Reagentes para até 48 Isolamentos, Armazenar à Temperatura Ambiente
Pipeta Sorológica de Ponta Aberta, 10 mL	Deltalab	900136N	Estéril, Embalado Individualmente (Papel/Plástico)
Tampa de Rosca PE PP28	LabBox	TP28-004-020	Para Garrafas PET
Faixa Indicadora de pH	LabBox	WSPH-001-001	Faixa pH 2.8 a pH 4.4, 50 Tiras por Pacote
Tubo de Ensaio de Plástico	Quimikals	300913	Inclui
Tampa Pipeta de Polietileno Pasteur	LabBox	PIPP-003-500	Graduado, 7 mL Volume Total, Frasco de rosca de polipropileno não estéril
com tampa de rosca, 150 mL		Deltalab 409726	Tampa de rosca, estéril, graduado até 100 mL
Frasco de rosca de polipropileno com tampa de rosca, 60 mL	Deltalab	409526G	Tampa de rosca, estéril, graduada até 50 mL Detergente
em pó em pó	-		Sabão em pó comum para lavar roupas
Cabos de alimentação para agitador magnético	GenIUL	900011692	Conexão entre baterias e agitadores magnéticos
QuickPick Ferramenta Magnética	BioNobile	24001	Ferramenta portátil para partículas magnéticas
Pontas QuickPick na Caixa	BioNobile	24296	Livre de RNase, Autoclavado, 96 Unidades
QuickPick XL gDNA Partículas Magnéticas	BioNobile	SN51100	3.2 mL
Sais Marinhos	Sigma-Aldrich	S9883-500G	Uma mistura de sal artificial que se assemelha muito à composição dos sais dissolvidos da água do oceano
Tubo de Silicone	LabBox	SILT-006-005	Rolo de 5 Metros, Interno  ø x Externo  ø= 6 x 10 mm
Pellets de Hidróxido de Sódio, 98,5 - 100,5%	VWR Produtos Químicos	28244295	Pellets,
Plataforma Rotativa Solar	SOL-EXPERT Group	70020	Placa de Acrílico, 10 RPM, Suporta até 300 Gramas
SOLIScript Kit de Sonda de 1 passo	Solis BioDyne	08-57-00250	Inclui Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) e 40x One-Step SOLIScript Mix (Enzima Transcriptase Reversa), 250 Reações
SPEEDTOOLS Kit de Extração de Vírus RNA	BioTools	21.141-4197	Inclui o tampão BAW (tampão de lavagem 1), o tampão BAV3 (tampão de lavagem 2 e 3) e o tampão BRE (tampão de eluição) da BioTools.
Ímã de agitação octoédrico SpinBar	dD Biolab	045926	Pivot Ring, L x  ø = 38 x 8 mm,
Pipeta sorológica com ponta de fita azul, 10 mL	Deltalab	PN10E1	Estéril, Embalada Individualmente (Papel/Plástico)
Pipeta sorológica com ponta de fita, 50 mL	Deltalab	900043	Estéril, Embalada individualmente (Papel/Plástico)
Termi-DNA-Tor - Removedor	de Ácido NucleicoBioTools	22001-4291	Removedor de ácidos nucleicos, bactérias, fungos e micoplasma de materiais e superfícies, 450 mL
de Reagente de Biologia Molecular de Água, 1L	Sigma-Aldrich	W4502-1L	Livre de Nuclease e Protease, 0.1 μ m Saco
Whirl-Pak filtrado, 540 mL	Deltalab	200361	Fundo estável
Saco liso com fecho de correr	LabBox	BZIP-080-100	Polietileno, C x L= 120 x 80 mm

Balde de Escudo de DNA/RNA Meio de Preservação de DNA/RNA , Controlador de Pipeta Easy9 de 1 Kg