Isolação e avaliação quantitativa de pilhas da escova dos Tracheas do rato

Summary

As pilhas da escova são pilhas epithelial quimiosensoriais colinérgicos raras encontradas na traquéia ingênua do rato. Devido a seus números limitados, a avaliação ex vivo de seu papel funcional na imunidade e na remodelação da via aérea é desafiante. Nós descrevemos um método para a isolação de pilhas tracheal da escova pelo fluxo cytometry.

Abstract

Células da escova traqueal são células epiteliais quimiosensoriais colinérgicas pronta para transmitir sinais do lúmen das vias aéreas para os sistemas imunológico e nervoso. Eles são parte de uma família de células epiteliais quimiosensoriais que incluem células de tufo na mucosa intestinal, células de pincel na traquéia, e células quimiosensoriais e microvillous solitárias na mucosa nasal. As pilhas de chemosensory em compartimentos epithelial diferentes compartilham dos marcadores intracelular chaves e de uma assinatura transcricional do núcleo, mas igualmente para indicar a heterogeneidade transcricional significativa, reflexivo provável do ambiente local do tecido. A isolação de pilhas tracheal da escova das suspensões da única pilha é exigida para definir a função destas pilhas epithelial raras em detalhe, mas seu isolamento é desafiante, potencial devido à interação próxima entre pilhas da escova e terminações de nervo tracheal ou devido à composição da via aérea específica de junções apertadas e aderens. Aqui, nós descrevemos um procedimento para a isolação de pilhas da escova do epitélio tracheal do rato. O método é baseado em uma separação inicial do epitélio tracheal da submucosa, permitindo uma incubação mais curta subseqüente da folha epithelial com Papain. Este procedimento oferece uma solução rápida e conveniente para a classificação citométrica do fluxo e a análise funcional de pilhas tracheal viáveis da escova.

Introduction

As pilhas da escova pertencem a uma classe de pilhas epithelial quimiossensorial caracterizadas pela expressão de receptores amargos do gosto e da maquinaria do transdução do receptor do gosto encontradas em pilhas do botão do gosto. Ao contrário das pilhas do botão do gosto, as pilhas epithelial quimiossensorial são dispersadas em superfícies epithelial e são referidas como pilhas quimiossensorial solitárias (SCCs) e pilhas microvillous no epitélio nasal^1,2, pilhas da escova na traqueia ^3,4e células de tufo no intestino^5,6. Células epiteliais que expressam receptores de paladar amargo e a máquina de transdução de paladar amargo também são encontradas na uretra^7,8 e no tubo auditivo⁹. As pilhas da escova da via aérea têm funções originais em respostas neurogênica e imunes da via aérea. Eles são células quimiosensoriais produtoras de acetilcolina que evocam reflexos respiratórios protetores após a ativação com compostos amargos e metabólitos bacterianos como substâncias que detectam quorum¹⁰. As pilhas da escova da via aérea são igualmente a fonte epithelial dominante da via aérea de IL-25, que regula o tipo aeroalergeno-eliciado-2 inflamação nas vias aéreas³.

A caracterização do transcriptoma completo de células de escova de vias aéreas inferiores e sua resposta a estímulos ambientais tem sido limitada por seus baixos números no epitélio traqueal e números muito limitados além dos grandes brônquios¹⁰. As técnicas usadas para o isolamento de células quimiosensoriais do epitélio intestinal não produziram números proporcionalmente altos da traquéia, possivelmente por causa dos contatos íntimos de células da escova traqueal com terminações nervosas¹⁰ ou outras fatores tecido-específicos na mucosa respiratória tais como a composição de aderens e de proteínas apertadas da junção. Os relatórios recentes da isolação bem sucedida de pilhas tracheal da escova em números mais elevados para a análise de sequenciamento do RNA da única pilha empregou uma incubação de 2 h com papaína ou uma incubação de 18 h com soros^11,12. Uma vez que incubações mais longas com enzimas digestivas podem diminuir a viabilidade celular e alterar o perfil transcricional das células dos tecidos digeridos¹³, isso poderia viés de análise comparativa com outras populações epiteliais quimiosensoriais.

