Electroretinogram gravação no Zebrafish Larval usando eletrodo de esponja-ponta em forma de Cone de romance A

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo que simplifica a medição de luz electroretinogram evocado respostas de zebrafish larval. Um eletrodo de esponja-ponta cónica romance pode ajudar a tornar o estudo de desenvolvimento visual no zebrafish larval usando o electroretinogram ERG mais fácil de conseguir com resultados confiáveis e menor custo.

Resumo

O peixe-zebra (Danio rerio) é comumente usado como um modelo de vertebrados em estudos do desenvolvimento e é particularmente adequado para a neurociência visual. Para a medição funcional de desempenho visual, estudos de electroretinografia (ERG) é um método não-invasivo ideal, que tem sido bem estabelecido em espécies de vertebrados superiores. Esta abordagem é cada vez mais sendo usada para examinar a função visual no zebrafish, incluindo durante os estágios iniciais de desenvolvimento larvas. No entanto, o eletrodo de gravação mais comumente usados para larval zebrafish ERG até à data é o eléctrodo de micropipeta de vidro, que exige equipamentos especializados para sua fabricação, apresentando um desafio para os laboratórios com recursos limitados. Aqui, apresentamos um protocolo ERG zebrafish larval usando um eletrodo esponja-ponta cônica. O eléctrodo de romance é mais fácil fabricação e punho, mais econômico e menos susceptível de danificar o olho larval que a micropipeta de vidro. Como métodos ERG anteriormente publicados, o atual protocolo pode avaliar função da retina exterior através do fotoreceptor e respostas de célula bipolar, o a - e b-onda, respectivamente. O protocolo claramente pode ilustrar o refinamento da função visual ao longo do desenvolvimento precoce de larvas de peixe-zebra, apoiando o utilitário, sensibilidade e confiabilidade do eléctrodo romance. O eletrodo simplificado é particularmente útil quando estabelecer um novo sistema ERG ou modificação de aparelho ERG pequeno-animal existente para medição de zebrafish, auxiliando os pesquisadores em Neurociências visuais para usar o zebrafish do organismo modelo.

Introdução

O peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se um modelo de vertebrados genético amplamente utilizado, incluindo estudos de Neurociências visuais. A crescente popularidade desta espécie pode ser atribuída ao vantagens, incluindo a facilidade de manipulação genética, o sistema de visual vertebrado altamente conservado (neurônio e tipos de morfologia anatômica e organização genética subjacente), alta fecundidade e menor custo de produção animal em comparação com modelos mamíferos¹. O electroretinogram não-invasiva (ERG) tem sido muito utilizado clinicamente para avaliar a função visual humana e na configuração de laboratório para quantificar a visão em uma variedade de espécies de grandes e pequenas, incluindo roedores e larval zebrafish^{2,3 , 4 , 5}. os componentes ERG mais comumente analisados são a uma onda e onda b, provenientes do sensor de luz fotorreceptores e interneurônios bipolares, respectivamente. No zebrafish larval, camadas distintas na retina são estabelecidas pela fertilização pós de 3 dias (dpf) e a morfologia do cone fotorreceptoras terminal sinapses maduro antes 4 dpf^6,7. Função da retina exterior de zebrafish larval é assim estabelecida antes dpf 4, significando que o ERG é mensurável nesta idade precoce em diante. Por causa do curto ciclo experimental e as propriedades de alto rendimento do modelo, o ERG foi aplicado ao larval zebrafish para avaliação funcional dos modelos da doença, analisando o desenvolvimento de visão e da retina de cor, estudando visual dos ritmos circadianos e teste de drogas^8,9,10,11,12.

