Artigo de método

Geração de hidrogéis com base em colágeno 3-D para analisar o crescimento e o comportamento axonal durante o desenvolvimento do sistema nervoso

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DOI:

10.3791/59481

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25 de junho de 2019

 , 
1Molecular and Cellular Neurobiotechnology, Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), Parc Científic de Barcelona, 2Department of Cell Biology, Physiology, and Immunology, Universitat de Barcelona, 3Center for Networked Biomedical Research on Neurodegenerative Diseases (CIBERNED), 4Institute of Neuroscience, University of Barcelona

Neste artigo

Resumo

Aqui, fornecemos um método para analisar o comportamento dos axônios crescentes em matrizes 3D, imitando seu desenvolvimento natural.

Resumo

Este protocolo usa o tipo natural mim colagénio para gerar o hidrogel tridimensional (3-D) para monitorar e analisar o crescimento axonal. O protocolo está centrado na cultura de pequenos pedaços de cérebros de roedores embrionários ou precoces no interior de um hidrogel 3-D formado pelo colágeno do tipo I derivado do tendão da cauda de rato com porosidade específica. Peças de tecido são cultivadas dentro do hidrogel e confrontados com fragmentos cerebrais específicos ou agregados celulares geneticamente modificados para produzir e secretar moléculas adequadas para a criação de um gradiente dentro da matriz porosa. As etapas deste protocolo são simples e reprodutíveis mas incluem etapas críticas a ser consideradas com cuidado durante seu desenvolvimento. Além disso, o comportamento de axônios crescentes pode ser monitorado e analisado diretamente usando um microscópio de fase-contraste ou um microscópio de fluorescência mono/multifóton após a fixação por métodos Immunocytochemical.

Introdução

Axônios neuronais, terminando em cones de crescimento axonal, migram longas distâncias através da matriz extracelular (ECM) do embrião sobre caminhos específicos para atingir seus alvos adequados. O cone de crescimento é a porção distal do AXON e é especializado para sentir o ambiente físico e molecular da célula1,2. Do ponto de vista molecular, os cones de crescimento são guiados por pelo menos quatro mecanismos moleculares diferentes: atração de contato, quimioatração, repulsão de contato e chemorepulsion desencadeada por diferentes pistas de orientação axonal3,4 , 5. º , 6. os processos mediados por contato podem ser parcialmente monitorados em culturas bidimensionais (2D) em substratos micropadronizados (por exemplo, com listras7,8 ou manchas9 contendo as moléculas). No entanto, axônios podem navegar para o seu alvo de forma não-diffusiva, sentindo várias moléculas atraentes e repulsivas de células guidepost no ambiente4,5,10. Aqui, nós descrevemos um método fácil da cultura 3-D para verific se uma molécula secretado induz efeitos chemorepulsive ou chemoattractive em axônios tornando-se.

Os primeiros estudos objetivaram determinar os efeitos das pistas de orientação AXON utilizadas culturas explantes em matrizes tridimensionais (3-D) para gerar gradientes simulando in vivo as condições11,12. Essa abordagem, juntamente com experimentos in vivo, permitiu a identificação de quatro grandes famílias de pistas de orientação: netrins, fendas, semaphorinas e ephrins4,5,6. Essas pistas moleculares e outros fatores13 são integrados pelos crescentes axônios, desencadeando a dinâmica dos complexos de adesão e as forças mecânicas transacionadoras através do citoesqueleto14,15,16. Para gerar gradientes moleculares em culturas 3-D para navegação axonal, pesquisadores pioneiros usaram substratos de coágulo plasmático17, que também foi utilizado para preparações organotípicas de fatia18. No entanto, em 1958, foi relatado um novo protocolo para a geração de hidrogéis de colágeno 3-D para estudar com os dispositivos da Maximow19, uma plataforma de cultura, utilizada em vários estudos adequados para observações microscópicas20. Outro estudo pioneiro relatou o gel de colágeno como uma ferramenta para incorporar fibroblastos humanos para estudar a diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos em processos de cicatrização de feridas21. Paralelamente, Lumsden e Davies aplicaram colágeno da derme bovina para analisar o efeito putativo do fator de crescimento do nervo (NGF) na orientação das fibras nervosas sensoriais22. Com o desenvolvimento de novas plataformas de cultura (por exemplo, placas multipoços) por diferentes empresas e laboratórios, as culturas colágenas foram adaptadas a esses novos dispositivos6,23,24,25 ,26. Paralelamente, um extrato de material de ECM derivado da linhagem de células tumorais de Engelbreth-Holm-Swarm foi disponibilizado comercialmente para ampliar esses estudos27.

