Um modelo animal da dieta-induzido simples e de confiança do roedor para o esteatohepatite não alcoólico (Nash) é descrito, conseguido com a carcaça non-SPF dos animais e a administração de uma dieta high-fat específica. Nós descrevemos a identificação de subconjuntos hepatic e adiposos da pilha imune para recapitular condições imunológicas humanas expondo ratos aos germes ambientais.
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Artigo de método
Um modelo murino avançado para esteatohepatite não alcoólica em associação com diabetes tipo 2
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A obesidade está associada à inflamação crônica de baixo grau e à resistência insulínica, contribuindo para uma crescente prevalência de doenças metabólicas crônicas, como diabetes tipo 2 e esteatohepatite não alcoólica (NASH). Pesquisas recentes estabeleceram que as células imunes pró-inflamatórias infiltram o tecido adiposo hipertrófico obeso e o fígado. Dada a importância emergente das células imunes no contexto da homeostase metabólica, há uma necessidade crítica de quantificar e caracterizar sua modificação durante o desenvolvimento de diabetes tipo 2 e NASH. Entretanto, os modelos animais que induzem características patofisiológicas típicas do NASH humano são escassos.
Neste artigo, nós fornecemos um protocolo detalhado para identificar os subconjuntos da pilha imune isolados do fígado e do tecido adiposo em um modelo de rato de confiança de NASH, estabelecido por ratos da dieta high-fat da carcaça (HFD) condições patogénicos não específicas-livres (SPF) sem barreira por pelo menos sete semanas. Demonstramos o manuseio de camundongos em condições não-SPF, digestão dos tecidos e identificação de macrófagos, células do assassino natural (NK), células dendríticas, subconjuntos de células B e T por citometria de fluxo. Parcelas representativas de citometria de fluxo de camundongos SPF HFD e camundongos não-SPF são fornecidas. Para obter dados confiáveis e interpretáveis, o uso de anticorpos, métodos precisos e precisos para a digestão dos tecidos e a boa gating em experimentos de citometria de fluxo são elementos críticos.
A intervenção para restaurar a exposição fisiológica de antígenos em camundongos por habitá-los em condições não-SPF e exposição inespecífica a antígenos microbianos poderia fornecer uma ferramenta relevante para investigar a ligação entre alterações imunológicas, induzida por dieta obesidade e complicações relacionadas a longo prazo.
Introdução
A obesidade é um transtorno multifatorial e um importante fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardíacas, AVC, esteatohepatite não alcoólica (NASH), diabetes tipo 2 (DM2) e alguns tipos de câncer. A prevalência da obesidade está aumentando rapidamente globalmente. Hoje, 2.100.000.000 pessoas — quase 30% da população mundial — são obesas ou com sobrepeso1. A resistência à insulina associada à obesidade pode levar a dm2, quando as células beta de Islet pancreáticas esgotadas não compensam a necessidade aumentada de insulina para manter a homeostase da glicose2.
O tecido adiposo é composto de vários tipos de células, incluindo adipócitos, células endoteliais, fibroblastos e células imunes. Durante a progressão da obesidade, as alterações no número e atividade das células imunes podem levar a inflamação de baixo grau do tecido adiposo hipertrófico3,4. Especificamente, verificou-se que a ingestão excessiva de energia, acompanhada de níveis cronicamente elevados de glicose no sangue, triglicérides e ácidos graxos livres, leva à hipóxia adipócitos, estresse retículo endoplasmático, função mitocondrial prejudicada e secreção de citocinas aprimorada, resultando na ativação de células imunes adiposas pró-inflamatórias5,6. Pesquisas anteriores centraram-se principalmente na imunidade inata, mas as células imunes mais recentemente adaptativas (células T e B) surgiram como importantes reguladores da homeostase da glicose. Possuem células inflamatórias (incluindo células CD8+ t, Th1 e B) ou principalmente funções regulatórias (incluindo células reguladoras t (TREG), células Th2) e podem exacerbar ou proteger contra a resistência à insulina7,8 , noveanos.