No entanto, as abordagens atuais para zebrafish larval ERG tem algumas complexidades que podem dificultar a adoptar. Publicado zebrafish larval ERG protocolos geralmente usam uma micropipeta de vidro cheia com líquido condutor, como a gravação de eletrodo^3,4,5,13, que exige uma micropipeta de alta qualidade Dica³. Equipamentos especializados, tais como um puxador de micropipeta e em alguns casos, um microforge, são necessários para o seu fabrico. Isto pode ser um desafio para os laboratórios com recursos limitados e leva a custos extras, mesmo quando adapta disponíveis pequenos animais ERG sistemas para medição de função visual zebrafish larval. Mesmo quando alisado, a ponta afiada micropipeta pode danificar a superfície do olho larval. Além disso, micropipeta comercial os suportes para eletrofisiologia são construídos com um fio de prata fixo. Estas fixa os fios se tornam passivadas após uso repetitivo, exigindo a compra de novos titulares, levando a manutenção do aumento dos custos.

Aqui nós descrevemos um método de ERG usando um eletrodo gravação de esponja-ponta em forma de cone, que é particularmente útil para configurações ERG pequeno-animal estabelecidas para medições de ERG zebrafish larval a adaptação. O eletrodo é feito facilmente usando a esponja comum de acetato de polivinila (PVA) e fio de prata fino sem outros equipamentos especializados. Nossos dados mostram que este romance eletrodo é sensível e confiável o suficiente para demonstrar o desenvolvimento funcional de circuitos neurais da retina no zebrafish larval entre 4 e 7 dpf. O eletrodo de ponta em esponja econômico e prático pode ser útil para pesquisadores, o estabelecimento de novos sistemas ERG ou modificando os sistemas existentes de pequenos animais, para estudos de zebrafish.

Protocolo

Electroretinogram (ERG) todos os procedimentos foram realizados de acordo com as disposições do código de prática para o cuidado da saúde nacional australiano e o Medical Research Council e o uso de animais e foram aprovados pelo Comitê de ética animal institucional na Universidade de Melbourne.

1. preparação buffer

1. Preparar o 10x buffer de peixinho Ringer (1.25 M NaCl, 26 mM KCl, 25 mm CaCl₂, 10mm MgCl₂, glicose de 100 mM, 100 mM HEPES) usando água de osmose reversa (RO). Ajuste o buffer para pH 7,8 e esterilizar o buffer usando filtro de 0,22 μm. Armazene o buffer 10x a 4 ° C como o estoque de solução³.
   Nota: O 10x buffer de Ringer deve ser usado dentro de 3 meses.
2. No dia do experimento, fazer tampão peixinho Ringer 1x diluindo o 10x buffer de peixinho Ringer usando água de osmose reversa.
   Nota: O tampão de peixinho Ringer 1x é usado para saturar a esponja do PVA, incluindo a esponja usada para a colocação de zebrafish larval e a esponja na ponta do eletrodo de gravação.

