Capturando a molécula pequena comunicação entre os tecidos e células usando a imagem latente de espectrometria de massa

Resumo

Um novo método de preparação da amostra foi desenvolvido para acomodar coculture célula e tecido para detectar a troca de pequena molécula usando espectrometria de massa de imagens.

Resumo

Espectrometria de massa (IMS) de imagem rotineiramente aplicou-se a três tipos de amostras: cortes histologicos, esferoides e colónias microbianas. Estes tipos de amostra foram analisados usando laser assistida por matriz dessorção/ionização tempo-de-voo espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS) para visualizar a distribuição de proteínas, lípidos e metabolitos em toda a amostra biológica de interesse. Nós desenvolvemos um método de preparação de amostra romance que combina os pontos fortes das três aplicações anteriores para abordar uma abordagem underexplored para identificar a comunicação química em câncer, por semeadura de culturas de células de mamíferos em agarose em coculture com tecidos saudáveis, seguidos por dessecação da amostra. Células e tecidos de mamíferos são cocultured nas proximidades, permitindo a comunicação química via difusão entre os tecidos e células. Em pontos específicos de tempo, a amostra com base em agarose é seco da mesma maneira como colónias microbianas preparado para análise IMS. Nosso método foi desenvolvido para modelar a comunicação entre o câncer de ovário serosa da classe elevada, derivado de Falópio como ele interage com o ovário durante a metástase. Otimização da preparação amostra resultou na identificação de norepinefrina como um componente químico chave no microambiente do ovário. Esse método recentemente desenvolvido pode ser aplicado a outros sistemas biológicos que exigem uma compreensão da comunicação química entre células adjacentes ou tecidos.

Introdução

Imagem de espectrometria de massa (IMS) foi otimizado para caracterizar a distribuição espacial das características moleculares em três aplicações: fatias de tecido, esferoides e colónias microbianas^1,2,3. Fatias de tecido podem ser usadas para avaliar a localização de metabólitos no contexto de condições biológicas em um host, ou alvo ou segmentados em um intervalo específico de massa. No entanto, diferenças entre características moleculares são as mais significativas e óbvio quando um tecido saudável é comparado a uma condição de doente, por exemplo, um tumor. Esta abordagem IMS é particularmente adaptada para detecção de biomarcadores da doença, no entanto, adquirir amostras de tecido em fases distintas na progressão da doença (tais como notas de tumor) opõe-se à identificação dos sinais que pode ser importante para a iniciação do doença. O intercâmbio de informações através do espaço é uma característica onipresente de muitos sistemas biológicos, e fatias de tecido não podem capturar este relé químico dinâmico. Uma técnica que é capaz de visualizar a difusão e a troca química é IMS das colónias microbianas cultivadas em placas de ágar; pequenas moléculas são capazes de difundir através de e através do ágar-ágar e podem ser capturadas através do laser assistida por matriz (MALDI-TOF) de dessorção/ionização espectrometria de massa⁴. Esta configuração de crescimento pode ser usada para identificar moléculas trocadas entre entidades biológicas distintas (colônias) e também pode determinar a direção de produção do metabólito. A plataforma originalmente projetada para o crescimento da colônia microbiana foi adaptada para explorar o metabolismo primário de tecido explantes cultivados com células de mamíferos, e IMS foi utilizado para avaliar a dinâmica troca de química em um sistema de mamíferos in vitro.

Nos últimos anos, tornou-se claro que o câncer de ovário serosa de alto grau (HGSOC) muitas vezes se origina no epitélio da trompa de Falópio (FTE) e então metastatiza para o ovário durante cedo doença desenvolvimento^{5,6, 7 , 8}. a razão que FTE oncogenicidade células se espalhou para o ovário, onde grandes tumores eventualmente formam e metastatizam ainda mais, é atualmente incerto. A pesquisa anterior centrou-se sobre o papel das proteínas ovarianos primária metástases para o ovário; no entanto, recentemente demonstrou que a transição de um saudável para um tecido oncogenicidade resulta em enormes perturbações do metabolismo celular e altera a produção de pequenas moléculas^9,10,11. Portanto, formulamos a hipótese que pequenas moléculas trocadas entre o ETI e o ovário podem ser parcialmente responsáveis por metástase de primário de HGSOC.

