Combinando análise de SDS-PAGE não redutora e reticulação química para detectar complexos multiméricos estabilizados por ligações de dissulfeto em células de mamíferos na cultura

Resumo

As ligações de dissulfeto têm sido conhecidas por muito tempo para estabilizar a estrutura de muitas proteínas. Um método simples para analisar complexos multimérica estabilizados por estas ligações é através da análise de SDS-PAGE não-reduzindo. Aqui, este método é ilustrado analisando-se a isoforma nuclear de dUTPase da linha de células de osteossarcoma óssea humana U-2 OS.

Resumo

As estruturas de muitas proteínas são estabilizadas através de ligações de dissulfeto covalente. Em trabalhos recentes, esse vínculo também foi classificado como uma modificação pós-translacional. Assim, é importante ser capaz de estudar esta modificação em células vivas. Um método simples para analisar estes complexos multimérica cisteína-estabilizados é através de um método de duas etapas de não-reduzindo a análise SDS-PAGE e o cross-linking do formaldehyde. Este método de duas etapas é vantajoso como o primeiro passo para desvendar complexos multiméricos estabilizados por ligações dissulfeto devido à sua facilidade técnica e baixo custo de operação. Aqui, a linha celular do osteosarcoma do osso humano U-2 ósmio é usada para ilustrar este método analisando especificamente o isoforma nuclear de dUTPase.

Introdução

As ligações de dissulfeto têm sido conhecidas por muito tempo para estabilizar a estrutura de muitas proteínas. Em trabalhos recentes, esse vínculo também foi classificado como uma modificação pós-translacional reversível, atuando como um "interruptor redox" baseado em cisteína, permitindo a modulação da função protéica, localização e interação^{1,2, 3,4}. Assim, é importante ser capaz de estudar esta modificação. Um método simples para analisar esses complexos multiméricos estabilizados com cisteína é através da análise de SDS-PAGE não reduto....

Protocolo

1. bloqueando os resíduos de cisteína livre usando Iodoacetamida

1. Cresça as pilhas U-2 do ósmio em um prato de 6 cm² a 50%-a confluência de 60% no meio essencial mínimo com glicose elevada que contem o soro bovino fetal de 10% e o piruvato de sódio de 1% em 37 ° c em 5% co₂.
2. Fazer um estoque fresco de 10 mM iodoacetamida apenas antes de usar, em seguida, descartar qualquer reagente não utilizado.
3. Adicione a iodoacetamida de concentração final de 0,1 mM diretamente nos meios de cultura celular. Agitar suavemente o prato à temperatura ambiente durante 2 min.

2. colhendo as células

Resultados

A dUTPase nuclear forma uma articulação dissulfeto intermolecular formando uma configuração de dímero estável através da interação de dois resíduos de cisteína posicionados no terceiro aminoácido de cada proteína monomérica¹¹. Isto é demonstrado na Figura 1a, B. Para garantir que essa articulação dissulfeto não foi uma interação não específica devido a anormalidades migratórias no ambiente não reduzido, a inclusão de u.......

Discussão

O método esboçado aqui dá um protocolo reto-forward para a análise de complexos multimérica estabilizados através dos LINKAGES do dissulfide. Este protocolo pode facilmente ser adaptado a outras linhas da cultura de pilha, tecidos e organismos permitindo uma escala de aplicações larga.

Um passo importante neste procedimento é garantir que as ligações dissulfeto não são uma consequência do procedimento de extração. Qualquer resíduo de cisteína livre pode ser bloqueado usando iodoacetamida

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
16% de géis TGX pré-fabricados	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2	prato VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Kit de detecção de ECL Amersham	GE
Aparelho de transferência de manchas	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Reagente de proteína Bradford	Biorad	5000006
Azul
BSA	Sinalização celular	99985
Tampão de lise celular	Sinalização celular	9803
Centrífuga	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Broca
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Aparelho de eletroforese	Invitrogen	A25977
Papel mata-borrão ocidental extra grosso	ThermoFisher	88610
Fetal soro bovino	Gibco	1932693
Formaldeído	ThermoFisher	28908
Homogeneizador
Glicerol	Sigma Aldrich	65516
Glicina	RPI	636050
Bloco de calor	Denville	10285-D
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Ácido clorídrico	VWR	2018010431
Iodoacetamida	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
Metanol	Pharmco	339000000
Leite em pó desnatado	Sinalização celular	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-click tube	Denville	C2170
Fonte de alimentação	Biorad	200120
Marcador Prestained	ThermoFisher	26619
Membrana PVDF	Biorad	162-0177
Rocker	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
Anticorpo secundário	Sinalização celular	70748
Raspador de células pequenas	Tygon	S-50HL classe VI
Cloreto de sódio	RPI	S23020
Piruvato de sódio	Gibco
Sonicator	Branson	450
Almofada de esponja para borrar	Invitrogen	E19051
Placa de agitação	Corning	PC353
Sacarose	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris Salino Tamponado, com Tween 20, pH 7,5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine tampão de corrida	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
Filme de raio-X	ThermoFisher	34090

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