Aqui, nós relatamos um método para a isolação de pilhas tracheal da escova para arranjar em seqüência³do RNA. O tratamento da traquéia com Dispase da elevado-dose separa o epitélio da submucosa. A digestão subseqüente da folha epithelial com papaína permite a recuperação excelente desta pilha estrutural.

Protocol

Antes de realizar os seguintes experimentos, assegure-se de que todos os protocolos e uso de cuidados com animais sejam aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) e realizado de acordo com o "guia para o cuidado e uso de Animais de laboratório "(8^ª edição, 2011) e as orientações chegam. Todos os procedimentos descritos abaixo foram revisados e aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais do hospital Brigham e Women ' s.

1. preparação de reagentes

1. Prepare a solução de digestão Dispase, que é uma solução de PBS contendo 16 U/mL de Dispase e 20 μg/mL de DNase I. Certifique-se de que o pó Dispase está totalmente dissolvido antes de aquecer a solução num banho de água a 37 ° c.
2. Adicione 5% de soro bovino fetal inativado por calor (FBS) ao meio de águia de Dulbecco Modified (DMEM) para fazer uma solução de parada.
3. Prepare o tampão de Tyrode I: Adicione 26 U/mL de papaína (20 μL/mL de 48 U/mg de solução de papaína) e 10 μL/mL de L-cisteína ao tampão de HEPES-Tyrode sem cálcio.
4. Prepare o tampão de Tyrode II: Adicione 2 μL/mL de leupeptina (5 mg/mL) ao tampão de HEPES-Tyrode com cálcio.
5. Prepare o tampão do FACS: Use a solução de sal equilibrada de Hanks (HBSS) sem cálcio, magnésio & o vermelho do phenol, suplementado com o ácido ethylenediaminetetraacético de 2 milímetros (EDTA) e adicione 2% FBS.

2. dissecção da traquéia do rato

Nota: Os ratos usados neste protocolo são bate-papo^(BAC)-EGFP (B6. CG-TG (RP23-268L19-EGFP) 2Mik/J), 3-6 meses de idade de ambos os sexos. Minimize a exposição do tecido para direcionar a luz para reduzir o fotobranqueamento de eGFP.

1. Eutanizar o rato com 100 mg/kg solução de eutanásia pentobarbital injetada intraperitonealmente ou usando protocolos padrão aprovados pelo IACUC.
2. Fixe o rato em uma placa cirúrgica na posição supina com as 21 agulhas de G com extremidades superiores e mais baixas estendidas. Pulverize a pele com 70% de EtOH para higienizar a área.
3. Usando fórceps reto, levante a pele e o pêlo do abdômen e faça uma incisão no centro com tesouras de dissecação (tesoura reta, 3 cm). Usando a tesoura, separe a pele do tecido subcutâneo do abdômen para a mandibula. Enquanto segurando o tecido subcutâneo com o fórceps, faça uma pequena incisão com a tesoura no centro da parede abdominal.
4. Abra o peritônio com uma incisão em forma de V. Usando o fórceps, mova suavemente o intestino delgado para o lado, localize a aorta abdominal e a veia cava e faça uma incisão com a tesoura de dissecação para permitir a exsanguagem rápida.
5. Localize o diafragma. Usando uma agulha de 18 G, faça uma abertura no diafragma logo abaixo do esterno para esvaziar os pulmões. Separe cuidadosamente o diafragma da caixa torácica usando uma tesoura de dissecação reta afiada para cortar ao longo da base das costelas.
6. Usando o fórceps, levante a extremidade exposta do esterno e corte o esterno longitudinalmente da base da caixa torácica até o pescoço. Faça uma incisão cervical central com tesouras retas curtas (2 cm) e separe os dois lóbulos da glândula submandibular.
7. Retire cuidadosamente o tecido conjuntivo circundante e o Timo sobrejacente a Carina com um par de fórceps de alta precisão de ponto fino.
8. Dissecar a traquéia livre primeiramente separando a extremidade proximal a nível do epiglote e então dissecando a extremidade longe do ponto de origem a nível da bifurcação da traquéia.
9. Localize a epiglote e corte a traquéia longitudinalmente da epiglote para a Carina.

