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Artigo de método

Inativação química da E3 ubiquitina ligase Cereblon por Homo-PROTACs à base de Pomalidomida

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DOI:

10.3791/59472

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15 de maio de 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine III, University Hospital Ulm, 2Pharmaceutical Institute, Pharmaceutical Chemistry I, University of Bonn

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este trabalho descreve a síntese e caracterização de um Homo-PROTAC bifuncional, com base em pomalidomida, como uma nova abordagem para induzir a ubiquitinação e a degradação do E3 ubiquitina ligase Cereblon (CRBN), alvo de análogos da talidomida.

Resumo

Os fármacos imunomoduladores (IMiDs) talidomida e seus análogos, lenalidomida e pomalidomida, todos os fármacos aprovados pela FDA para o tratamento do mieloma múltiplo, induzem a ubiquitinação e degradação dos fatores de transcrição linfoide Ikaros (IKZF1) e Aiolos (IKZF3) através da ligase da ubiquitina do Cereblon (crbn) E3 para a degradação degradação. Imids têm sido utilizados recentemente para a geração de proteólise bifuncional visando quimeras (protacs) para direcionar outras proteínas para a ubiquitinação e degradação degradação pela ligase da crbn E3. Foram projetados e sintetizados os PROTACs homobifuncionais à base de pomalidomida e analisados sua capacidade de induzir a ubiquitinação e degradação autodirigida de CRBN. Aqui, o CRBN serve como ambos, a ligase da ubiquitina E3 e o alvo ao mesmo tempo. O composto de Homo-PROTAC 8 degrada o crbn com uma potência elevada com somente efeitos permanecendo mínimos em IKZF1 e em IKZF3. A inactivação de crbn pelo composto 8 não teve nenhum efeito na viabilidade da pilha e na proliferação de linhas de pilha múltiplas diferentes do mieloma. Este Homo-ProTac AB roga os efeitos de imids em pilhas múltiplas do mieloma. Portanto, nossos compostos à base de pomalidomida bacteriana podem ajudar a identificar os substratos endógenos e as funções fisiológicas da crbn e investigar o mecanismo molecular dos imids.

Introdução

Os fármacos imunomoduladores (IMiDs) talidomida e seus análogos, lenalidomida e pomalidomida, todos aprovados para o tratamento do mieloma múltiplo, ligam-se ao E3 ubiquitina ligase Cereblon (CRBN), um adaptador de substrato para cullin4A-RING E3 ligase de ubiquitina (CRL4crbn)1,2,3. A vinculação de imids aumenta a afinidade deCRL4 crbn aos fatores de transcrição linfoide Ikaros (IKZF1) e Aiolos (IKZF3), levando à sua ubiquitinação e degradação (Figura 1)4,5, 6 anos de , 7 anos de , 8. Since IKZF1 e IKZF3 são essenciais para pilhas múltiplas do mieloma, seus resultados da inactivação na inibição do crescimento. SALL4 foi encontrado recentemente como um neosubstrato Imid-induzido adicional do crbn que é provável responsável para o teratogenicidade e a catástrofe assim chamada de Contergan nos 1950s causados por talidomida9,10. Em contraste, a caseína quinase 1 α (CK1α) é um substrato específico da lenalidomida de CRBN que está implicado no efeito terapêutico na síndrome mielodisplásica com deleções do cromossomo 5q11.

A capacidade de pequenas moléculas para atingir uma proteína específica para a degradação é uma implicação emocionante para o desenvolvimento de drogas modernas. Embora o mecanismo de talidomida e seus análogos foi descoberto após seu primeiro uso em seres humanos, assim chamado PROteólise targeting Chimeras (protacs) foram projetados para direcionar especificamente uma proteína de interesse (POI) (Figura 2)12,13,14,15,16,17,18. Protacs são as moléculas heterobifuncionais que consistem em um ligante específico para o POI conectado através de um linker a um ligante de uma ligase da ubiquitina E3 como crbn ou von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Protacs induzem a formação de um complexo ternário transitório, direcionando o POI para a ligase da ubiquitina E3, resultando em sua ubiquitinação e degradação degradação. As principais vantagens do PROTACs sobre os inibidores convencionais é que a ligação a um POI é suficiente, em vez de sua inibição e, portanto, PROTACs pode potencialmente alvo de um espectro muito maior de proteínas, incluindo aqueles que foram considerados undruggable como fatores de transcrição15. Além disso, as moléculas quiméricas atuam catalisando e, portanto, têm uma alta potência. Após a transferência do ubiquitin ao POI, o complexo ternário dissocia e está disponível para a formação de complexos novos. Assim, as concentrações muito baixas de PROTAC são suficientes para a degradação da proteína-alvo23.