Usando nosso procedimento IMS recém-desenvolvido, determinamos que coculture de FTE oncogenicidade e tecido ovariano induz a produção de norepinefrina do ovário. No entanto, outros tipos de célula ou células FTE normais não provocam este efeito. Um extraordinário benefício desse método é que a produção molecular e troca de sinais que representam moléculas reais podem ser visualizados, assim, mesmo em um coculture é possível determinar a fonte do sinal. Esta é uma vantagem com a análise de amostras homogeneizadas, onde todas as informações espaciais são perdidas. Em nosso sistema de modelo, conseguimos atribuir claramente a produção de noradrenalina para o ovário. A noradrenalina tem sido associada à metástase e chemoresistance de câncer de ovário, e nossa detecção desta molécula validou que o novo método IMS pode descobrir moléculas biologicamente relevantes^{12,13, 14}. esta validação permite-nos propor que esta nova aplicação do IMS pode ser particularmente útil para a investigação de grupos que estão tentando identificar moléculas pequenas em ambientes coculture e entender os primeiros eventos que influenciam a transformação de células e metástase. O objectivo geral deste método é elucidar a identidade e a distribuição espacial de pequenas moléculas durante o intercâmbio entre os tecidos e órgãos, representados por em vitro culturas de células 3D ou tecido ex vivo .

Protocolo

Todos os procedimentos de animais estavam em conformidade com a institutos nacionais de saúde orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório e aprovaram pelo Comitê de uso institucional do Animal e cuidados (IACUC) na Universidade de Illinois em Chicago.

1. preparação dos reagentes

1. Manter células de epitélio ovidutária murino (MOE) a 37° C com 5% CO₂ em uma incubadora umidificada no alfa mídia meio essencial mínimo (αMEM), suplementada com 10% de soro fetal bovino selênio (FBS), 2 mM L-glutamina, insulina 10 mg/mL, transferrina, (ITS) , ng/mL 1.8 fator de crescimento epidérmico (EGF), 100 U/mL penicilina-estreptomicina, gentamicina 1 mg/mL e 18.2 ng/mL estradiol-17 β. Passe as células a cada 3-4 dias, garantindo que existem células suficientes no mesmo dia os ratos vão ser sacrificados.
2. Prepare a agarose 2% misturando-se 1 g de agarose de baixo ponto de fusão com 50 mL de água destilada. Autoclave o agarose, deixar arrefecer, e então alíquota (1 mL) em 2 mL de tubos (ver Tabela de materiais) antes de agarose solidifica. Agarose pode ser armazenado a-20 º C por tempo indeterminado.
3. Prepare pelo menos 2 mL de médio (DMEM) meios de comunicação modificado águia de 1 x Dulbecco.
4. Para a matriz para MALDI-TOF MS, prepare-se 10 mL de 5 mg/mL ácido alfa-ciano-4-hyroxycinnamic de 1:1 (CHCA): ácido benzoico (DHB) (ver Tabela de materiais) em 90:10 ACN:H₂O + 0,1% o ácido trifluoroacético (TFA). Proceda à sonicação solução até matriz é dissolvido.