2. eletrodo preparação

1. Prepare o eletrodo gravação de esponja em forma de cone.
   1. Corte a extremidade macho da extensão de chumbo eléctrodo de platina e retire da extremidade 10mm do revestimento exterior de politetrafluoroetileno isolamento usando uma lâmina de bisturi. Tomar cuidado para não danificar o fio interno de chumbo o eletrodo.
   2. Corte um comprimento de 40 mm de fio de prata (0,3 mm de diâmetro) e aparafuse-a firmemente para o eletrodo de chumbo por entrelaçando-se o fio de prata com o fio interno. Encase articulação usando fita isolante, deixando uma ~ 15 mm de comprimento de fio de prata exposto (figura 1A).
   3. Galvanize o fio prateado com cloreto de usando uma fonte de 9 V DC para 60 s para melhorar a condução do sinal. Mergulhe a ponta de prata exposta em solução salina normal e ligue a outra extremidade ao terminal positivo da bateria. Conecte o outro fio ao terminal negativo da bateria e mergulhe a outra extremidade do fio na salina².
      Nota: Alternativamente, cloração o fio de prata por imersão durante 1 hora numa solução de água sanitária (ingrediente ativo hipoclorito de sódio de 42 g/L).
   4. Corte um quadrado de ~ 20 mm x 20 mm de PVA esponja usando uma tesoura para fazer um cone (figura 1A). Sature a esponja usando 1 x buffer de Ringer. Sob um microscópio com uma barra de escala na ocular, use uma lâmina de bisturi para moldar o ápice do cone de ~ 40 µm de diâmetro. Ar seco a esponja cônica em tecido de papel absorvente até que seja sólido.
      Nota: A esponja PVA expande significativamente quando saturado, assim é importante que a esponja primeiro é saturada com soro fisiológico antes de moldar o ápice do cone.
   5. Após cloração d', ar seco o fio de prata sobre um tecido absorvente 5 min. inserir o fio de prata para a seca, sólida, em forma de cone de esponja PVA através da base do cone. Isole qualquer excesso metal exposto usando fita de máscara para reduzir artefatos fotovoltaicos (Figura 1B-C).
      Nota: Após cada sessão experimental, retire a esponja o fio de prata. Lave a esponja usando água de osmose reversa e ar seco para reutilização. Para garantir a coleta de sinal ideal, recomenda-se a única utilização de fio de prata. Esponjas PVA não devem ser reutilizadas mais de 5 vezes.
   6. No dia do experimento, mergulhe a esponja-ponta do eletrodo gravação em 1x buffer de Ringer pelo menos 15 min saturar totalmente a esponja.
2. Prepare eletrodos de referência, conforme descrito acima, mas sem anexar a ponta de esponja.
3. Obter o eléctrodo de terra comercialmente.

3. Zebrafish preparação

1. Escuro adaptar zebrafish larvas durante a noite (> 8h) antes de gravações, colocando o zebrafish em um tubo de 15 mL (< 20 larvas por tubo) envolto em folha de alumínio em uma incubadora escura. Retire a tampa para garantir o suprimento de oxigênio adequado.
2. No dia da gravação, aperte a tampa para o tubo de Falcão enrolado da folha contendo larvas e certifique-se de que o tubo é à prova de luz. Larvas de transporte para o laboratório ERG.
3. Coloque o peixe em caixas de Petri no escuro com o auxílio de fraca iluminação vermelha de um diodo emissor de luz (LED; 17.4 cd.m^-2, λ_máx 600 nm). Cobrir os pratos de Petri usando toalhas à prova de luz para minimizar a exposição à luz.

4. esponja plataforma preparação

1. Corte um retângulo de esponja seca de PVA para caber confortavelmente em uma placa de Petri de 35mm. Certifique-se que a espessura da esponja deve ser aproximadamente igual à profundidade da caixa de Petri.
2. Faça um pequeno corte na vertical através de uma extremidade da esponja para acomodar o fio de prata do eletrodo de referência.
3. Mergulhe a esponja PVA em tampão de peixinho Ringer até saturado 1x. Em seguida, coloque a esponja em um prato de petri limpa 35-mm. Use uma toalha de papel para absorver o líquido extra até que nenhuma solução exala de esponja em resposta a uma imprensa de dedo leve.