3. digestão epitelial traqueal

1. Coloque a traqueia em um tubo de 1,5 mL contendo 750 μL de solução de digestão de Dispase pré-aquecido (a 37 ° c). Incubar em uma coqueteleira a 200 rpm por 40 min à temperatura ambiente. Cubra o tubo com folha de alumínio para reduzir a exposição à luz direta.
2. Adicionar 750 μL de DMEM a frio com 5% de FBS para interromper a reacção. Coloque no gelo.
3. Transfira a traqueia para uma placa de Petri (100 mm x 15 mm) e coloque-a um microscópio de dissecação. Oriente a traquéia com o lado epitelial virado para cima. A traqueia longitudinalmente dissecada tem uma forma semicilíndrica mantida pelos anéis cartilaginosos. O epitélio está na superfície côncava.
4. Tether a área do epiglote da traquéia com o fórceps reto ao prato de Petri e usando um bisturi descartável do tamanho 22, raspe o epitélio fora da traqueia. A camada epitelial separa-se como uma folha translúcida.
5. Mince o epitélio com o bisturi. Transfira a camada epitelial para um tubo de 2 mL.
6. Enxague a placa de Petri com 750 μL de tampão Tyrode I e transfira para o tubo de 2 mL que contém a camada epitelial.
7. Incubar a camada epitelial traqueal em tampão Tyrode I durante 30 min a 37 ° c em uma coqueteleira a 200 rpm. Cubra o tubo com folha de alumínio para reduzir a exposição à luz direta.
8. Adicionar 750 μL de tampão Tyrode II a frio. Vórtice o tecido digerido vigorosamente para 20-30 s. triturar o homogeneato com uma seringa presa a uma agulha de 18 G 10 vezes.  Mudar para uma agulha calibre 21 G e triturar mais 10-20 vezes.
9. Filtre as células através de um filtro de 100 μm em um tubo cônico de 50 mL. Adicionar 30:1 Vol/Vol de buffer FACS frio.
10. Girar em 350 x g por 10 min a 4 ° c e descartar o sobrenadante. Ressuscita o pellet em tampão FACS frio e transfere a suspensão para um tubo de poliestireno de 12 mm x 75 mm (5 mL). Gire novamente em 350 x g por 10 min a 4 ° c e descarte o sobrenadante.
11. Resuspenda o pellet em 100 μL de tampão FACS.
12. Adicionar 1 μL de anticorpo CD16/32 de bloqueio do rato para bloquear a ligação não específica e incubar durante 15 min no gelo. Não lave.
13. Adicione os seguintes anticorpos e os respectivos controles de isotipo: Pacific Blue anti-mouse CD45 ou Rat IgG2a, k (0,25 μg/10⁶ Cells in 100 μl volume) e aloficocianina (APC) anti-mouse epcam ou Rat IgG2b, k (0,5 μg/10⁶ células em 100 μl de volume) anticorpos monoclonais. Incubar por 45 min no gelo protegido da luz direta. Adicionar 4,5 mL de tampão FACS frio, misturar e girar a 350 x g durante 10 min a 4 ° c. Descarte o tampão FACS e resuspenda o pellet em 300 μL de tampão FACS frio.
14. Adicionar iodeto de propiídio (PI) (5 μg/mL) imediatamente antes da triagem citométrica do fluxo.
    Nota: As células de pincel têm uma forma irregular com vários processos que podem potencialmente aumentar sua aderência aos filtros (Figura 3C). Comparamos os filtros de 30 mm a 70 mm e 100 mm e descobrimos que os maiores filtros de poros garantiram melhores rendimentos. Além, o trituration completo da suspensão da pilha após a digestão do papaína melhora significativamente os rendimentos da pilha da escova. Recomendamos a utilização de uma agulha de 18G para a trituração inicial seguida de um furo menor (agulha de 21 ou 23 G) para uma dissociação mais fina das células.