Além disso, vários mecanismos foram propostos para explicar como a obesidade aumenta a esteatohepatite, incluindo o aumento da produção de citocinas pelo tecido adiposo10. NASH, a forma progressiva de doença hepática gordurosa não alcoólica e uma grande carga de saúde em países desenvolvidos, é histologicamente caracterizada por hepatócitos balados, acúmulo de lipídios, fibrose e inflamação pericelular e pode progredir para cirrose, doença hepática em estágio terminal ou carcinoma hepatocelular. Vários regimes (por exemplo, a dieta deficiente de metionina e colina11) são conhecidos por induzir a patologia hepática semelhante a Nash em modelos animais não humanos, mas a maioria dessas abordagens não recapitulam as condições humanas de Nash e seus metabólicos consequências, uma vez que necessitam de nocaute genético específico, manipulações dietéticas não fisiológicas ou falta de resistência insulínica típica da NASH humana. Além disso, nossa compreensão dos mecanismos subjacentes de doenças metabólicas baseia-se atualmente em experimentos realizados com camundongos laboratoriais alojados em condições padrão específicas de patógenos livres (SPF). Essas instalações de barreira são anormalmente higiênicas e não consideram a diversidade microbiana que os seres humanos têm de encontrar, o que pode explicar dificuldades no processo de tradução de estudos em animais para abordagens clínicas12,13 , o 14.
Para investigar os subconjuntos diferentes da pilha imune no tecido adiposo e no fígado durante o desenvolvimento da resistência de insulin e do NASH em um modelo avançado do rato que reproduz circunstâncias imunológicas humanas, os ratos foram alojados em gaiolas individuais no semi estéril condições sem uma barreira. Os ratos abrigados condições expostas do antígeno desenvolveram a patologia do fígado NASH-like já após 15 semanas da alimentação High-Fat da dieta (HFD)13. Comparados aos ratos SPF idade-combinados desenvolveram o Steatosis macrovesicular, a infiltração hepatic e a ativação de pilhas imunes.
Este manuscrito descreve uma análise de citometria de fluxo robusta para definir e contar subconjuntos de células imunes do tecido adiposo do camundongo e do fígado em um modelo de NASH. A análise da citometria do fluxo permite a deteção de parâmetros múltiplos de pilhas individuais simultaneamente no contraste ao RT-PCR ou às aproximações immunohistochemistry.
Em suma, nosso estudo oferece um modelo de mouse de HFD de curto prazo para investigar o desenvolvimento de resistência insulínica e NASH e os mecanismos subjacentes que também exibem fidelidade à condição humana.
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Protocolo
Este estudo foi realizado de acordo com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório do Instituto Nacional de saúde e da lei de bem-estar animal, a supervisão do nosso Comitê institucional de cuidado e uso dos animais. Os protocolos animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas institucionais da Charité Berlin, Alemanha, e foram aprovados pela Landesamt für Gesundheit und Soziales e cumprem com as diretrizes do ARRIVE.
1. modelo animal dieta-induzido de Steatohepatitis
- Transferir camundongos (C57Bl/6J, macho) para habitação não-SPF com a idade de 4 semanas e expô-los continuamente a uma ampla gama de patógenos/antígenos ambientais. Garantir a exposição pelo manuseio diário dos animais de laboratório como antígenos são distribuídos por passagem de ar desta forma.
- Mantenha os ratos (C57Bl/6J, macho, 12 semanas velho) em sistemas de enjaulamento abertos com filtros convencionais em um ciclo claro/escuro de 12 h:12 h em uma temperatura de 22 ° c. Não irradiar ou autoclave dieta experimental e roupa de cama. Acesso a instalações de habitação animal sem máscara ou hairnet. Portas abertas entre os quartos de animais. Não use um chuveiro de ar.
- Garantir a manipulação diária dos animais de laboratório e salas de comutação em uma base regular para que os antígenos são distribuídos por passagem de ar. Complemente a carcaça suja com exposição microbiana diária não específica aos antígenos da cama de animais de laboratório de mamíferos alojados nos quartos ao lado dos ratos do laboratório.
- Meça proporções da memória CD44-CD62L- efetor CD4+ e células T CD8+ no sangue e baço usando citometria de fluxo (como descrito em refefence13).
Nota: Neste sentido nós definimos um aumento de 20% de pilhas CD8+ t da memória efetoras das pilhas de CD8+ t como a evidência da suficiente exposição microbiana. - Iniciar HFD (60 kJ% de gordura, 19 kJ% de proteínas e 21 kJ% de carboidratos e consumo de água ad libitum com teor de sacarose 6% com ratos machos de cinco semanas de idade C57Bl/6J por 7-15 semanas. O HFD deve conter 60% kJ da gordura (como descrito acima) a fim induzir o desenvolvimento da resistência de insulin durante todo o curso do experimento.
Nota: A coloração de hematoxilina deve ser realizada e as características histológicas como Balonismo de hepatócitos, corpos de Mallory Denk, infiltração de células imunológicas e esteatose macrovesicular devem ser encontradas para demonstrar patologia hepática semelhante a NASH (como mostrado na referência 13).