5. animal e o posicionamento do eletrodo

1. Anestesia as larvas usando metanosulfonato de 0,02%, diluído em tampão de peixinho Ringer 1x.
2. Use um 3 mL pipeta Pasteur para transferir uma larva anestesiada em um quadrado de papel toalha (~ 3 cm²).
3. Coloque a toalha de papel contendo a larva na esponja úmida utilizando a pinça. Use um pincel fino embebido em buffer de Ringer para ajustar a posição da larva. Certifique-se de que um olho virado para cima, isolados de qualquer líquido nas proximidades no quadrado de papel toalha por baixo da larva.
4. Esmalte do corpo larval, excluindo a cabeça, com olhos gel para manter a larva húmida durante a gravação de ERG hidratante.
5. Posicione a placa de Petri com plataforma de esponja em uma plataforma pequena de água aquecida na frente do estímulo de luz Ganzfeld tigela situado dentro de uma gaiola de Faraday (Figura 1).
   Nota: A manutenção da temperatura da esponja e do corpo larval garante estável ERG de sinais.
6. Introduza o eléctrodo de referência o corte feito na esponja plataforma (Figura 1).
7. Conecte o eléctrodo de terra obtidos comercialmente para a gaiola de Faraday.
8. Anexar o eletrodo gravação a um eléctrodo e fixe o suporte para o braço estereotáxica de um micromanipulador (Figura 1). Use um 3 mL pipeta Pasteur para pingar uma gota de solução de Ringer na ponta do eletrodo para re-saturação de esponja de 1x.
9. Posicione o microscópio na gaiola de Faraday sobre a plataforma ERG para colocação do eletrodo.
   Nota: Iluminação deve ser fornecida por um LED vermelho ofuscante (17,4 cd.m^-2, λ_máx 600 nm) para permitir a observação da larva e a colocação do eletrodo ativo, mantendo-se dark-adaptation.
10. Ajuste a posição da plataforma de esponja para permitir a observação da larva sob o microscópio. Em seguida, use o tecido absorvente para remover o excesso de líquido de ponta de esponja do eletrodo.
11. Coloque o eletrodo ativo que toca suavemente a superfície da córnea central do olho larval zebrafish (Figura 1E).
12. Movendo a panela Ganzfeld para a plataforma de esponja e certifique-se de que a larva é coberta pela bacia.
13. Feche a gaiola de Faraday para reduzir ruído electromagnético estranho.

6. Electroretinogram gravação

1. Use o software de computador do sistema particular de ERG (consulte tabela de materiais para obter detalhes) acionar o estímulo e aquisição de dados baseado nas configurações recomendadas abaixo².
   1. Defina a taxa de amostragem do sistema de 4kHz sobre um ms 650 gravação janela (2.560 pontos) do software de aquisição.
   2. Defina o ganho do sistema a × 1.000.
   3. Configurar a filtragem de passa-banda do sistema 1 – 300 Hz.
   4. Use um filtro de entalhe para reduzir a 60 Hz (ou 50 Hz, dependendo da frequência de utilidade local) ruído.
      Nota: O nível de ruído ideal deve ser não mais do que ± 10 µV.
2. Inicie a coleta de dados utilizando o procedimento descrito abaixo.
   1. Use um único teste-flash (0.06 log cd.s/m²) para medir uma teste de resposta do olho para avaliar o posicionamento dos eletrodos.
      Nota: Esta intensidade de flash de teste deve resultar em uma amplitude de onda b maior que 25 µV em larvas de 4-dpf. Se uma resposta robusta não pode ser medida, então reposicionar os eléctrodos e fazer outro teste flash para confirmar que os eléctrodos estão bem posicionados.
   2. Após o teste-flash, permitir que o animal a escuridão se adaptar por 3 min em completa escuridão antes de gravações.
   3. Apresentar flashes do regulador de intensidade de luz mais brilhante.
   4. Médios sinais através de repetições de acordo com o nível de sinal-ruído.
      Nota: Geralmente, média mais sinais nos níveis de luz mais não ofuscantes (não menos de 3 repetições) e menos nos níveis de luz mais brilhantes (geralmente 1 repetição). Aumentar gradualmente o intervalo inter estímulo de 10 a 60 s do nível de luz mais não ofuscante para mais brilhantes. Um protocolo de exemplo é mostrado na tabela 1.
   5. Após as gravações, humanamente mate as larvas usando metanosulfonato de 0,1%.

7. análise

1. Medir a amplitude de uma onda da linha de base para o negativo através de uma onda e a amplitude da onda-b do negativo através de uma onda até ao pico da onda-b positivo.
2. Medir os tempos de a - e b-onda implícitos desde início de estímulo para a calha de um-onda e o pico da onda-b, respectivamente.

