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Artigo de método

Imagem latente integrina tensão e força celular com resolução de Submicron com um Sensor de tensão Integrativa

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DOI:

10.3791/59476

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25 de abril de 2019

 ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, Iowa State University, 2Department of Physics and Astronomy, Molecular, Cellular, and Developmental Biology Interdepartmental Program, Iowa State University

Neste artigo

Resumo

Tensão de integrina tem um papel importante em várias funções da célula. Com um sensor de tensão Integrativa, integrina tensão é calibrado com sensibilidade de picoNewton (pN) e cuja imagem em resolução de submicron.

Resumo

Tensão molecular transmitido pelos títulos de integrina-ligante é o sinal mecânico fundamental na via da integrina que tem um papel significativo em muitas funções celulares e comportamentos. Para calibrar e imagem integrina tensão com força alta sensibilidade e resolução espacial, desenvolvemos um sensor de tensão Integrativa (ITS), um sensor de tensão fluorescente baseado em DNA. O SIB é ativado para fluorescência se sustentar uma tensão molecular, convertendo assim força de sinal fluorescente a nível molecular. O limite de tensão para sua ativação é ajustável na faixa de 10 a 60 pN que cobre bem a gama dinâmica de integrina tensão nas células. Sobre um substrato enxertado com um ITS, a integrina tensão das células aderentes é visualizada por fluorescência e fotografada em resolução de submicron. O SIB é também compatível com imagem estrutural de célula em células vivas e células fixas. O SIB foi aplicado com êxito para o estudo da contração das plaquetas e a migração celular. Este documento detalha o procedimento para a síntese e a aplicação do SIB no estudo da força celular integrina-transmitidos.

Introdução

Células dependem de integrinas de aderir e exercer forças celulares de matriz extracelular. Transmissão de força e adesão celular mediada por integrina são cruciais para a célula espalhando1,2, migração3,4e sobrevivência5,6,7. A longo prazo, integrina biomecânico sinalização também influi na célula proliferação8,9,10 e diferenciação11,12. Pesquisadores desenvolveram vários métodos para medir e celular de integrina transmissíveis mapa forças na interface célula-matriz. Estes métodos baseiam-se em substrato elástico13, matriz de micropost14, ou atômica força microscopia (AFM)15,16. Elástica substrato e micropost métodos dependem da deformação de substratos para relatar o estresse celular e têm limitações em termos de resolução espacial e forçar a sensibilidade. AFM tem força alta sensibilidade, mas que não consigo detectar a força em vários pontos simultaneamente, dificultando a mapear celular força transmitida por integrinas.

Nos últimos anos, várias técnicas foram desenvolvidas para estudar a força celular a nível molecular. Uma coleção de sensores de tensão molecular baseado em polietileno glicol17,18, aranha de seda peptídeo19e DNA20,21,22,23 foram desenvolvidos para Visualizar e monitorar a tensão transmitida por proteínas moleculares. Entre essas técnicas, o DNA foi adotado inicialmente como o material de síntese na tensão calibre baraço (TGT), um rupturable vinculador que modula o limite superior da integrina tensões em células vivas22,24. Mais tarde, técnica de transferência de ressonância de DNA e fluorescência foram combinados para criar prendendor sensores de tensão fluorescente baseado em DNA primeiro por grupo23 de Chen e grupo20 do Salaita. O sensor de tensão baseado em DNA prendendor relata integrina tensão em tempo real e tem sido aplicado com sucesso para o estudo de uma série de funções celulares21. Depois, o laboratório de Wang combinado um TGT com o par de fluoróforo-quencher para tensão de integrina relatório. Este sensor é chamado um ITS25,26. O SIB é baseado em DNA de cadeia dupla (dsDNA) e tem um alcance dinâmico mais amplo (pN 10-60) para a calibração de tensão integrina. Em contraste com o gancho de cabelo DNA baseado em sensores, o SIB não relata força celular em tempo real mas registra todos os eventos de integrina histórico como a pegada da força celular; Este processo de acumulação de sinal melhora a sensibilidade para celular força de imagem, tornando-o viável para celular força de imagem mesmo com um microscópio de fluorescência low-end. A síntese de ITS é relativamente mais conveniente, pois ele é criado pelo cruzamento de dois single-stranded DNA (ssDNA).

