Artigo de método

Imagem latente integrina tensão e força celular com resolução de Submicron com um Sensor de tensão Integrativa

DOI:

10.3791/59476

⸱

25 de abril de 2019

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1Department of Physics and Astronomy, Iowa State University, 2Department of Physics and Astronomy, Molecular, Cellular, and Developmental Biology Interdepartmental Program, Iowa State University

Neste artigo

Resumo

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Tensão de integrina tem um papel importante em várias funções da célula. Com um sensor de tensão Integrativa, integrina tensão é calibrado com sensibilidade de picoNewton (pN) e cuja imagem em resolução de submicron.

Resumo

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Tensão molecular transmitido pelos títulos de integrina-ligante é o sinal mecânico fundamental na via da integrina que tem um papel significativo em muitas funções celulares e comportamentos. Para calibrar e imagem integrina tensão com força alta sensibilidade e resolução espacial, desenvolvemos um sensor de tensão Integrativa (ITS), um sensor de tensão fluorescente baseado em DNA. O SIB é ativado para fluorescência se sustentar uma tensão molecular, convertendo assim força de sinal fluorescente a nível molecular. O limite de tensão para sua ativação é ajustável na faixa de 10 a 60 pN que cobre bem a gama dinâmica de integrina tensão nas células. Sobre um substrato enxertado com um ITS, a integrina tensão das células aderentes é visualizada por fluorescência e fotografada em resolução de submicron. O SIB é também compatível com imagem estrutural de célula em células vivas e células fixas. O SIB foi aplicado com êxito para o estudo da contração das plaquetas e a migração celular. Este documento detalha o procedimento para a síntese e a aplicação do SIB no estudo da força celular integrina-transmitidos.

Introdução

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Células dependem de integrinas de aderir e exercer forças celulares de matriz extracelular. Transmissão de força e adesão celular mediada por integrina são cruciais para a célula espalhando1,2, migração3,4e sobrevivência5,6,7. A longo prazo, integrina biomecânico sinalização também influi na célula proliferação8,9,10 e diferenciação11,

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Protocolo

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Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC, 8-16-8333-eu) de Iowa State University e institucional Cuidado Animal.

1. síntese do sensor de tensão Integrativa

  1. Personalizar e ordem ssDNAs (consulte a Tabela de materiais).
    Nota: As sequências ssDNA são como segue. A vertente superior é /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. As vertentes mais baixas são os seguintes.
    pN 12 ITS: / 5Cy3//3Bio/ GGC CCG CTG CGT CCT CCC
    pN 23 ITS: / 5Cy3//iBiodT/ GGC CCG CTG CGT CC CCC
    33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC
    43 pN ITS: / 5Cy3/CGT CCT CCC GGC CCG C/iBiodT/G
    54 ....

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Resultados

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Com o seu, o mapa de tensão integrina de keratocytes de peixe foi capturado. Isso mostra que um keratocyte migra e gera tensão integrina em duas faixas de força (Figura 2A). A resolução do mapa força foi calibrada para ser 0,4 µm (Figura 2B). Integrina alta tensão se concentra na margem posterior (Figura 3A). O SIB também mostra diferentes padrões específicos de células diferentes. Uma célula imóveis.......

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Discussão

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O SIB é um altamente acessível ainda poderosa técnica para celular mapeamento em termos de síntese e a aplicação de força. Com todos os materiais prontos, o ITS podem ser sintetizados dentro de 1 dia. Durante as experiências, apenas três passos do revestimento de superfície são necessários antes de chapeamento de célula. Recentemente, simplificou ainda mais o procedimento de revestimento de um passo vinculando diretamente o ITS a albumina de soro bovino, que permite a adsorção física direta do SIB para vidro ou superfíci.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pelo fundo de inicialização fornecido pela Iowa State University e pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências (R35GM128747).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BSA-biotinaSigma-AldrichA8549
NeutravidinaThermo Fisher Scientific31000
StreptavidinThermo Fisher Scientific434301
DNA de fita superiorTecnologias de DNA integradas/AProjetado pelo cliente. A sequência de DNA é mostrada na seção PROTOCOLO
DNA de fita inferiorTecnologias de DNA integradasN / AProjetado pelo cliente. As sequências de DNA são mostradas na seção PROTOCOLO.
sulfo-SMCCThermo Fisher ScientificA39268
Peptídeo cíclico RGD com um grupo aminaPeptídeos InternationalPCI-3696-PI
IMDMATCC‎
FBSATCC302020
Penicilinagibco15140122
TCEPSigma-AldrichC4706
200 uL placa de PetriCellvisD29-14-1.5-N
NanoDrop 2000EspectrômetroThermo ScientificN/A
SE410 Unidade de Eletroforese de Proteína Vertical Refrigerada a Ar AltaHoeferSE410-15-1.5Dispositivo para eletroporese
CHO-K1 linha celularATCCCCL-61
NIH / 3T3 linha celularATCCCRL-1658
Anticorpo anti-vinculinaEMD Millipore90227Anticorpo primário para imunocoloração de vinculina
Anticorpo secundário superclonal de cabra IgG (H + L) de cabra, Alexa Fluor 488InvitrogenA28175Anticorpo secundário para imunocoloração de vinculina
Alexa Fluor 647 FaloidinaInvitrogenA22287
Eclipse TiNikonN/Amicroscópio
N62996227

Referências

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  1. Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
  2. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal ....

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Etiquetas

Sensor Baseado em DNAMicroscopia de Fluoresc nciaImagem de For aLiga es Integrina LiganteIntera o For a EstruturaMigra o de Cerat citos

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