Aqui nós descrevemos a síntese de um pomalidomide-pomalidomide conjugado Homo-ProTac (composto 8) que recruta crbn para a degradação DSE24. A ligase da ubiquitina E3 CRBN atua como recrutador e alvo ao mesmo tempo (Figura 3). Para validar nossos dados, também sintetizamos um controle de ligação negativa (composto 9). Nossos dados confirmam que o recém-sintetizado Homo-PROTAC é específico para a degradação de CRBN e tem somente efeitos mínimos em outras proteínas.

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Protocolo

1. preparação de moléculas PROTAC

Atenção: por favor, consulte todas as fichas de dados de segurança (MSDS) relevantes antes de usar. Diversos dos produtos químicos usados nestas sínteses são tóxicos e carcinogénicos. Por favor, use todas as práticas de segurança apropriadas e equipamentos de proteção pessoal.

  1. Preparação de carbamato de tert-butyl N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) (composto 1)
    1. Adicionar 1, 1 '-carbonildiimidazol (1,95 g, 12 mmol) e uma quantidade catalítica de 4-(dimetilamino) piridina (5 mg) a uma mistura de BOC-GLN-OH (2,46 g, 10 mmol) em THF (50 mL) em 100 mL balão de fundo redondo com um stir bar e equipado com um condensador de refluxo Aqueça no reflux por 10 h ao agitar até que uma solução desobstruída esteja dada forma.
    2. Retire o solvente pressão reduzida com um evaporador rotativo, adicione EtOAc (200 mL) e transfira-o para um funil separatório. Lave a camada orgânica com H2O (50 ml) e salmoura (50 ml) e seque-a sobre na2so4.
    3. Filtre a solução através de uma almofada curta de sílica gel (5 cm de diâmetro e 5 cm de altura) e Eluar com um volume adicional (200 mL) de EtOAc.
    4. Evate o solvente e seque o sólido incolor obtido no vacuo.
  2. Preparação de carbamato de tert-butil N-(1-metil-2, 6-dioxo-3-piperidilo) (composto 2)
    1. Combine composto 1 (2,28 g, 10 mmol) com carbonato de potássio fresado (2,76 g, 20 mmol) e Dmf (25 ml) em um balão de fundo redondo de 100 ml. Adicionar Iodometano (1,42 g, 0,62 mL, 10 mmol) gota-sábio usando uma seringa e equipar o balão com um septo de borracha perfurado. Coloque o vaso de reação em um banho de ultrasonication para 2 h.
    2. Diluir a mistura de reacção com EtOAc (100 mL) e transferi-la para um funil separatório. Lave a camada orgânica com 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 ml), e salmoura (25 ml), e seque-o sobre na2so4.
    3. Filtre e evate o solvente. Purificar o produto por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (6 cm de diâmetro da coluna e 20 cm de altura) usando éter de petróleo/EtOAc (2:1).
  3. Preparação de 2-(2, 6-dioxopiperidina-3-yl)-4-fluoroisoindolina-1,3-diona (composto 3)
    1. Combine 3-fluorophthalic anidrido (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimida 1 (1,14 g, 5 mmol) e uma solução de acetato de sódio (0,50 g, 6,0 mmol) em ácido acético glacial (20 ml) em um balão de fundo redondo de 50 ml com uma barra de agitação e equipado com um condensador de refluxo. Aqueça a mistura a 120 ° c durante 6 h.
    2. Após o resfriamento, despeje a mistura roxa em H2o (100 ml) e mexa por 10 min. colete o sólido formado por filtração, lave com h2o (3 × 5 ml) e éter de petróleo (3 × 5 ml) e seque em vacuo.
  4. Preparação de 4-fluoro-2-(1-metil-2, 6-dioxopiperidina-3-yl) Isoindolina-1,3-diona (composto 4)
    1. Combine 3-fluorophthalic anidrido (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimida 2 (1,21 g, 5 mmol) e uma solução de acetato de sódio (0,50 g, 6,0 mmol) em ácido acético glacial (20 ml) em um balão de fundo redondo de 100 ml com uma barra de agitação e equipado com um condensador de refluxo. Aqueça a mistura a 120 ° c durante 6 h.