O ITS é uma 18-base-emparelhado dsDNA conjugado com biotina, um fluoróforo, um quencher (buraco negro Quencher 2 [BHQ2])27e um ácido (RGD) cíclico arginylglycylaspartic peptídeo28 como um ligante de peptídeo de integrina (Figura 1). O fio inferior é conjugado com o fluoróforo (Cy3 é usado neste manuscrito, enquanto outros corantes, tal como a série Cy5 ou Alexa, também têm sido comprovada viável em nosso laboratório) e a tag de biotina, com o qual o SIB é imobilizado em um substrato por ligação biotina-avidina. A vertente superior é conjugada com o peptídeo RGD e o buraco negro Quencher, que sacia Cy3 com aproximadamente 98% têmpera eficiência26,27. Com o protocolo apresentado neste trabalho, a densidade de revestimento do SIB em um substrato é em torno de 1.100/µm2. Esta é a densidade de que nós previamente calibrados para 18 bp biotinilado dsDNA revestido no substrato neutrAvidin-acrescida, seguindo o mesmo protocolo29de revestimento. Quando as células aderem ao substrato revestido com o SIB, integrina vincula o SIB através de RGD e transmite a tensão para o SIB. O ITS tem uma tolerância de tensão específica (Ttol) que é definida como o limiar de tensão que separa mecanicamente o dsDNA do SIB dentro 2 s22. SUA ruptura por tensão integrina leva à separação do quencher da tintura que posteriormente emite fluorescência. Como resultado, a tensão de integrina invisível é convertida para um sinal de fluorescência e a força de celular pode ser mapeada por imagens de fluorescência.

Para demonstrar a aplicação do SIB, usamos keratocyte peixe aqui, um modelo de célula amplamente utilizada para a migração celular estudo30,31,de32, células CHO-K1, uma linhagem celular de imóveis usados e fibroblastos de NIH 3T3. Coimaging de estruturas de tensão e célula de integrina também é conduzida.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC, 8-16-8333-eu) de Iowa State University e institucional Cuidado Animal.