2. mouse colônia e remoção do ovário

1. Manter casais reprodutores de camundongos CD-1 usando procedimentos padrão de habitação. Perto do dia do parto, verificar os ratos todos os dias para que a idade dos filhotes é conhecida.
2. Eutanásia em filhotes com 16 – 18 dias de idade por inalação de CO₂ por diretrizes do NIH. Entregar o CO₂ (100%) em um fluxo taxa de 10%-20% volume por minuto de câmara e continuar durante dois minutos depois de respiração parou. Confirme a eutanásia por deslocamento cervical.
3. Desinfecte todos os equipamentos cirúrgicos submergindo em etanol a 70%. Aquecer L-15 meios de comunicação a Leibovitz com 1 x penicilina-estreptomicina 37 ° c.
4. Molhe a superfície abdominal com etanol a 70% para desinfetar a área e minimizar a contaminação com cabelo. Alcance a pele que cobre a parede abdominal usando romba fórceps e uso tesoura cirúrgica tornar-se uma grande forma de V corte através da pele e a parede abdominal, expondo os órgãos internos.
5. Mova os órgãos internos para o lado usando fórceps. Individualmente agarrar cada corno uterino com uma pinça fina e levante ligeiramente.
6. Localize o ovário, que será no final do corno uterino, imediatamente abaixo do rim. Use uma tesoura cirúrgica para dissecar o ovário livre de tecido conjuntivo. Em seguida, corte a trompa ovário ao meio.
7. Mover o ovário, oviduto e aproximadamente uma metade de cada corno uterino para mídia de L-15 do Leibovitz previamente aquecido.
8. Sob um microscópio dissecar cuidadosamente mover cada ovário de bursa circundante, libertando-o do oviduto, bursa e qualquer tecido adiposo. Mover-se para um novo prato de mídia do L-15 do Leibovitz cada ovário.
9. Corte cada ovário ao meio axialmente. Manter as peças no ovário (agora chamadas de explantes) mantidas a 37 ° C até chapeamento de agarose.

3. criação e incubando o Slide ITO-tratada para Cocultures

1. Cocultures indivisos
   1. Dissolver o agarose a 70 ° C, em um prato quente.
   2. Coloque o divisor 8 poços em cima tinoxide o índio (ITO)-slide tratada (figura 1A). O fundo de borracha na linha divisória auxilia na adesão ao slide, mas certifique-se de aplicar uma pressão descendente suave contínua durante chapeamento de agarose para garantir que nenhum escape ou mistura entre poços.
   3. Recolher pilhas em um tubo cônico de 15 mL, centrifugador (5 min a 800 rpm) e ressuspender a 50 mil células por 150 µ l em 1 x DMEM de mídia. Se uma densidade de célula diferente é ideal, certifique-se que nesta etapa a suspensão celular é 2x a densidade final desejada (por exemplo, para uma concentração final de 50.000 células em 300 µ l, densidade celular neste passo é 50.000 células em 150 µ l).
   4. Antes do chapeamento cultura celular, adicionar explante ovário ao centro do poço (figura 1B).
   5. Adicione agarose para cada cultura de células em tubos individuais 2ml antes do chapeamento. Para cada poço, combine 200 µ l de suspensão de células e 200 µ l de agarose liquefeito em um tubo de 2 mL. Por exemplo, para quatro poços, combine 800 µ l de suspensão de células e 800 µ l de agarose 2%. Uma mistura ficarão sobre, mas fazendo um pouco mais do que necessário evita bolhas de ar durante a pipetagem.
      1. Adicione agarose para culturas de células individuais, imediatamente antes do chapeamento essa cultura de célula. A agarose será legal em menos de um minuto, então esteja preparado para placa rapidamente.
   6. Imediatamente adicione 300 µ l da mistura de célula/agarose a cada poço (Figura 1). A Figura 1 mostra três condições de célula e a condição de uma mídia, que cada um chapeado com e sem um ovário.
   7. Incube o slide em 37 ° C e 5% CO₂ em uma incubadora umidificada.
2. Cocultures divididas.
   1. Corte os divisores de plástico fino, liso (Figura 2A).
      Nota: Esta experiência usa os lados de uma bacia de mídia descartável estéril, porque eles são lisos e finos. Cortá-los só larga o suficiente para se encaixar confortavelmente a hipotenusa do poço (~ 13 mm).
   2. Dissolver o agarose a 70 ° C, em um prato quente.
   3. Coloque o divisor 8-bem em cima do slide ITO-tratada (Figura 2B). O fundo de borracha na linha divisória auxilia na adesão ao slide, mas certifique-se de aplicar uma pressão descendente suave contínua durante chapeamento de agarose para garantir que nenhum escape ou mistura entre poços.
   4. Recolher pilhas em um tubo cônico de 15 mL, centrifugador (5 min a 800 rpm) e ressuspender a 50 mil células por 150 µ l em 1 x DMEM de mídia. Se uma densidade de célula diferente é ideal, certifique-se que, neste passo, a suspensão de células é 2 x a densidade final desejado (por exemplo, para uma concentração final de 50.000 células em 300 µ l, densidade celular neste passo é 50.000 células em 150 µ l).
   5. Inserir divisores de plástico na diagonal em poços (Figura 2).
   6. Adicione agarose à cada suspensão de células um uma hora antes do chapeamento. Para cada poço, combinam-se 100 µ l de suspensão de células e 100 µ l de agarose liquefeito em um tubo de 2 mL. Por exemplo, para quatro poços, combine 400 µ l de cultura celular e 400 µ l de agarose 2%. Uma mistura de célula/agarose ficarão sobre mas fazendo um pouco mais do que necessário evita bolhas de ar durante a pipetagem.
      1. Adicione agarose para culturas de células individuais, imediatamente antes do chapeamento essa cultura de célula. A agarose será legal em menos de um minuto, então esteja preparado para placa rapidamente.
   7. De um lado da linha divisória, placa 150 µ l de mistura de célula/agarose. Permitir que a agarose esfriar e solidificar (cerca de um minuto) e em seguida retire o divisor (Figura 2D).
   8. Coloque o ovário explante no centro da metade vazia do poço. Mistura de mídia/agarose lugar 150 µ l sobre a parte superior do ovário e apenas no lado correto do poço (Figura 2E).
   9. Incube o slide em 37 ° C e 5% CO₂ em uma incubadora umidificada.