2. preparação de reagentes e soluções
- Prepare 70% de etanol, fosfato tamponado salina (PBS, sem cálcio e magnésio) suplementado com 0,5% BSA e ACK (amônia-cloreto-potássio) tampão de Lise.
-
Tampão de coloração
- Dissolva 10 mL de soro de bezerro fetal (FCS) em 500 mL de PBS para obter 2% de FCS PBS. Coloque o tampão de coloração no gelo antes de usar.
- Armazene a solução em um frasco plástico em 4 ° c.
-
Solução de Collagenase para digestão de tecidos adiposos
- Dissolva 2,5 g de albumina sérica bovina (BSA) em 500 mL de PBS para obter um 0,5% BSA/PBS.
- Dissolva 74,5 g de CaCl2 em 10 mL de 0,5% BSA/PBS para obter uma solução de CAcl2 de 10 mm.
- Adicionar 1 mg de colagenase tipo II (ver tabela de materiais) para cada ml de 0,5% BSA com 10 mm CAcl2 PBS.
- Prepare 3 mL de solução condensada de colagenase por g de amostra de tecido adiposo. Prepare a solução de colagenase fresca para cada isolamento.
-
Solução de Collagenase para digestão do tecido hepático
- Dissolver 2,5 g de BSA em 500 mL de Hank ́s equilibrado solução de sal (HBSS) para obter 0,5% BSA HBSS.
- Adicionar 10 mL de FCS em 500 mL de 0,5% BSA/HBSS para obter 2% FCS 0,5% BSA/HBSS.
- Adicionar 0,5 mg de colagenase tipo IV (ver tabela de materiais) para cada ml de 2% fcs 0,5% BSA/HBSS.
- Adicionar 0, 2 mg de DNase por mL de solução de colagenase de 2% FCS 0,5% BSA/HBSS.
- Prepare 13 mL de solução de digestão por colagenase por amostra de tecido hepático.
- Prepare a solução de colagenase fresca para cada isolamento.
3. geração de suspensões de célula única
-
Digestão dos tecidos adiposos
- Euthanize ratos através da anestesia do isoflurano seguido pela deslocação cervical. Pulverize o peito com 70% de etanol. Faça com cuidado uma incisão central de 5-6 cm através do tegumento e da parede abdominal ao longo de todo o comprimento da caixa torácica para expor a cavidade pleural e o coração.
Nota: Não danifique os órgãos subjacentes e mantenha as pontas das tesouras para cima. - Injetar pelo menos 10 mL de solução salina de 0,9% no ápice do ventrículo esquerdo usando uma agulha de 26 G.
Nota: A perfusão bem sucedida observa-se descascando o fígado. - Abra a cavidade peritoneal com tesouras e corte as almofadas de gordura perigonadal em cada lado com tesouras curvadas finas. Tecidos de dissecar gonadal com tesouras curvadas finas e pesar o tecido adiposo.
- Realize a dissociação mecânica usando tesouras e corte o tecido adiposo em partes finas em um prato de Petri em 4 ° c. Transfira o tecido adiposo para 50 mL de tubos de centrífuga cônicos e enxague o prato de Petri com 1 mL de 0,5% de BSA/PBS.
- Adicionar 3 mL de solução de digestão de tecido adiposo (conforme preparado na etapa 2,3) por grama de tecido adiposo. Incubar a solução de tecido adiposo a 37 ° c durante 20 min agitação suave (200 rpm).
- Adicionar 5 mL de 0,5% de BSA/PBS por grama de tecido adiposo e colocar no gelo. Triturar a solução inúmeras vezes com uma pipeta sorológica de 10 mL e passá-la através de um filtro (100 μm) com o auxílio de um êmbolo.
- Centrifugue a 500 x g durante 10 min a 4 ° c.
- Remova a fração de adipócitos flutuante por pipetagem. Resuspend a pelota da pilha (fração vascular stromal) em 1 mL do amortecedor da lise do ACK (veja a tabela de materiais). Adicionar 10 mL de 2% FCS PBS.
- Centrifugue a 500 x g durante 10 min a 4 ° c.
- Sobrenadante decant e pelota da pilha do Ressuspender em 250 μl do PBS de 2% FCS.
- Conte o número de células viáveis em um hemocitômetro usando a exclusão azul de trypan.
- Euthanize ratos através da anestesia do isoflurano seguido pela deslocação cervical. Pulverize o peito com 70% de etanol. Faça com cuidado uma incisão central de 5-6 cm através do tegumento e da parede abdominal ao longo de todo o comprimento da caixa torácica para expor a cavidade pleural e o coração.