1. síntese do sensor de tensão Integrativa

  1. Personalizar e ordem ssDNAs (consulte a Tabela de materiais).
    Nota: As sequências ssDNA são como segue. A vertente superior é /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. As vertentes mais baixas são os seguintes.
    pN 12 ITS: / 5Cy3//3Bio/ GGC CCG CTG CGT CCT CCC
    pN 23 ITS: / 5Cy3//iBiodT/ GGC CCG CTG CGT CC CCC
    33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC
    43 pN ITS: / 5Cy3/CGT CCT CCC GGC CCG C/iBiodT/G
    54 pN ITS: /5Biosg / / iCy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC
    Aqui, /5ThioMC6-D / representa um modificador de tiol C6 S-S (dissulfeto) na extremidade 5'. /3BHQ_2/ representa um buraco negro Quencher 2 na extremidade 3'. / 3Bio /, / 5Biosg//iBiodT/ são biotinylation no final 3', 5' final e sobre a timina do DNA interno, respectivamente. /iCy3/ representa um Cy3 inserido o backbone interno do ssDNA. Estes códigos são utilizados pelo fornecedor comercial específico usado aqui e podem ser diferentes em outras empresas de DNA.
  2. Conjugado do peptide RGD para o SH-ssDNA-quencher.
    Nota: Os reagentes utilizados são fosfato salino (PBS), sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) ciclo-hexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), peptídeos RGD e tris - cloridrato de fosfina (2-sesquióxido), também conhecido como TCEP-HCl.
    1. DePROTECT o modificador de tiol no ADN vertente superior usando a solução TCEP.
      Nota: DNAs Thiol-modificado encomendadas uma fonte comercial são enviados na forma oxidada, com os átomos de enxofre, protegidos por uma ligação dissulfureto que precisa ser reduzida antes da conjugação RGD-DNA. TCEP é um reagente de redução inodoro, utilizado para a desproteção de tiol.
      1. Dissolva 14,3 mg de TCEP-HCl em 300 µ l de água. Ajuste o pH da solução TCEP ~7.2–7.4 com solução de NaOH 1 M (cerca de 150 µ l), com documentos de teste de pH. Adicione água pura para fazer um volume final de 0,5 mL. A concentração final do TCEP é 100 mM.
        Nota: É aconselhável fazer TCEP solução fresca sempre para desproteção de tiol de DNA. Evite estocar solução TCEP por um longo tempo.
      2. Adicione 100 µ l de solução de (EDTA) ácido etilenodiaminotetracético 0,5 M e 400 µ l de água para a solução do TCEP.
      3. Adicione 10 µ l da solução de EDTA + TCEP a 20 µ l de 1mm thiol-DNA-BHQ2 em PBS. Deixe a solução reagir durante 30 min à temperatura ambiente.
        Nota: A ligação dissulfeto de 5' modificador tiol conjugação C6 S-S a este ssDNA vai ser clivada por TCEP, deixando o grupo tiol pronto para reação com maleimide nas próximas etapas. O TCEP não interfere com a seguinte reação thiol-maleimide; assim, não é necessário para passivate TCEP após esta etapa.
    2. Conjugado RGD-NH2 com sulfo-SMCC.
      1. Dissolva 5 mg de RGD-NH2 em 100 µ l de PBS para obter 11mm RGD-NH2.
      2. Adicione 200 µ l de água pura para o tubo com 2 mg de sulfo-SMCC (pré-medida pelo fornecedor). Esmagar o sulfo-SMCC sólido com uma ponta de pipeta e pipeta vigorosamente ao mesmo tempo para facilitar a dissolução da SMCC na água. A concentração de sulfo-SMCC será 23 milímetros.
        Nota: Porque o éster de NHS em sulfo-SMCC está sujeita a hidrólise e tem um tempo de vida de alguns minutos, esta etapa de dissolução deve ser concluída dentro de 1 min para evitar a perda excessiva do éster NHS devido à hidrólise. Use água pura para dissolver sulfo-SMCC porque sua solubilidade em PBS ou outros buffers é pobre.
      3. Adicionar 40 µ l de solução de sulfo-SMCC à solução 100 µ l RGD-NH2 e incube-lo por 20 min.
        Nota: O éster de NHS em sulfo-SMCC irá reagir com o grupo amina em RGD-NH2, formando uma ligação Amida que liga RGD e sulfo-SMCC.
    3. Conjugado RGD-SMCC com o SH-ssDNA-quencher.
      1. Misturar as soluções preparadas em etapas 1.2.1 e 1.2.2 e incubar a mistura por 1h à temperatura ambiente. Mover a solução para um conjunto de geladeira a 4 ° C e deixe mais reagir durante a noite. O tiol, conjugado com o DNA de vertente superior irá reagir com maleimide na sulfo-SMCC, formando um grupo Tioéter que liga RGD com a vertente superior DNA.
    4. Execute a precipitação do álcool etílico para purificar RGD-ssDNA-quencher de sulfo-SMCC não tenha reagido, RGD e TCEP.
      1. Fica frio 10 mL de etanol a 100% em um tubo cônico de 15 mL em um congelador-20 ° C durante pelo menos 30 min.
      2. Misture uma solução de NaCl de 3M, uma solução de DNA e etanol refrigerado em uma relação de volume de 01:10:25. Mantenha o líquido misturado em um congelador-20 ° C por 30 min ou até que o DNA é precipitado.
      3. Centrifugar o líquido a 10.000 x g durante 30 min. descartar o sobrenadante.
      4. Adicione PBS ao pellet de DNA. Medir a concentração de DNA usando um espectrômetro.
    5. (Opcional) Realize a eletroforese de DNA para ganhar uma maior pureza RGD-ssDNA.
      Nota: Com o protocolo acima, cerca de 70%-90% do ssDNA vai ser conjugados com RGD. Se desejar maior pureza, eletroforese de DNA também pode ser realizada para separar unconjugated DNA DNA conjugado.
      1. Monte um sistema de eletroforese vertical.
      2. Prepare uma solução de 10% de gel de poliacrilamida, misturando 50 mL de água pura, 20 mL de gel do acrilamido 40%, 8 mL de tampão de tris-borato-EDTA (TBE) de 10x e 800 µ l de persulfato de amónio de 10% (APS).
      3. Adicione a solução de gel de 80 µ l de tempted (TEMED). Despeje a solução na câmara de vidro do sistema de electroforese. Inserir um pente bem simples para criar um bem em cima do gel. Espere 10 min até que o gel de quitosana.
      4. Misture a solução de DNA com 100% de glicerol em uma relação de volume de 1:1. Retirar o pente e carregar a solução de DNA para o gel bem.
      5. Funcione o gel com uma tensão de 200 V. observar duas faixas do ADN em que o revestimento de um é o DNA conjugado.
      6. Cortar a banda de gel com o DNA conjugado e cortá-lo em pedaços pequenos.
      7. Recolha o gel em cubos em dois tubos de centrífuga de 1,5 mL com filtros. Adicione 500 µ l de PBS a cada tubo.
      8. Coloque o gel PBS-embebido em um lugar escuro, à temperatura ambiente por 1 dia. DNA será difusa fora os pedaços de gel para a PBS.
      9. Recolha a solução de DNA por centrifugação dos tubos a 1.000 x g por 2 min.
      10. Realize uma nova rodada de precipitação do álcool etílico (etapa 1.2.4) para coletar o DNA.
  3. Sintetiza o SIB por hybridizing RGD-ssDNA-quencher e tintura-ssDNA-biotina.
    1. Misture as soluções da vertente superior e o inferior strand DNAs na proporção molar de 1.1:1. Mantenha a mistura em 4 ° C durante a noite para produzir o SIB por hibridização de DNA.
      Nota: Uma razão molar de 1.1:1 para a hibridação de DNA é usada em vez de 1:1. RGD-ssDNA-quencher excessiva é usada para garantir que toda tintura-ssDNA-Biotina vai cruzar com RGD-ssDNA-quencher. RGD-ssDNA-quencher sem hibridização lavagem durante o revestimento de superfície, o que não afetará a qualidade do revestimento de superfície de ITS.
    2. Alíquota e armazenar a solução ITS a-20 ° C para armazenamento a longo prazo.
      Nota: O buffer de armazenamento é PBS e a concentração de armazenamento deve ser geralmente acima de 10 µM. Para uso regular, sua solução pode ser armazenada a 4 ° C por algumas semanas sem degradação de qualidade perceptível.

