Method Article

Capturando a molécula pequena comunicação entre os tecidos e células usando a imagem latente de espectrometria de massa

DOI:

10.3791/59490

⸱

April 3rd, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy, University of Illinois at Chicago, 2Department of Animal Science, University of Illinois at Urbana-Champaign

In This Article

Summary

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Um novo método de preparação da amostra foi desenvolvido para acomodar coculture célula e tecido para detectar a troca de pequena molécula usando espectrometria de massa de imagens.

Abstract

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Espectrometria de massa (IMS) de imagem rotineiramente aplicou-se a três tipos de amostras: cortes histologicos, esferoides e colónias microbianas. Estes tipos de amostra foram analisados usando laser assistida por matriz dessorção/ionização tempo-de-voo espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS) para visualizar a distribuição de proteínas, lípidos e metabolitos em toda a amostra biológica de interesse. Nós desenvolvemos um método de preparação de amostra romance que combina os pontos fortes das três aplicações anteriores para abordar uma abordagem underexplored para identificar a comunicação química em câncer, por semeadura de culturas de células de mamíferos em agarose em coculture com tecidos saudáveis, seguidos por dessecação da amostra. Células e tecidos de mamíferos são cocultured nas proximidades, permitindo a comunicação química via difusão entre os tecidos e células. Em pontos específicos de tempo, a amostra com base em agarose é seco da mesma maneira como colónias microbianas preparado para análise IMS. Nosso método foi desenvolvido para modelar a comunicação entre o câncer de ovário serosa da classe elevada, derivado de Falópio como ele interage com o ovário durante a metástase. Otimização da preparação amostra resultou na identificação de norepinefrina como um componente químico chave no microambiente do ovário. Esse método recentemente desenvolvido pode ser aplicado a outros sistemas biológicos que exigem uma compreensão da comunicação química entre células adjacentes ou tecidos.

Introduction

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Imagem de espectrometria de massa (IMS) foi otimizado para caracterizar a distribuição espacial das características moleculares em três aplicações: fatias de tecido, esferoides e colónias microbianas1,2,3. Fatias de tecido podem ser usadas para avaliar a localização de metabólitos no contexto de condições biológicas em um host, ou alvo ou segmentados em um intervalo específico de massa. No entanto, diferenças entre características moleculares são as mais significativas e óbvio quando um tecido saudável é comparado a uma condição de doente, por exemplo, um tumor. Esta abordage....

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Protocol

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Todos os procedimentos de animais estavam em conformidade com a institutos nacionais de saúde orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório e aprovaram pelo Comitê de uso institucional do Animal e cuidados (IACUC) na Universidade de Illinois em Chicago.

1. preparação dos reagentes

  1. Manter células de epitélio ovidutária murino (MOE) a 37° C com 5% CO2 em uma incubadora umidificada no alfa mídia meio essencial mínimo (αMEM), suplementada com 10% de soro fetal bovino selênio (FBS), 2 mM L-glutamina, insulina 10 mg/mL, transferrina, (ITS) , ng/mL 1.8 fator de crescimento epidérmico (EGF), 100 U/mL penicilina-e....

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Results

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Um slide de ITO otimamente secado resultará em uma amostra dessecada plana com mínima para sem rugas através da superfície do agarose e pedaços de agarose que mantêm uma separação espacial no slide (Figura 3). A figura 3A mostra ideal de secagem, enquanto a Figura 3B mostra as rugas que devem ser evitadas. Essa otimização requer cuidadoso monitoramento do slide no forno, como vezes exatas podem varia.......

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Discussion

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Há um crescente corpo de evidências que implique o papel da noradrenalina em HGSOC12,17,18, e esta técnica contribuiu com informações mais mecanicistas. Pelo menos oito condições biológicas presentes no mesmo slide, o método pode conta para controles biológicos tais como gene e especificidade da célula, bem como controles de mídia em um único IMS executar. Enquanto o método foi otimizado avaliar trocadas pequenas moléculas em um.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a divulgar

Acknowledgements

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O financiamento foi fornecido pelo consórcio biomédica Chicago, com o apoio dos fundos Searle em Chicago comunidade Trust (C-076) (LMS); Universidade de Illinois em Chicago inicialização fundos (LMS); Grant 543296 da Aliança de fundo de pesquisa de câncer de ovário (MD); e UG3 ES029073 (J.E.B) e pelo centro nacional para avançar translacional Ciências, Instituto Nacional de saúde, através da concessão de UL1TR002003 (JEB & LMS).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubos Falcon de 15 mLDenvilleC1017-OPara coletar células
Câmara de 8 poços (câmara Millipore EZ-slide)MilliporePEZGS0816Reaproveitado da câmara Millipore Millicell EZ-slide slide
AcetonitrilaSigma-Aldrich34998-4LSolvente para matriz pulverizada
Alpha Minimum Essential Medium (α MEM)Fisher10-022-CVMeios de cultura celular
Autoflex velocidade MALDI-TOF LRFBrukerPara análise de dados IMS
CentrífugaEppendorf5810 RPara coletar células e remover sobrenadante
CHCA MatrixBruker Daltonic8201344Matrix pulverizado em lâmina seca
DHB MatrixBruker Daltonic8201346Matrix pulverizado em lâmina seca
Bisturis descartáveisFisher22-079-707Para remoção dos ovários
Tesoura de dissecaçãoFisher13-804-6Para remoção dos ovários
DMEM MediaGibco11995-065Mídia misturada com
fator de crescimento epidérmicoPeprotech Inc.100-15 Suplemento demídia de cultura celular
Eppendorf tubesGenesee Scientific22-282Para alíquotas de agarose
Estradiol-17βSimga-AldrichE2758Suplemento de mídia de cultura de células
Soro bovino fetalDenvillefb5001Suplemento de mídia de cultura de células
FlexControl 3.4de aquisição de dadosBruker Daltonic
FlexImaging 4.1Bruker DaltonicSoftware de análise de dados IMS
Fórceps (fino) Fórceps22-327379Para remoção do ovários
GentamicinaCellgro30-005-CRSuplemento de meios de cultura celular
Insulina, Transferrina, Selênio (ITS)Sigma-Aldrich11074547001Suplemento de meios de cultura celular
Lâmina revestida com ITOBruker8237001Plataforma para incubação de co-cultura
Meio L-15 Gibco11415064Meio usado durante o tecido dissecação
L-glutaminaGibco25030-081Suplemento de meios de cultura celular
Agarose de baixo ponto de fusãoSigma-AldrichA9414-10GMisturado com meios para revestimento
Bacia de meiosCorning4870Usado para cortar divisórias de plástico para câmaras divididas
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-122Suplemento
de meios de cultura celularPadrão de calibração de peptídeosBruker Daltonic8206195Calibrante para faixa de massa média
Phophorus redSigma-Aldrich343-242-5GCalibrante para faixa de baixa massa
SCiLS Lab 2015Bruker DaltonicAnálise estatística de dados IMS
Fórceps cirúrgico (rombudo)Fisher08-875-8BPara remoção dos ovários
TFAFisher TecnologiasA116-50Adicionado à solução matricial
TM PulverizadorHTX TechnologiesPara aplicação de matriz
de agarose Software IMS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837(2016).
  2. Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C.

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Imaging Mass SpectrometryMALDI TOF MSSmall Molecule CommunicationOvarian Cancer MetastasisAgarose CocultureTissue Cell CocultureSample Preparation MethodDesiccation ProcessSpatial IntegrityLabel Free Analysis

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