4. Slide de secagem e preparação para MALDI-TOF-MS

1. Depois de quatro dias (ou qualquer ponto do tempo preferido), retire o divisor de câmara os plugues de agarose e o slide (Figura 1). Suavemente retire os lados do agarose da câmara com uma espátula plana e puxe suavemente a câmara para cima, tomando cuidado para não mover qualquer plugue de agarose. Se movem, suavemente, substituí-los para que eles não estão tocando um ao outro.
2. Coloque o slide em um forno de 37 ° C por aproximadamente 4h, girar 90° cada h.
   Nota: A rotação do slide é importante para garantir a distribuição de calor mesmo por toda a amostra.
3. Depois de seco, retire a lâmina do forno (Figura 1E).
4. Aplique a solução de matriz usando o pulverizador (Figura 1F), com os seguintes parâmetros: temperatura = 30 ° C, vazão = 0,2 mL/min, o número de passes = 8, direção = CC e distância do bocal = 40 mm.
   Nota: Em vez de um pulverizador de matriz, um aerógrafo artístico pode ser usado para aplicar líquido matriz. A mesma solução de matriz pode ser usada para pulverizar, mas aproximadamente duas vezes mais solução é necessária. Com o slide pinçado para que pendura-se verticalmente, pulverizar o slide de um ângulo de 90° de aproximadamente um pé de distância (adaptado de Hoffmann¹⁵) até a matriz de camada é visível.
5. Adicione 1 µ l de calibrant (fósforo vermelho para alvos < 500 promotora, uma mistura de peptídeo (ver Tabela de materiais) para alvos < Da 5.000) para claro local no slide. Fósforo vermelho não requer nenhuma mistura com matrix, mas a mistura de peptídeo requer mistura 1:1 com matriz para ionização de auxílio. Espere por calibrant secar.
6. Desenhar um X usando um marcador permanente em cada canto do slide e levar uma imagem óptica usando um scanner ou uma câmera em 1.200 dpi.

5. imagem latente de aquisição de dados de espectrometria de massa

1. Abra uma nova sequência sobre o software de análise de dados IMS (ver Tabela de materiais). Defina a largura de varredura para resolução espacial desejada, pelo menos 50 µm.
2. Carregar a imagem ótica do slide para o software de análise e definidos três ensinam pontos usando as interseções nos x ' s desenhados em cada canto.
3. Designar as regiões de interesse para a imagem latente do software de aquisição e nomeá-los de acordo.
4. Calibrar o aparelho usando o software de aquisição de dados (consulte a Tabela de materiais) dentro de erro de 5 ppm.
5. Salve o método otimizado e começar a correr. Este experimento otimizado os seguintes parâmetros: polaridade = positivo, Detector = Reflectron, tamanho de Laser = 2, poder do Laser = 50%, ganho de detector de modo Reflector = x 3.