2. preparação das superfícies por imobilizando o SIB em pratos de Petri com fundo de vidro

Nota: Os reagentes utilizados são biotinilado albumina de soro bovino (BSA-biotina), proteína avidina e ITS. Relaxa todos os reagentes e tampão PBS para em torno de 0 ° C no gelo com um balde de gelo.

  1. Carrega a 200 µ l de 0,1 mg/mL BSA-biotina em PBS para o bem de um prato de Petri com fundo de vidro (29 mm de diâmetro, com um bem de 14 mm). -Incube durante 30 min a 4 ° C, em um frigorífico. BSA-biotina é fisicamente adsorvida na superfície do vidro.
  2. Sugue a solução do bem usando uma pipeta e adicionar 200 µ l de PBS volta para o poço para lavar a superfície. Repita este 3x para completar a lavagem.
  3. Incubar a 200 µ l de proteína de avidina 50 µ g/mL no poço por 30 min a 4 ° C. Lavar 3x com PBS. Após esta etapa, a proteína avidina vincula o BSA-biotina e torna-se imobilizada na superfície de vidro.
  4. Incubar a 200 µ l de 0.1 µM ITS no poço por 30 min a 4 ° C. Lave o prato com 3x com PBS. Deixe PBS no poço até o chapeamento de célula. Após esta etapa, o SIB com a tag biotina vincula-se à proteína avidina e torna-se imobilizada na superfície.
    Nota: Uma precaução fundamental para sua qualidade de revestimento e homogeneidade durante a imobilização de ITS é nunca deixar a superfície do prato de Petri secar. Mantendo todos os reagentes e PBS a 4 ° C ou em torno de 0 ° C no gelo com um balde de gelo ajuda a reduzir a taxa de evaporação da água durante as etapas de lavagem, quando PBS é retirado do poço.

3. célula chapeamento nas suas superfícies.