-
Digestão do tecido hepático
- Armazene o fígado em um tubo de centrífuga cônico preenchido com PBS e transporte no gelo.
- Realize a dissociação mecânica usando selos da seringa em um prato de Petri em 4 ° c. Coloque o tecido do fígado dissecado em um 50 mL tubo de centrífuga cônico contendo 10 mL de solução de digestão de fígado quente. Enxágüe o prato de Petri com 3 mL de solução de digestão hepática.
- Incubar a solução de tecido hepático a 37 ° c durante 20 min agitação suave (200 rpm).
- Adicionar 20 mL de HBSS. Triturar a solução inúmeras vezes com uma pipeta sorológica de 10 mL e passá-la através de um filtro (100 μm) com o auxílio de um êmbolo.
- Centrifugue a 500 x g durante 10 min a 4 ° c. Decantar o sobrenadante e ressuspender a pelota da pilha em 20 mL de HBSS.
- Centrifugue a 30 x g durante 1 min à temperatura ambiente para remover a matriz de hepatócitos. Descarte o pellet da célula.
- Centrifugue o sobrenadante a 500 x g durante 10 min a 4 ° c. Resuspend o pellet em 10 mL de 33% de baixa viscosidade densidade médio gradiente solução (ver tabela de materiais) em HBSS seguido de centrifugação (800 x g; 30 min; temperatura ambiente; sem freio).
- Resuspender o pellet em 1 mL de tampão de Lise ACK e incubar durante 4 min à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 10 mL de HBSS.
Nota: Para descartar o sobrenadante aspirar o sobrenadante com interfase (hepatócitos) com muito cuidado com uma pipeta de transferência (tanto quanto possível, sem tomar o pellet com células imunes e eritrócitos). - Passe as células através de um filtro de 30 μm em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL e centrifugue a 500 x g por 10 min a 4 ° c. Sobrenadante decant e pelota da pilha do Ressuspender em 250 μl do PBS de 2% FCS.
- Conte o número de células viáveis em um hemocitômetro usando a exclusão azul de trypan.
4. coloração de superfície
- Prepare a mistura de anticorpos para subconjuntos de células T (painel 1) e células imunes inatas (painel 2), conforme descrito na tabela 1 e tabela 2. Os volumes são otimizados para uma amostra (100 μL) em relação às concentrações de anticorpos.
Nota: Os linfócitos e as células imunes inatas apresentam diferenças na autofluorescência e devem ser analisados separadamente. - Use até 3 x 106 células em 100 μl em um tubo de poliestireno FACS para coloração de superfície. Para bloquear os receptores FC adicionar 10 μL de anticorpo CD16/CD32 (diluído 1:100) e incubar por 10 min no gelo. Use uma amostra de controle negativo não manchada para ajustar a dispersão lateral (SSC) e a dispersão direta (FSC) para determinar a localização da população de células negativas.
- Vortex e adicionar o volume apropriado de mistura de anticorpos para o painel 1 e painel 2. Adicionar 1 μL de corante de viabilidade a cada amostra para permitir a discriminação de células vivas e mortas. Incubar durante 20 min a 4 ° c e protegido da luz.
- Lave duas vezes com 2 mL de PBS 2% FCS e centrifugue a 300 x g durante 5 min a 4 ° c.
- Resuspender o pellet celular em 300 μL de PBS 2% FCS e armazenar a 4 ° c até a análise FACS.
Nota: Antes de iniciar a medição passar as células através de 30 μm filtro de células em poliestireno FACS tubo e vórtice. A citometria de fluxo foi realizada com células rotuladas armazenadas em PBS 2% FCS a 4 ° c para 1-3 h. as células devem ser analisadas o mais rápido possível para resultados otimizados.
5. compensação de citometria de fluxo, aquisição e gating
- Executar amostra de controle negativo não manchado para definir o FSC e SSC e ajustar as tensões do citometro de fluxo para detectar populações de leucócitos e distinguir entre detritos e células viáveis. Exclua detritos e células mortas.
Nota: A viabilidade das suspensões da pilha do fígado pôde ser mais baixa do que a viabilidade das suspensões da pilha do tecido adiposo perigonadal devido a uma etapa adicional da separação da densidade. - Funcione únicas amostras manchadas do controle para a compensação multi-color.