Recentemente, vários protocolos foram desenvolvidos para gerar gradientes moleculares com papéis putativos na orientação do AXON usando hidrogéis 3-D (por exemplo, colágeno, fibrina, etc.) 28. Alternativamente, a molécula candidata pode ser imobilizada em diferentes concentrações em uma matriz porosa (por exemplo, NGF29) ou gerada pela cultura em uma pequena região dos agregados de células hidrogel 3-D secretando a molécula para gerar um radial gradiente4,23,24,25,26. A última possibilidade será explicada neste protocolo.

O procedimento apresentado aqui é um método fácil, rápido e altamente reprodutível baseado na análise do crescimento axonal em culturas 3-D do hidrogel do cérebro embrionário do rato. Em comparação com outros métodos, o protocolo é bem adequado para pesquisadores não treinados e pode ser totalmente desenvolvido após um treinamento curto (1-2 semanas). Neste protocolo, Nós isolamos primeiramente o colagénio das caudas adultas do rato para gerar mais matrizes 3-D em que os agregados genetically-modificados da pilha são cultivados na frente do tecido neuronal embrionário. Estes agregados de células formam gradientes químicos radiais de uma molécula candidata que provoca uma resposta para os axônios crescentes. Finalmente, a avaliação dos efeitos da molécula em axônios crescentes pode ser facilmente realizada usando uma microscopia de contraste de fase ou, alternativamente, métodos imunocitróxicos.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados as diretrizes e protocolos do Comitê de ética para experimentação animal (CEEA) da Universidade de Barcelona, e o protocolo para o uso de roedores neste estudo foi revisado e aprovado pelo CEEA do Universidade de Barcelona (CEEA aprovação #276/16 e 141/15).