Resultados

Esta seção fornece resultados representativos para medições de ERG tomadas diariamente de 4 a 7 dpf. De 4 dpf, ERG respostas show robustos componentes a e b-onda, que surgem de fotorreceptores e células bipolares, respectivamente. Em cada idade testada, a amplitude da onda-b aumentou com a intensidade de luz (Figura 2-; Figura 3). Notavelmente, a sensibilidade da retina larval zebrafish para flashes redutor aumentada com a idade. O a - e b-on...

Discussão

Leituras funcionais como o ERG tornaram-se cada vez mais importantes na suíte de ferramentas usadas para estudar o zebrafish larval^8,9,12,14. Devido ao pequeno tamanho do olho zebrafish larval, micropipetas de vidro foram adaptadas como gravação eletrodos em protocolos mais publicado^3,4,5,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,22 µ filtro m	Millex GP	SLGP033RS	Filtra o tampão de ringar de peixinho dourado de 10&vezes; para esterilização
Seringa de 1 mL	Terumo	DVR-5175	Com um 30G &vezes; ½ " agulha para adicionar gotas de solução salina à ponta da esponja do eletrodo para evitar o ressecamento e o aumento do ruído nos sinais ERG.
30 G &vezes; ½ " agulha	Terumo	NN*3013R	Para adicionar solução salina ao eletrodo da ponta do sopnge.
Bioamplificador	ADInstruments	ML135	Para amplificar sinais ERG.
Solução de alvejante	King White	9333441000973	Para um método alternativo de cloração do eletrodo de fita. Ingrediente ativo: 42 g/L de hipoclorito de sódio.
Banho-maria de circulação	Lauda-Ko?nigshoffen	MGW Lauda	Usado para fazer a plataforma aquecida a água.
Eletrodo de chumbo	Grass Telefactor	F-E2-30	Cabos de platina para conectar eletrodos de fio de prata ao amplificador.
Gaiola de Faraday	Internacional		Para manter a adaptação escura e incluir a configuração Ganzfeld para melhorar a relação sinal-ruído.
Ganzfeld Bowl	International		Estimulador de luz personalizado: 36 mm de diâmetro, tamanho de abertura de 13 cm.
Luxeon LEDs	Phillips Light Co.		Para estimulação de luz vinte LEDs de 5W e um de 1W.
Micromanipulador	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	Segura o eletrodo de gravação durante os experimentos.
Microsoft Office Excel	Microsoft	versão 2010	Software de planilha para análise de dados.
Gel hidratante para os olhos	GenTeal Gel	9319099315560	Usado para cobrir larvas de peixe-zebra durante as gravações para evitar a desidratação. Ingrediente ativo: 0,3% de hipromelose e 0,22% de carbômero 980.
Pipeta Pasteur	Copan	200C	Usada para transferir larvas de peixe-zebra com cuidado.
Sistema de aquisição de dados	Powerlab ADInstruments	ML785	Controla os LEDs para gerar estímulos.
Esponja PVA	MeiCheLe	R-1675	Para a colocação de larvas de peixe-zebra e fazer o eletrodo em forma de cone ti
Solução salina	Aaxis Pacific	13317002	Para galvanoplastia de eletrodo de fio de prata.
Scope Software	ADInstruments	versão 3.7.6	Aciona simultaneamente o estímulo através do sistema Powerlab e coleta dados
Prata (fio redondo fino)	A& E metal	0,3 mm	Usado para fazer eletrodos ERG de gravação e referência.
Microscópio estéreo	Leica	M80	Usado para moldar e medir o ápice da esponja em forma de cone (com barra de escala na ocular). Posicionado na gaiola de Faraday para colocação de eletrodos.
Tricocaína	Sigma-aldrich	E10521-50G	Para anaetetizar larvas de peixe-zebra.
Plataforma aquecida	a água feita sob medida		Para manter a temperatura da plataforma de esponja e do corpo larval durante as gravações de ERG