    2. Após o resfriamento, despeje a mistura roxa em H2o (100 ml) e mexa por 10 min. colete o sólido formado por filtração, lave com h2o (3 × 5 ml) e éter de petróleo (3 × 5 ml) e seque em vacuo.
  5. Preparação de tert-butil N-[2-[2-[2-[[2-(2,6-dioxo-3-piperidyl)-1,3-dioxo-isoindolin-4-yl] amino] etoxi] etoxi] etil] carbamato (composto 7)
    1. Carregue um balão de fundo redondo de 50 mL com tert-butil N-[2-[2-(2-aminoetoxi) etoxi] etil] carbamato (5, 0,41 g, 1,65 mmol), composto 3 (0,41 g, 1,50 mmol), Dmf seco (10 ml) e dipea (0,39 g, 0,51 ml, 3,0 mmol). Equipar com uma barra de agitação e um condensador de refluxo. Calor atmosfera de argônio a 90 ° c por 10 h.
    2. Após refrigerar à temperatura ambiente, despeje a mistura verde escura no H2O (100 ml) e extraia com etoac (3x 50 ml) em um funil funil. Lave as camadas orgânicas combinadas com H2O (50 ml) e salmoura (50 ml), seque sobre na2so4, filtre e concentre-se em vacuo.
    3. Purify o produto cru pela cromatografia da coluna sobre o gel de silicone (diâmetro da coluna de 3 cm e altura de 60 cm) usando um inclinação do éter do petróleo/EtOAc (1:1 a 1:2).
  6. Preparação de homodímero (composto 8)
    1. Combine o vinculador α, ω-diamina 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), dipea (1, 5 ml, 6, 0 mmol) e uma solução de 3 (0,83 g, 3, 0 MMOL) em DMSO seco (20 ml) em um balão de fundo redondo de 50 ml com uma barra de agitação e equipado com um condensador de refluxo. Aqueça a atmosfera do argônio em 90 ° c por 18 h.
    2. Após refrigerar à temperatura ambiente, despeje a mistura verde escura no H2O (100 ml) e extraia com etoac (3x 50 ml) em um funil funil. Lave as camadas orgânicas combinadas com H2O (50 ml) e salmoura (50 ml), seque sobre na2assim4, filtre e concentre-se em vacuo.
    3. Purify o produto cru pela cromatografia da coluna sobre o gel de silicone (diâmetro da coluna de 3 cm e altura de 50 cm) usando um inclinação do éter/EtOAc do petróleo (1:2) ao EtOAc.
  7. Preparação de heterodímero (composto 9)
    1. Dissolver o composto 7 (0,83 g, 1,65 mmol) em ch seco2CL2 (10 ml). Adicionar ácido trifluoroacético (10 mL) e agitar a mistura amarela a 40 ° c durante 2 h num balão fechado de 50 mL de fundo redondo.
    2. Retire os voláteis e coevate com CH2CL2 (4x 5 ml). Seque o resíduo em vacuo por 10 h.
    3. Redissolva o material em DMF seco (20 mL). Adicionar composto 4 (0,44 g, 1,50 mmol) e dipea (0,78 g, 1, 5 mL, 6, 0 mmol) e equipar o balão com um condensador de refluxo. Calor atmosfera de argônio a 90 ° c por 10 h.
    4. Após refrigerar à temperatura ambiente, despeje a mistura verde escura no H2O (100 ml) e extraia com etoac (3x 50 ml) em um funil funil. Lave as camadas orgânicas combinadas com NaHCO saturado3 (50 ml), h2o (50 ml), 10% khso4 (50 ml), H2o (50 mL), e salmoura (50 ml), seque sobre na2so4, filtre e concentre-se em vacuo.
    5. Purify o produto cru pela cromatografia da coluna sobre o gel de silicone (diâmetro da coluna de 3 cm e altura de 50 cm) usando um inclinação do éter/EtOAc do petróleo (1:2) ao EtOAc.
    6. Elucidar e verificar a estrutura da molécula (Figura 5a composto 8, 5b composto 9) por 1H RMN e 13C NMR espectros em DMSO-d6 em uma ressonância magnética nuclear (RMN) Espectrômetro. Verifique se a pureza de ambos os compostos é superior a 97% por meio de cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS), aplicando uma detecção de matriz de diodos (DAD) a 220 – 500 nm.