1. purificação do colagénio da cauda do rato

  1. Colete adultos Sprague-Dawley caudas de ratos (8-9 semanas de idade) depois de sacrificar o animal seguindo as orientações éticas e enxaguar em 95% etanol. Coloque 2-4 caudas no gelo (4 ° c) e mantenha-os cobertos com gelo durante o processo.
  2. Para obter tendões da cauda, fixar a cauda nas vértebras mais caudais da cauda usando um hemostato e comprimir a cauda com um segundo hemostato posicionado em torno de 5-7 mm a partir do primeiro. Quebre a cauda girando-a agudamente com ambos os hemostats. Para fazer isso, dobre/desdobrar as vértebras várias vezes até que ele quebre.
  3. Puxe as vértebras lentamente com o hemostato para separar os tendões de sua bainha como ele sai. Neste momento, corte os tendões com pequenas tesouras. Mantenha estas partes do tendão em um prato de Petri estéril de 100 milímetros no gelo.
  4. Repita a fixação e deslize para o resto da cauda até que os tendões são totalmente extraídos.
  5. Repita os passos 1.2-1.4 para todas as caudas obtidas.
  6. Observe os tendões um microscópio. Descarte os vasos sanguíneos cortando com pequenas tesouras e segurando com fórceps fino reto para melhorar a pureza do tendão e enxaguar os tendões 3 vezes com água ultrapura.
  7. Colete 3-4 g de tendões molhados. Dissolver os tendões em 150 mL de 3% de ácido acético glacial a 4 ° c em um balão cônico de vidro de 200-250 mL para 24-36 h, agitação suave.
  8. Centrifugador a 20.000 x g por 1 h. Em paralelo, prepare a membrana da tubagem de diálise cortando uma peça de cerca de 10-15 cm de comprimento e ferva-a em água ultrapura contendo 1 mM de ácido etilenodiaminotraacético (EDTA) durante 15 min. Em seguida, enxague suavemente a membrana de diálise cuidadosamente com água ultrapura.
  9. Após a centrifugação, recolher o sobrenadante na membrana da tubagem de diálise por decantação. A pelota contem o material insolúvel ácido (proteínas não-collagenous) e o sobrenadante contem proteínas solúveis do colagénio.
  10. Dialyze o sobrenadante contra 2 L de estéril 0,1 x mínimo essencial águia média (MEM), pH 4,0 em um copo de vidro de 2-5 L. Dialyze por 3 dias. Mude a solução de 0.1 x MEM pelo menos duas vezes por dia verificando o pH em cada mudança antes de usar. Se o pH se tornou básico, modifique-o com algumas gotas de ácido acético a 0,1 M até que o pH seja 4,0.
  11. Após a diálise, adicione antibióticos (1,5 mL de penicilina/estreptomicina (Pen-Strep)) à solução de colágeno dialítico. Faça alíquotas de 5 mL da solução de colágeno e armazene a 4 ° c.
    Nota: A partir deste ponto, todos os procedimentos de manuseio devem ser realizados condições estéreis em uma capa de fluxo laminar.
  12. Prossiga com o teste de gelação da solução de colágeno preparada seguindo os próximos passos.
    1. Uma vez que o colágeno de ações é geralmente muito concentrado, prepare 3 diluições de trabalho (75%, 50% e 25% de solução de colágeno), diluindo o estoque em 0,1 x MEM, pH 4,0. O volume final recomendado para cada diluição de trabalho é de 5 mL. Em cada condição, verifique a concentração proteica usando um ensaio colorimétrico protéico.
    2. Coloque vários tubos de centrifugação cônicos vazios de 1,5 mL (um para cada diluição de trabalho), tubos de 10x MEM, solução de bicarbonato de sódio a 7,5% e diferentes diluições de trabalho de colágeno no gelo. Aguarde até que estes sejam arrefecidos.
    3. Adicionar 40-50 μL de 10x MEM a um tubo de centrifugação a frio (4 ° c). Em seguida, misture suavemente com 7-8 μL de solução de bicarbonato de sódio.
    4. Adicione 310-330 μL de uma das diferentes diluições de colágeno a este tubo e misture suavemente com a pipeta evitando qualquer formação de bolhas. Manter a mistura de bicarbonato de colágeno-MEM-sódio no gelo (4 ° c) durante pelo menos 5 min.
    5. Pipete 10-25 μL da mistura para um prato de Petri de 35 mm.
    6. Coloque a placa de Petri na incubadora CO2 definida a 37 ° c até que a geladura do hidrogel (± 15-20 min) seja observada.
    7. Repita os passos 1.12.3-1.12.6 para as restantes diluições de colágeno em diferentes pratos de Petri.
    8. Selecione a diluição de trabalho do colagénio que rende os melhores resultados.
      Nota: O melhor hidrogel gelificada deve ter uma textura translúcida uniforme, cor cinzenta e não deve ser irregular ou stringy. Em nossa experiência, uma diluição de 3:1 (colágeno: 0,1 x MEM) gera os melhores resultados experimentais.

2. preparação de agregados celulares (COS1) geneticamente modificados para secretar uma molécula candidata em hidrogéis de colágeno 3-D