  1. Keratocytes de peixe de cultura.
    Nota: Aqui, peixinho dourado (Carassius auratus) é usado como um exemplo, mas outras espécies de peixes podem não funcionar.
    1. Arranca um pedaço de escama de peixe de um peixe com uma pinça de ponta plana. Pressione suavemente a escala para o bem de um prato de Petri com fundo de vidro, com o lado interno da escala entrar em contato com o vidro. Esperar por ~ 30 s para a escala de peixe aderir bem à superfície de vidro do prato.
    2. Adicione 1 mL de Iscove modificado médio (IMDM) o complete medium de Dulbecco para cobrir totalmente a escama de peixe. Mantenha o prato de Petri em uma caixa de escura e úmida para 6 – 48 h à temperatura ambiente.
      Nota: O meio completo IMDM contém 79% IMDM + 20% de soro fetal bovino (FBS) + 1% penicilina. Nenhuma fonte extra de oxigênio ou CO2 é necessário. Alguns rolos de papel de tecido embebidos em água podem ser deixados na caixa para manter alta umidade na caixa. Keratocytes de peixe irá migrar fora a escala de peixe como uma folha de células depois de algumas horas. Isto pode ser observado com um microscópio de cultura de tecidos. As células são geralmente viáveis a 48 h.
  2. Desconectar-se e as células keratocytes em Sib superfícies da placa.
    1. Retire o meio de Petri em que foi cultivada a escama de peixe. Lave o bem 1x com célula desanexação de solução e adicionar solução desmontar para cobrir a escala de peixe e incubar durante 3 min.
      Nota: A receita para a célula de desanexação de solução de EDTA é a seguinte: 100 mL de 10 x Hanks equilibrado sal solução (HBSS) + 10 mL de 1 M HEPES (pH 7,6) + 10 mL de bicarbonato de sódio 7,5% + 2,4 mL de EDTA 500mm + 1 L de H2O. O pH é ajustado para 7,4.
    2. Sugue todas as célula desanexação de solução e adicione meio completo IMDM. Disperse o keratocytes pipetando suave. Ajuste a densidade da solução de célula até o nível desejado (1 x 104– 1 x 105/mL). Placa de células na superfície de ITS (preparado de acordo com a secção 2). Incube as celulas em temperatura ambiente por 30 min antes de imagem.
      Nota: A contagem de células pode ser feito com um hemocytometer depois de descolar as células com solução de desanexação. A célula chapeamento densidade é relativamente baixa para que o keratocytes tem muita área de superfície para migrar.
  3. As células CHO-K1 de placa e células de NIH 3T3 em suas superfícies.
    Nota: O meio para células CHO-K1 é de 89% do Ham F12 + 10% FBS + 1% penicilina. A meio das células 3T3 NIH é médio da águia modificados de 89% Dulbecco (DMEM) + 10% de soro bovino bezerro (CBS) + 1% penicilina. As condições de cultura são 37 ° C e 5% de CO2.
    1. As células CHO-K1 de cultura ou das células 3T3 NIH a confluência de 80%-100% em uma placa de Petri (ou frasco de cultura).
    2. Aquecer a célula desanexação de solução e o meio de cultura a 37 ° C.
    3. Remova todos os meio de cultura na prato de Petri com uma pipeta. Lavar as células 1 x com célula desanexação de solução. Cobrir as pilhas com a desanexação de solução e -incubar a 37 ° C por 10 min.
    4. Disperse as células pipetando. Recolher a solução da célula e centrifugue a 300 x g durante 3 min.
    5. Sugue o sobrenadante e adicionar meio completo ou meio livre de soro.
    6. Ajuste a densidade da solução de célula até o nível desejado (1 x 105 – 1 x 106/mL). Placa das células nas superfícies de ITS (preparadas de acordo com a secção 2). Incube as células a 37 ° C, durante 1 a 2 h antes da imagem latente, ou 30 min antes de gravação de vídeo.