2. validação funcional de moléculas PROTAC

  1. Análise do borrão ocidental da degradação de CRBN por PROTACs
    Nota: os efeitos do composto8e composto9no nível da proteína de CRBN foram testados pela análise ocidental do borrão. Além disso, o impacto nos níveis de IKZF1 e IKZF3 também pode ser confirmado (A Figura 6).
    1. Preparação da amostra
      1. Dissolva os compostos 8 e 9, lenalidomida (Len), Pomalidomida (POM), MG132, e mln-4924 no DMSO em uma concentração de 10 mm, alíquota e armazene a-80 ° c até o uso mais adicional.
      2. Semente 1 x 106 MM1S células em uma placa de 6 poços com 2,5 ml de mídia e tratar células com 100 nm ou 1 μm composto 8 ou 9 para 24 h.
      3. Colha pilhas após o tratamento e centrifugue em 700 x g, 5 min, 4 ° c. Lave a pelota da pilha com o frio 1X PBS para remover os meios restantes, centrifugador em 700 x g, 5 min, 4 ° c, e descarte o sobrenadante. Repita este passo uma vez.
      4. Células de lyse em tampão de lise (25 mM Tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1x protease & inibidor da fosfatase cocktail) por 10 min no gelo, centrífuga em 320 x g por 10 min, 4 ° c. Sobrenadante da colheita e determine a concentração da proteína por um ensaio ácido ácido da proteína (ensaio de BCA) de acordo com o protocolo do fabricante.
      5. Proteínas de desnaturamento (15 – 30 μg/amostra) com tampão de carga de 1x LDS (5% 2-Mercaptoetanol) e ferver 10 min, 75 ° c.
    2. SDS-PÁGINA
      1. Fixe o sanduíche do gel com um gel de separação de 10% [tampão do gel de 4 mL 3x (Tris/HCl de 3 M, 0,3% (p/v) dodecilsulfato de sódio (SDS), pH 8,45), 4 mL de acrilamida 30%, 2,52 mL de glicerol 50%, 1,395 mL H2O, 75 μl 11% persulfato de amônio (APS) e 9,75 ΜL de TEMED] e um gel de empilhamento de 4% [1,992 mL 3x tampão de gel, 0,792 mL 30% acrilamida, 3,168 mL H2O, 36 μl 11% APS e 6 ΜL de TEMED] numa unidade de montagem de eléctrodos. Remover pentes, poços nivelado com tampão de cátodos (100 milímetros Tris/HCl, Tricine de 100 milímetros, 0,1% (w/v) SDS), e amostras da carga.
      2. Encha o tampão do ânodo (100 milímetros Tris/HCl, pH 8,9) no tanque. Carregue a amostra da proteína da etapa 2.1.1.4 e funcione SDS-PAGE em 70 V, 20 minutos, seguidos por 115 V, 150 minutos na tensão constante.
    3. Immunoblotting e deteção de CRBN, de IKZF1 e de IKZF3
      1. Ativar membrana de PVDF (0,45 μm) em 100% metanol por 1 min. equilibrar a membrana e separar O gel em 1x tampão de transferência [10x tampão de transferência (192 mM glicina, 25 mM TRIS-base/HCl, 900 mL H2O), 20% metanol, 0,1% SDS, pH 8,3].
      2. Monte a gaveta blotting de acordo com o protocolo do fabricante. Gel de transferência em 180 mA por 90 min.
      3. Membrana de lavagem 3x em 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% Tween 20) por 5 – 10 min cada à temperatura ambiente. Membrana do bloco no leite nonfat-dried de 5% (NFDM), TBS-T para 1 h na temperatura ambiente. Lave a membrana 3x em 1X TBS-T durante 5 – 10 min cada à temperatura ambiente.