  1. Placa 2 x 106 COS1 células em pratos de Petri de 35 mm e incubar com meio de cultura completo composto por 100 ml de D-mem contendo 10% (Vol/Vol) de soro bovino fetal inativado por calor, 0,5% (WT/vol) de glutamina e 1% (WT/vol) Pen/Strep em uma cultura celular incubadora, a fim de atingir 70-80% de confluência durante a noite. Prepare um prato de Petri para cada procedimento do transfection.
  2. O dia seguinte transfecção COS1 pilhas com o ADN que codifica a molécula do candidato (netrin-1 ou Sema3E) usando o método liposome-baseado do transfection que segue as instruções do fabricante.
    1. Para fazer isso, misture 250 μL de meio livre de soro e DNA (1-2 μg por condição) para um tubo de centrifugação de 1,5 mL (tubo de DNA) e misture. Incubar à temperatura ambiente (RT) durante 5 min. Prepare um segundo tubo (tubo lipossómico) adicionando 240 μL do meio livre de soro e 10 μL do reagente de transfecção lipossómica. Incubar em RT por 5 min.
    2. Após a incubação, adicione o conteúdo do tubo de DNA ao tubo lipossómico e misture suavemente. Agora incubar em RT por 15 min. Substitua o meio nas células cultivadas com 1,5 mL do meio livre de soro e adicione a mistura de DNA-lipossomas à placa de Petri lentamente Dropwise. Incubar por 3 h na incubadora da cultura da pilha do CO2 .
  3. Após 3 h de incubação do transfection, substitua o meio com o meio de cultura completo e incubar durante a noite na incubadora.
  4. No dia seguinte, enxágüe as células com 0,1 M Dulbecco ' s fosfato salina tamponado (D-PBS), tratar culturas com Trypsin-EDTA (800 μL por cada prato para 5-15 min na incubadora de CO2 ) e recolher células destacadas com 15 ml de meio de cultura completo.
  5. Centrifugar as células a 4 ° c a 130 x g durante 5 min. Após a centrifugação, remova a mídia e preserve a pelota contendo COS1 células no gelo.
  6. Repita os passos 1.12.3-1.12.6 para preparar a mistura de trabalho de colágeno.
  7. Adicionar 100-150 μL da mistura de colagénio à pelota das células transfectadas e misturar suavemente introduzindo e descendo e distribuindo 45-50 μL desta mistura numa placa de Petri (35 mm de diâmetro) para formar uma faixa uniforme de células colágenas de cerca de 1 a 1,5 cm de comprimento. Coloque o prato na incubadora a 37 ° c (5% CO2) até que a Geladura (± 15-20 min) seja observada.
  8. Prepare uma segunda tira contendo células de controle (transfection mock) em um segundo prato de cultura e placa-lo na incubadora (± 15-20 min) e quando a geladura é concluída adicionar 3-4 ml de aquecido (37 ° c) COS1 completo meio de cultura para cada prato contendo o gelificada as tiras das colagénio-pilhas e mantêm-nas na incubadora da cultura da pilha do CO2 . Depois disso, corte as tiras de células colágenas para gerar pequenas peças quadradas (400 a 500 μm de comprimento) usando um bisturi fino ou um helicóptero de tecido.
  9. Transfira todas as seções da mesma condição do transfection a um prato de Petri que contem 3-3.5 mL de meios de cultura neuronal (NCM) e verific um microscópio da dissecção a qualidade das partes. Mais uma vez, mantê-los na incubadora de cultura de células CO2 .
    Nota: O meio de cultura neuronal consiste em meio Neurobasal contendo 1-5% (Vol/Vol) de soro de cavalo inativado por calor, 2 mM de glutamina, 0,5% (WT/vol) de glicose, 1% (WT/vol) solução Pen-Strep e 0, 44% (WT/vol) NaHCO3. Assegure-se de que o pH esteja entre 7.2-7.3.

3. geração de explante embrionário para a cultura

  1. Esterilize as ferramentas cirúrgicas (tesouras, punho da lâmina do bisturi, fórceps reto e curvado) por autoclavagem depois das directrizes rotineiras da esterilização. Em paralelo, prepare 500 mL de solução equilibrada de sal de Hank-tampão de glicose e 4-5 pratos de Petri (100 mm de diâmetro) contendo 10 mL de HBSS-G. Coloque estas placas no gelo (4 ° c).
  2. Sacrifique o rato fêmea grávido (dia Embryonic 16,5) fora da área estéril, seguindo os procedimentos éticos aprovados. Corte os chifres do embrião com a tesoura da cavidade abdominal e coloc o em um grande prato de Petri que contem o HBSS-G frio.
  3. Coloque o prato na capa de fluxo laminar e extraia os embriões com fórceps reto. Coloque-os em um novo prato contendo HBSS-G frio. Em seguida, retire a pele do embrião usando fórceps pequeno e cuidadosamente dissecar o cérebro usando o fórceps curvo e reto. Coloque-os em um prato contendo HBSS-G frio.
  4. um microscópio dissecando, corte o cérebro ao meio ao longo da linha média para separar ambos os hemisférios com o bisturi ou a tesoura fina e remova o diencephalon, as meninges e os vasos sanguíneos das partes do cérebro com fórceps fino.
  5. Repita os passos 3.3-3.4 com o resto dos embriões. Não atrasar a dissecção por mais de 2 h para preservar a qualidade do tecido.
  6. Limpe todas as partes do picador de tecido com 100% de etanol (especialmente a placa de corte de politetrafluoroetileno (PTFE) e a lâmina de barbear). Mantenha o helicóptero do tecido na capa do fluxo laminar a iluminação UV por 15 minutos.
  7. Transfira cada peça de tecido (por exemplo, córtex com hipocampo) para a placa de corte do helicóptero do tecido. Para o hipocampo, coloque-o perpendicular à lâmina de barbear e obtenha secções de tecido de 450-500 μm de espessura.
  8. Prepare vários pratos de Petri de 35 mm com 3-4 mL de NCM completos e peças de tecido de transferência da placa de Chopper de tecido para os pratos de Petri. Muitos pratos podem ser necessários como regiões de interesse são dissecados.
  9. Termine a dissecção do tecido no NCM completo usando agulhas finas do tungstênio. Verifique a qualidade das fatias obtidas o microscópio de dissecação. Certifique-se de que as camadas são claramente identificáveis na óptica Darkfield e dissecar a região de interesse (por exemplo, região do CA do hipocampo) com agulhas de tungstênio. Descarte as fatias danificadas. Mantenha explantes do hipocampal no meio completo de NCM na incubadora do CO2 .