4. estratégia de gating do fluxo da citometria

1. Identifique as células dos detritos por ângulo de dispersão de avanço e lado. Exclua os doublets usando a altura de dispersão para frente e largura e altura de dispersão lateral e largura. Os doublets seriam as células que têm valores de largura alta.
2. Dentro das células individuais, identifique as células ao vivo como a população que é PI negativa.
3. Dentro das células individuais ao vivo, identifique o CD45 baixo para células negativas com base no controle do isotipo.
4. Dentro das CD45 células baixas/negativas, identifique as células EpCAM positivas que também são eGFP positivo (no canal FITC). Esta é a população de células de pincel (Figura 2a).

Results

Este procedimento foi implementado com sucesso para isolar as células da escova traqueal para sequenciamento de RNA³. Após isolamento da traquéia e digestão do tecido com protocolo de 2 etapas (Figura 1), as células foram coletadas e CORADAS com CD45 e epcam com rótulo fluorescently após exclusão das células mortas com PI. Após o gating para fora doublets baseado em características da dispersão da frente e do lado, nós definimos pilhas da escova como baixo/negativo pa...

Discussion

Nós encontramos que uma combinação de tratamento do Dispase da elevado-dose para o minuto 40 seguido por um tratamento curto do papaína (30 minutos) fornece um protocolo óptimo para a digestão tracheal e a isolação da pilha da escova. Esta combinação evita a digestão extensiva e produz o rendimento o mais elevado de pilhas da escova, comparado aos protocolos alternativos.

Enquanto a digestão pulmonar para extrair células hematopoiéticas classicamente se baseou em enzimas digestivas leves como ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpos
Anti-GFP (Ig policlonal de cabra)	Abcam	cat# ab5450
APC anti-mouse CD326 (EpCAM)  (G8.8)	Biolegend	cat # 118214
APC Rat IgG2a, controle de isotipo k	Biolegend	cat # 400511
DAPI	Biolegend	cat # 422801
Burro anti-cabra IgG (H + L) Anticorpo secundário altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor 488	Life Technologies / Molecular Probes	cat # A-11055
Cabra normal IgG	R & D Systems	cat#AB-108-C
Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11)	Biolegend	cat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, controle de isotipo k	Biolegend	cat#400627
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Anticorpo	Biolegend	cat#101320
Produtos químicos, peptídeos e proteínas
Dispase	Gato Gibco	# 17105041
DNase I	Sigma	cat # 10104159001
HEPES-Tyrode' s Tampão sem cálcio (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0,4 mM NaH2PO4, 0,25% BSA, 5,5 mM de glicose. Preparado em água de 18,2 megaohms e filtrado através de 0,22 µ Filtro	Boston BioProducts	cat# PY-912
Tyrode' s Solução (tamponada com HEPES) 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 25 mM de HEPES, 2 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl2 e 10 mM de glicose. Preparado em água de 18,2 megaohms e filtrado através de 0,22 µ m. )	Boston BioProducts	cat# BSS-355
L-Cisteína	Sigma	cat# C7352
Sal de trifluoroacetato de leupeptina	Sigma	cat# L2023
Papaína de látex de mamão	Sigma	cat# P3125
Iodeto de propídio	Sigma	cat# P4170
Modelos experimentais: Organismos/Cepas
ChATBAC-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)	The Jackson Laboratory	7902
Equipment
LSM 800 com sistema confocal Airyscan  em um  Microscópio Invertido Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss
LSRFortessa	BD	647465
Equipamento descartável
Tubos estéreis de 1,5 mL	Thomas Scientific	1157C86
Tubo de Poysterene de fundo redondo, 12 mm x 75 mm estilo	Falcon	14-959-1A
Tubo cônico de polipropileno de 50 mL, 30 mm x 115 mm Bisturi	de 352098		estilo Falcon
no.12	Fisher Scientific	NC9999403
placa de Petri, 100 mm x 15 mm Estilo	Falcon	351029
Filtro de células estéreis, 100 μ m	Fisherbrand	gato#22363549