      4. Incubar a membrana com anticorpo preliminar para CRBN (1:500 em 5% BSA, TBS-T) com agitação delicada em 4 ° c, durante a noite.
      5. Lave a membrana 3x em 1X TBS-T durante 5 – 10 min cada à temperatura ambiente. Incubar membrana com anti-mouse (1:10.000 em 5% NFDM, TBS-T) ou anti-coelho (1:5.000 em 5% NFDM, TBS-T) anticorpo secundário acoplado à peroxidase de rábano HRP (1 h à temperatura ambiente.)
      6. Lave a membrana 2x em 1X TBS-T durante 5 – 10 min cada à temperatura ambiente. Repita este passo duas vezes com 1x TBS.
      7. Incubar a membrana por 2 min com solução de substrato HRP de acordo com os protocolos do fabricante e detecte quimioluminescência em um dispositivo de detecção de quimioluminescência.
      8. Lave a membrana 1x em 1X TBS por 5 – 10 min cada à temperatura ambiente. Para a liberação de anticorpos, descasque a membrana no amortecedor de descascamento disponível comercialmente por 15 minutos. Lave a membrana 3x em 1X TBS por 5 – 10 minutos cada na temperatura ambiente.
      9. Reblock a membrana no leite nonfat-dried de 5%, TBS-T para 1 h na temperatura ambiente. Lave a membrana 3x em 1x TBS-T para 5 – 10 min cada em temperatura ambiente e resonda com IKZF1, IKZF3 ou tubulina de acordo com a etapa 2.1.3.4.
  2. Experimentos de competição com MG132, MLN4942 ou pomalidomida
    Nota: para confirmar se a crbn é degradada através da via ubiquitina-Proteassoma, realizamos experimentos de competição com o inibidor do Proteassoma MG132 e um inibidor da enzima ativadora de Cullin (NAE) MLN4942 (Figura 7).
    1. Semente 1 x 106 MM1S células por poço em uma placa de 6 poços. Pré-tratamento de células com 10 μM MG132, 10 μM MLN4942, ou lenalidomida (100x), e incubar 1 h a 37 ° c, 5% CO2.
    2. Adicionar 100 nM composto 8 para 3 h a 37 ° c, 5% co2.
    3. Colha pilhas para o borrão ocidental de acordo com a etapa 2.1.1.
  3. Ensaios de viabilidade celular em linhas celulares de mieloma múltiplo
    Nota: Este ensaio é utilizado para testar o impacto na viabilidade celular e, adicionalmente, antagonizar o efeito de IMiDs em células de mieloma múltiplo por pré-tratamento das células com composto 8 (Figura 8, Figura 9A, B).
    1. Semente 5 x 104 MM1S Cells por bem em uma placa 96-well em triplica biológicos para o ensaio da viabilidade. Para a análise de Western blot, semente 1 x 106 MM1S células por poço em uma placa de 6 poços em triplicates biológicos.
    2. Trate as células com DMSO ou 100 nM, 1 μM ou 10 μM composto 8, composto 9 ou pomalidomida e incubar por 24 h, 48 h ou 96 h a 37 ° c, 5% co2. Para experimentos de resgate, trate células com 100 nM composto 8 para 3 h, antes ou depois da adição de 1 μm de pomalidomida e incubar por 96 h.
    3. Medida 96-bem luminescência da placa com um ensaio luminescentes da viabilidade da pilha, de acordo com o protocolo do fabricante em um leitor da placa ou pilhas da colheita da placa 6-well para a análise ocidental do borrão.