4. preparação de co-culturas 3-D em hidrogéis de colágeno

  1. Coloc diversas placas estéreis da cultura de 4 poços na capa do fluxo laminar e prepare uma mistura de trabalho do colagénio como indicada previamente nas etapas 1.12.2-1.12.6.
  2. Coloque 15-20 μL da mistura de hidrogel na parte inferior de um poço para produzir uma base de colágeno circular. Repita este passo para o resto dos poços. Não Prepare mais de cinco placas ao mesmo tempo para evitar a evaporação líquida excessiva da base do hidrogel.
  3. Mantenha os pratos na incubadora até que a gelação completa (± 15-20 min) seja observada e leve as placas para fora da incubadora somente quando a gelação estiver concluída. Verifique a qualidade do colágeno gelado.
  4. Transfira um pequeno pedaço de agregado celular COS1 com uma pipeta. Coloc o na base do hidrogel e coloc uma parte do tecido na mesma base com uma pipeta perto da parte de pilhas agregado em um explant-tamanho.
  5. Prepare uma nova mistura de colágeno de trabalho no gelo como nas etapas 1.12.2-1.12.6.
  6. Pipeta delicadamente 15-20 μL desta mistura nova e cubra o agregado do explante e da pilha. Um sanduíche-como A cultura do hidrogel será observado. Neste momento, re-orientar o explante com uma agulha de tungstênio multa (não toque no agregado celular COS1!), por isso enfrenta o agregado celular em ± 500-600 μm.
  7. Retorne a placa à incubadora até que a geladura esteja observada (± 10-15 min), e 0,5 mL do NCM completo suplementado com o suplemento de 2% B27 e mantenha culturas para 36 a 48 h na incubadora (37 ° c, 5% CO2).

5. fixação das co-culturas agregadas do explant-Cell e do procedimento de Immunocytochemical