4. geração de imagens, gravação de vídeo e mapeamento de tensão integrina em tempo real

  1. Uma imagem de integrina tensão em células vivas
    1. Incubar a keratocytes em suas superfícies (preparados de acordo com a seção 2) por 30 min à temperatura ambiente, ou incubar células CHO-K1 ou NIH 3T3 por 1h em suas superfícies em uma incubadora a 37 ° C.
    2. Monte o prato de Petri num palco de microscópio de fluorescência. Realizar força celular imagem com um tempo de exposição de 1 s. A ampliação é de 40x ou 100x.
    3. Pegue um vídeo de suas imagens com um intervalo de quadro de 20 s para keratocytes, ou 1 a 2 min para células CHO-K1 ou NIH 3T3.
    4. Use o MATLAB ou outra ferramenta de análise de imagem para subtrair um quadro anterior do seu vídeo de um quadro atual para computar o sinal de seu recém produzido no intervalo de quadro mais recente. O sinal ITS recém-produzido representa a tensão de integrina gerada no intervalo de quadro mais recente, desse modo, relatando a força celular de uma forma.
  2. Coimaging de tensão de integrina e estrutura celular em células immunostained
    1. Depois passo 3.2.2 ou 3.3.6, execute imunocoloração para marcar as proteínas estruturais do alvo.
      Nota: Use diferentes corantes para evitar o crosstalk de fluorescência entre integrina tensão imagem e imagem latente estruturais da pilha. Neste manuscrito, fluoróforo Cy5 foi usado para faloidina e Alexa 488 foi usado para coloração de vinculina. A concentração do anticorpo primário e secundário é 2,5 µ g/mL. A concentração para faloidina é 1,5 unidades / µ l.
    2. Execute multifluorescent canal de imagem para adquirir um mapa de tensão integrina e imagem latente estruturais da pilha.

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Resultados

Com o seu, o mapa de tensão integrina de keratocytes de peixe foi capturado. Isso mostra que um keratocyte migra e gera tensão integrina em duas faixas de força (Figura 2A). A resolução do mapa força foi calibrada para ser 0,4 µm (Figura 2B). Integrina alta tensão se concentra na margem posterior (Figura 3A). O SIB também mostra diferentes padrões específicos de células diferentes. Uma célula imóveis...

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Discussão

O SIB é um altamente acessível ainda poderosa técnica para celular mapeamento em termos de síntese e a aplicação de força. Com todos os materiais prontos, o ITS podem ser sintetizados dentro de 1 dia. Durante as experiências, apenas três passos do revestimento de superfície são necessários antes de chapeamento de célula. Recentemente, simplificou ainda mais o procedimento de revestimento de um passo vinculando diretamente o ITS a albumina de soro bovino, que permite a adsorção física direta do SIB para vidro ou superfíci...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo fundo de inicialização fornecido pela Iowa State University e pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências (R35GM128747).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BSA-biotinaSigma-AldrichA8549
NeutravidinaThermo Fisher Scientific31000
StreptavidinThermo Fisher Scientific434301
DNA de fita superiorTecnologias de DNA integradas/AProjetado pelo cliente. A sequência de DNA é mostrada na seção PROTOCOLO
DNA de fita inferiorTecnologias de DNA integradasN / AProjetado pelo cliente. As sequências de DNA são mostradas na seção PROTOCOLO.
sulfo-SMCCThermo Fisher ScientificA39268
Peptídeo cíclico RGD com um grupo aminaPeptídeos InternationalPCI-3696-PI
IMDMATCC‎
FBSATCC302020
Penicilinagibco15140122
TCEPSigma-AldrichC4706
200 uL placa de PetriCellvisD29-14-1.5-N
NanoDrop 2000EspectrômetroThermo ScientificN/A
SE410 Unidade de Eletroforese de Proteína Vertical Refrigerada a Ar AltaHoeferSE410-15-1.5Dispositivo para eletroporese
CHO-K1 linha celularATCCCCL-61
NIH / 3T3 linha celularATCCCRL-1658
Anticorpo anti-vinculinaEMD Millipore90227Anticorpo primário para imunocoloração de vinculina
Anticorpo secundário superclonal de cabra IgG (H + L) de cabra, Alexa Fluor 488InvitrogenA28175Anticorpo secundário para imunocoloração de vinculina
Alexa Fluor 647 FaloidinaInvitrogenA22287
Eclipse TiNikonN/Amicroscópio
N62996227

Referências

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