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Resultados

Aqui nós descrevemos o projeto, a síntese e a avaliação biológica de um ProTac bacteriana do pomalidomide-baseado para a degradação de CRBN. Nosso ProTac interage simultaneamente com duas moléculas de crbn e forma complexos ternários que induz a degradação de autoubiquitinação e degradação de crbn com apenas efeitos remanescentes mínimos sobre os neosubstratos induzidos por pomalidomida IKZF1 ou IKZF3.

De uma série de moléculas ...

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Discussão

O projeto de tais Homo-protacs como descrito aqui para crbn confia na afinidade específica do pomalidomida ao crbn, que foi utilizado com sucesso em protacs heterobifunctional numerosos e conduziu ao desenvolvimento de ProTac 8 como altamente degradador seletivo de CRBN. A especificidade de nossa molécula já foi confirmada por análises proteômicas24. Para nocaute geneticamente negociado, exclusão e validação de efeitos colaterais é desafiador e demorado. Além disso, um knockdown q...

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Divulgações

Os autores não declaram um potencial conflito financeiro de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 e SFB-1074 para J.K.; FOR2372 para a)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1,1'-CarbonildiimidazolTCI produtos químicosC0119
2,2′-(etilenodioxi)-bis(etilamina)Sigma-Aldrich385506Composto
Sigma-AldrichM6250
3-Anidrido ftálico, 98%Alfa AesarA12275
4-Dimetilaminopiridina, 99%Acros148270250
Acrilamídeos Tóxicosö sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)Carl Roth3029.1
Aiolos (D1C1E) mABCell signaling15103S
Anticorpo anti-CRBN produzido em coelhoSigmaHPA045910
Anticorpo anti-coelho IgG ligado a HRPSigma7074S
Persulfato de amônioRoth9592.2
Boc-Gln-OHTCI produtos químicosB1649
Albumina de soro bovinoSigma-AldrichA7906-100G
CellTiter-Glo Ensaio de viabilidade de células luminescentesPromegaG7571
ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
DMF, anidro, 99,8Acros348435000Extra Seco sobre Peneira Molecular
DMSO, anidro, 99,7Acros348445000Extra Seco sobre Peneira Molecular
GlicinaSigma-Aldrich15523-1L-R
Cabra anti-rato (HRP conjugado)Santa Cruz biotecnologiasc-2005
Halt Protease & Inibidor de Fosfatase Coquetel de uso único (100X)Thermo Scientific1861280
Ikaros (D6N9Y) Sinalização de células Mab14859S
Membrana de transferência ImmobilonP (0,45µ m)MerckIPVH000010
Iodometano, 99%Sigma-AldrichI8507Metanol altamente tóxico
Sigma-Aldrich32213-2.5L
Mg132SelleckchemS2619
Mini Célula de transferência eletroforética Trans-BlotBio-Rad1703930
Mini-PROTEAN Tetra Célula de Eletroforese VerticalBio-Rad1658004
MLN4942biomol (jacaré)Cay15217-1
Anticorpo monoclonal anti-alfa;-tubulina produzido em camundongo (B512)SigmaT5168
N-etildiisopropilamina, 99%Alfa AesarA11801
Leite em pó desnatadoPanReac AppliChemA0830,0500
Nunc F96 MicroWell White Placa de poliestirenoThermo Scientific136101
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)Thermo ScientificNP0008
Pierce BCA Protein Assay kitThermo Scientific23225
PomalidomidaSelleckchemS1567
RestoreTM Western Blot Stripping BufferThermo Scientific46430
sódio dodecil sulfatoCarl Roth183.1
Cloreto de sódioSigma-AldrichA9539-500g
TEMEDCarl Roth2367.3
terc-butil N- [2- [2- (2-aminoetoxi) etoxi] etil] carbamatoSigma-Aldrich89761Composto 5
TricinaCarl Roth6977.4
Trizma baseSigma-AldrichT1503-1kg
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ml
WesternBright ECL sprayAdvanstaK-12049-D50
6-2-Mercaptoetanol% %

Referências

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  3. Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
  4. Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
  5. Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742(2014).
  6. Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
  7. Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
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