  1. Após 36-48 h de incubação, remover o meio e enxaguar com 0,1 M fosfato tampão salino (PBS), pH 7,3. Posteriormente, fixar as culturas por 1 h com paraformaldeído 4% em tampão fosfato de 0,1 M (PB), pH 7,3, a 4 ° c.
  2. Retire o fixador e enxague suavemente as culturas 3-4 vezes (10-15 min cada) em 0,1 M PB, pH 7,3.
  3. Retire o sanduíche de hidrogel da parte inferior do poço com espátula ou pinça. Transfira o bloco de colágeno com um pincel fino para uma placa de cultura de 6 poços contendo 0,1 M de PBS com 0,5% de detergente não iônico.
  4. Incubar hidrogéis flutuantes livres na solução de bloqueio (10% de soro, 0,5% de surfactante não iônico e 0,2% de gelatina em 0,1 M PBS) para 2-3 h em RT com agitação suave.
  5. Enxágüe 3 vezes (10-15 min cada) com 0,1 M PBS contendo 0,5% de surfactante não iônico.
  6. Incubar com anticorpo primário diluído em PBS contendo 5% de soro, 0,5% de surfactante não iônico, 0,2% de gelatina e 0, 2% de azida sódica. Incubar com o anticorpo preliminar para 36-48 h em 4 ° c em um abanador.
    Nota: Geralmente um anticorpo de encontro à classe III β-tubulin (α-Tuj-1) (diluído 1:2000) é usado para definir o crescimento axonal em culturas do hidrogel 3-D.
  7. Após a incubação, enxague como na etapa 5,5.
  8. Incubar com anticorpo secundário para 4 h em RT (ou 6-7 h a 4 ° c) em um Shaker diluído em 5% soro, 0,5% surfactante não-iônico, e 0,2% gelatina. Um anticorpo biotinylated do anti-rato do cavalo (1:200 diluído) é usado neste experimento.
  9. Enxágüe culturas como em 5,5.
  10. Incubar as culturas durante 2 dias a 4 ° c com solução de complexo avidina-biotina (ABC) 1:100 diluída em PBS contendo 5% de soro, 0,5% de surfactante não iônico e 0,2% de gelatina. Alternativamente, use a peroxidase de rábano (HRP)-Tagged estreptavidina (diluído 1:300-400) no mesmo buffer.
  11. Enxágüe culturas como descrito em 5,5.
  12. Enxague as culturas várias vezes com 0,1 M tampão Tris-HCl, pH 7,6 por 1 h.
  13. Incubar as culturas com 0, 3% de 3,4 ′-diaminobenzidina hidrocloreto (DAB) solução em 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6.
  14. Adicionar 5-8 μL de 1% H2o2 e aguarde 10-15 min. Monitore o desenvolvimento de DAB um microscópio usando um objetivo de 4-10x.
  15. Pare a reacção removendo a solução DAB com tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,6.
  16. Enxágüe as culturas em PBS por 30 min (várias mudanças).
  17. Monte os hidrogéis em lâminas de vidro usando suportes de montagem aquosos.
  18. Analise o comprimento e a distribuição dos axônios dentro do hidrogel usando o plug-in de análise Sholl ou com o plug-in neuritej para o software ImageJ30.

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Resultados

Aqui, nós apresentamos uma metodologia extensamente acessível para estudar o crescimento axonal em culturas do colagénio do hidrogel 3-D do sistema nervoso embrionário do rato. Para este fim, Nós isolamos o colagénio das caudas adultas do rato para gerar as matrizes 3-D em que nós cultivou agregados genetically-modificados da pilha que expressam netrin-1 ou Sema3E confrontado com o tecido neuronal embrionário (por exemplo, região do CA do hipocampo). Estes agregados da pilha deram forma a um inclinação radialmente distri...