Nota: Os grânulos da captação do anticorpo podiam igualmente ser usados para ajustar para a sobreposição espectral se o número de pilhas de uma população da pilha do interesse é demasiado baixo compensar usando pilhas. Para detectar possíveis sinais de autofluorescência da fluorescência das células menos um (FMO) controles para cada anticorpo são recomendados, mas não foram aplicados neste protocolo. - Inicie a medição, colete o número apropriado de eventos (pelo menos 50.000 eventos) e registre dados experimentais.
- Exporte arquivos de dados FCS para análise e defina a estratégia de gating. Porta em CD45+ leucócito para identificar populações de pilha subseqüentes.
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Resultados
O protocolo descrito permite a caracterização de marcadores de superfície de células imunes inatas e adaptativas isoladas do tecido adiposo perigonadal murino e do fígado em um modelo de NASH induzido pela dieta. Neste modelo, o NASH foi induzido pela administração de HFD mais sacarose (6%) em água potável por 7 a 15 semanas em camundongos C57Bl/6J, conforme relatado anteriormente13. É importante ressaltar que os camundongos foram alojados em condições semiestéreis e, assim, expostos a antígenos a...
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Discussão
A esteatohepatite tem forte associação com anormalidades metabólicas como obesidade, resistência insulínica e dislipidemia15. Os estudos múltiplos indicam que a inflamação do tecido adiposo pode conduzir a patogénese do tipo-diabetes 2, incluindo níveis alterados de pilhas do sistema imune inata e adaptável4,5,16,17 . Além disso, verificou-se que a obesidade modula a ati...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos Anke Jurisch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte e Cornelia Heckmann por assistência com procedimentos experimentais e Benjamin Tiburzy de Biolegend para comentários úteis sobre a estratégia de gating. J.S. foi apoiado pelo Grant de Helmholtz (ICEMED). Este estudo foi apoiado por subsídios da unidade de pesquisa clínica do Instituto de saúde de Berlim (BIH), o "BCRT-Grant" pelo Ministério Federal alemão de educação e pesquisa e da Fundação Einstein. -B. e H.-D.V. são financiados por FOR2165.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 100 µ Filtros de células M | Seringa Falcon | 352340 | |
| 1 mL | BD | ||
| 26 G x 5/8 agulhas | BD | ||
| Placas de Petri de 35 mm | Falcon | 353001 | |
| 40 µ Filtros de células M | Falcon | 352340 | |
| ACK tampão de lise | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. Nº 103127) | |
| Software de análise | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Anticorpo Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. Nº 117309) | |
| APC anti-camundongo KLRG1 (MAFA) Anticorpo | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Anticorpo | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. Nº 135023) |
| BV421 anti-camundongo F4/80 Anticorpo Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. Nº 123131) | |
| BV605 anti-camundongo CD279 (PD-1) Anticorpo | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. Nº 135219) |
| BV605 anti-camundongo NK-1.1 Anticorpo | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. Nº 108739) |
| BV650 anti-camundongo/humano CD11b Anticorpo | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. Nº 101239) |
| BV711 anti-camundongo/humano B220 Anticorpo | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. Nº 103255) |
| BV785 anticorpo CD8a anti-camundongo | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. Nº 100749) |
| C57Bl / 6J camundongos, macho, 5 semanas de idade | Forschungseinrichtungen fü r experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité - Universitä tsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Grau Comprovado | SERVA | ||
| colagenase tipo I | Worthington | ||
| Tubo de centrífuga cônico 15mL | de | cônico Falcon | |
| 50 mL | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | ||
| Soro fetal bovino | Filtro Biochrom | S0115 | |
| 30µ m | Celltrics | ||
| Anticorpo CD3 anti-camundongo FITC | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. Nº 100203) |
| Citometria de fluxo | BD-LSR Fortessa | ||
| Fórceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| Dieta rica em gorduras | SSNIF | E15741– 34 | 60 kJ% de gordura, 19  kJ% de proteínas e 21 kJ% de tesouras de |
| microdissecação | Sigma-Aldrich | S3146 | usado para fins de dissecação |
| Anticorpo anti-camundongo PE CD25 | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. Nº 101903) |
| PE/Cy7 anti-camundongo CD62L Anticorpo | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Anticorpo | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. Nº 107629) |
| PE/Dazzle 594 anticorpo CD4 anti-camundongo | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. Nº 100565) |
| Solução de Percoll | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Anticorpo Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. Nº 103031) | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Anticorpo | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. Nº 108427) |
| Solução salina tamponada com fosfato | Tubos | Gibco 12559069 | |
| com tampa de filtro de célula | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Kit de Viabilidade Fixável | Biolegend | 423105 | mancha de viabilidade |
Referências
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Reimpressões e permissões