6. processamento de dados IMS

1. Importar arquivo de .mis no software estatístico (ver Tabela de materiais) para análise de significância.

Resultados

Um slide de ITO otimamente secado resultará em uma amostra dessecada plana com mínima para sem rugas através da superfície do agarose e pedaços de agarose que mantêm uma separação espacial no slide (Figura 3). A figura 3A mostra ideal de secagem, enquanto a Figura 3B mostra as rugas que devem ser evitadas. Essa otimização requer cuidadoso monitoramento do slide no forno, como vezes exatas podem varia...

Discussão

Há um crescente corpo de evidências que implique o papel da noradrenalina em HGSOC^12,17,18, e esta técnica contribuiu com informações mais mecanicistas. Pelo menos oito condições biológicas presentes no mesmo slide, o método pode conta para controles biológicos tais como gene e especificidade da célula, bem como controles de mídia em um único IMS executar. Enquanto o método foi otimizado avaliar trocadas pequenas moléculas em um...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos Falcon de 15 mL	Denville	C1017-O	Para coletar células
Câmara de 8 poços (câmara Millipore EZ-slide)	Millipore	PEZGS0816	Reaproveitado da câmara Millipore Millicell EZ-slide slide
Acetonitrila	Sigma-Aldrich	34998-4L	Solvente para matriz pulverizada
Alpha Minimum Essential Medium (α MEM)	Fisher	10-022-CV	Meios de cultura celular
Autoflex velocidade MALDI-TOF LRF	Bruker		Para análise de dados IMS
Centrífuga	Eppendorf	5810 R	Para coletar células e remover sobrenadante
CHCA Matrix	Bruker Daltonic	8201344	Matrix pulverizado em lâmina seca
DHB Matrix	Bruker Daltonic	8201346	Matrix pulverizado em lâmina seca
Bisturis descartáveis	Fisher	22-079-707	Para remoção dos ovários
Tesoura de dissecação	Fisher	13-804-6	Para remoção dos ovários
DMEM Media	Gibco	11995-065	Mídia misturada com
fator de crescimento epidérmico	Peprotech Inc.	100-15 Suplemento de	mídia de cultura celular
Eppendorf tubes	Genesee Scientific	22-282	Para alíquotas de agarose
Estradiol-17β	Simga-Aldrich	E2758	Suplemento de mídia de cultura de células
Soro bovino fetal	Denville	fb5001	Suplemento de mídia de cultura de células
FlexControl 3.4	de aquisição de dados	Bruker Daltonic
FlexImaging 4.1	Bruker Daltonic		Software de análise de dados IMS
Fórceps (fino) Fórceps		22-327379	Para remoção do ovários
Gentamicina	Cellgro	30-005-CR	Suplemento de meios de cultura celular
Insulina, Transferrina, Selênio (ITS)	Sigma-Aldrich	11074547001	Suplemento de meios de cultura celular
Lâmina revestida com ITO	Bruker	8237001	Plataforma para incubação de co-cultura
Meio L-15 Gibco		11415064	Meio usado durante o tecido dissecação
L-glutamina	Gibco	25030-081	Suplemento de meios de cultura celular
Agarose de baixo ponto de fusão	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Misturado com meios para revestimento
Bacia de meios	Corning	4870	Usado para cortar divisórias de plástico para câmaras divididas
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140-122	Suplemento
de meios de cultura celularPadrão de calibração de peptídeos	Bruker Daltonic	8206195	Calibrante para faixa de massa média
Phophorus red	Sigma-Aldrich	343-242-5G	Calibrante para faixa de baixa massa
SCiLS Lab 2015	Bruker Daltonic		Análise estatística de dados IMS
Fórceps cirúrgico (rombudo)	Fisher	08-875-8B	Para remoção dos ovários
TFA	Fisher Tecnologias	A116-50	Adicionado à solução matricial
TM Pulverizador	HTX Technologies		Para aplicação de matriz