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Discussão

O crescimento de axônios em desenvolvimento é principalmente invasivo e inclui a degradação e a remodelação do ECM. Usando o procedimento aqui apresentado, os pesquisadores podem obter uma matriz 3-D homogênea formada pelo colágeno tipo I natural, em que os axônios (ou células) podem responder a um gradiente químico secretado por células geneticamente modificadas como eles fazem in vivo. Diferentes respostas axonais a gradientes de pistas atraentes ou inibitórias (proteínas, lipídios, etc.) podem ser facilmente comparada...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Tom Yohannan pelo Conselho editorial e M. segura-Feliu pela assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelo programa CERCA e pela Comissão para universidades e pesquisa do departamento de inovação, universidades e empresa da Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Este trabalho foi financiado pelo Ministério espanhol de pesquisa, inovação e Universidade (MEICO) através de BFU2015-67777-R e e RTI2018-099773-B-100, a rede espanhola prion (PRIONET Spain AGL2017-90665-REDT), eo Instituto Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Material
3,3′-Diaminobenzidina tetracloridrato 10 mg comprimidos (DAB)SigmaD5905
Ratos Sprague-Dawley adultos (8 a 9 semanas de idade) Criffa-Credo, Lyon, França
Complexo Avidina-biotina-peroxidase (ABC)Vector LabsPK-4000
B27 suplemento sem soro 50x Invitrogen17504-044
Kit de ensaio de proteína de ácido bicinchonínico (BCA)Pierce23225
vetores de plasmídeo
cDNA Linhas celulares COS1ATTCCRL-1570
D-(+)-glicoseSigma16325
D-(+)-glicose (solução a 45% em água) para meio neurobasal completoSigmaG8769
D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x) para meio de cultura COS1Invitrogen41966-029
Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato 10x (sem Ca2+ e Mg2++) (D-PBS) para culturasInvitrogen14200
Etanol merck108543
Ácido etilenodiaminotetracético sal dihidratado dissódico (EDTA)SigmaE5134
Mídia de montagem de fluorescência (por exemplo, Fluoromount-G ou similar)Ciências de Microscopia Eletrônica (EMS)17984-25
Gelatina em pó SigmaG1890
Ácido acético glacial (Panreac, cat. no. 211008)Panreac211008
Hank' s solução salina balanceada Invitrogen24020083
Soro fetal bovino inativado pelo calor Invitrogen10108-165
Soro de cavalo inativado por calor Invitrogen26050-088
Peróxido de hidrogênio (H2O2, 32 a 33% em água)Sigma316989
solução de L-glutamina 200 mM (100x) para meio neurobasal completo e COS1Invitrogen25030-024
Lipofectamine 2000 ReagenteInvitrogen11668-019
Camundongos fêmeas grávidas (dia embrionário 12,5 a 16,5; E12.5-16.5) Criffa-Credo, Lyon, França
Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM)Invitrogen11012-044
Anticorpo monoclonal contra classe III β-tubulina (clone TUJ-1)Biolegend801201
N-2 suplemento 100x Invitrogen17502-048
Meio neurobasal Invitrogen21103049
ParaformaldeídoMerck1,040,051,000
Solução de penicilina/estreptomicina 100x Invitrogen15140-22
Solução salina tamponada com fosfato 10x (PBS) para imunocitoquímicaInvitrogenAM9624
Anticorpo secundário: cavalo biotinilado anti-camundongo Vector LabsBA-2000
Meio sem soro (Opti-MEM)Invitrogen11058-021
Azida sódica Panreac162712
Solução de bicarbonato de sódio 7,5% Invitrogen25080-094
Grau de cultura estéril H2O SigmaW3500
TritonTM X-100 Base SigmaX100
Trizma SigmaT1503
Tripsina-EDTA (Tripsina (0,05% (peso/vol) com EDTA (1x)Invitrogen25300-054
Equipamento
1 tesoura curva grande e 1 pequena para dissecção Ferramentas finas Instrumentos ou tubos de centrífuga cônicos similares
de 1,5 mL Eppendorf ou tubos de centrífuga cônicos similares
de 15 mL Corning ou similar
2 hemostatos   Ferramentas finas Instrumentos ou similares
2 pequenas tesouras de dissecação retasFerramentas finas Instrumentos ou similares
200 mL para centrifugaçãoNalgene ou similar
Frascos
mL Copo
Placas de cultura de 4 e 6 poços Nunc176740 e 140675
Bombas de pipeta automáticas e pipetas plásticas estéreis descartáveis de 10 mL e 25 mL contendo filtro.Gilson, Brand, Eppendorf ou similar 
Pipetas automáticas, ponteiras de filtro estéreis e ponteiras estéreis atuaisGilson, Eppendorf ou similar
Microcentrífuga de bancada com rotor fixo angular Eppendorf, Beckman Coulter ou similar
Centrífuga refrigerada de bancada com rotor de balde oscilante (com adaptadores de tubo de 1,5, 15 e 50 mL)Eppendorf, Beckman Coulter ou similar
Incubadora de cultura de células a 37 &graus; C, 5% CO2 e 95% ar
Tubo de diálise membrana de celuloseSigmaD9402
Fechamentos de tubo de diálise Pipetas
Microscópio
Olympus SZ51 ou similar 
Centrífuga refrigerada de alta velocidade Beckman Coulter ou similar com rotor
Capuz
Grande 100 mm, 60 mm e pequeno 35 mm Ø placas de cultura de células Nunc  150679, 150288 e 150318, respectivamente
Agitador magnético e barras de rotação magnéticasIKA ou similar
Cortador de tecidos McIlwainMickle Laboratory Engineering
Um par de pinças retas finas e um par de pinças curvas Ferramentas finas Instrumentos ou similares
Lâminas de barbear para o picador
Bisturis (número 15 e 11)
Dois pares de espátulas finas para transferência de colágeno e pedaços de tecidoFerramentas finas Instrumentos ou similares
Tubos de centrífuga de cônicos de vidro estéreis de 200de vidro de 2 L de vidro descartáveis Sigma Z37101-7 de dissecação com óptica de campo escuro fixo angularde fluxo laminarde tecidos

Referências

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