As pilhas da escova são pilhas epithelial quimiosensoriais colinérgicos raras encontradas na traquéia ingênua do rato. Devido a seus números limitados, a avaliação ex vivo de seu papel funcional na imunidade e na remodelação da via aérea é desafiante. Nós descrevemos um método para a isolação de pilhas tracheal da escova pelo fluxo cytometry.
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Artigo de método
Isolação e avaliação quantitativa de pilhas da escova dos Tracheas do rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células da escova traqueal são células epiteliais quimiosensoriais colinérgicas pronta para transmitir sinais do lúmen das vias aéreas para os sistemas imunológico e nervoso. Eles são parte de uma família de células epiteliais quimiosensoriais que incluem células de tufo na mucosa intestinal, células de pincel na traquéia, e células quimiosensoriais e microvillous solitárias na mucosa nasal. As pilhas de chemosensory em compartimentos epithelial diferentes compartilham dos marcadores intracelular chaves e de uma assinatura transcricional do núcleo, mas igualmente para indicar a heterogeneidade transcricional significativa, reflexivo provável do ambiente local do tecido. A isolação de pilhas tracheal da escova das suspensões da única pilha é exigida para definir a função destas pilhas epithelial raras em detalhe, mas seu isolamento é desafiante, potencial devido à interação próxima entre pilhas da escova e terminações de nervo tracheal ou devido à composição da via aérea específica de junções apertadas e aderens. Aqui, nós descrevemos um procedimento para a isolação de pilhas da escova do epitélio tracheal do rato. O método é baseado em uma separação inicial do epitélio tracheal da submucosa, permitindo uma incubação mais curta subseqüente da folha epithelial com Papain. Este procedimento oferece uma solução rápida e conveniente para a classificação citométrica do fluxo e a análise funcional de pilhas tracheal viáveis da escova.
Introdução
As pilhas da escova pertencem a uma classe de pilhas epithelial quimiossensorial caracterizadas pela expressão de receptores amargos do gosto e da maquinaria do transdução do receptor do gosto encontradas em pilhas do botão do gosto. Ao contrário das pilhas do botão do gosto, as pilhas epithelial quimiossensorial são dispersadas em superfícies epithelial e são referidas como pilhas quimiossensorial solitárias (SCCs) e pilhas microvillous no epitélio nasal1,2, pilhas da escova na traqueia 3,4e células de tufo no intestino5,6....
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Protocolo
Antes de realizar os seguintes experimentos, assegure-se de que todos os protocolos e uso de cuidados com animais sejam aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) e realizado de acordo com o "guia para o cuidado e uso de Animais de laboratório "(8ª edição, 2011) e as orientações chegam. Todos os procedimentos descritos abaixo foram revisados e aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais do hospital Brigham e Women ' s.
1. preparação de reagentes
- Prepare a solução de digestão Dispase, que é uma solução de PBS contendo 16 U/mL de Dispase e 20 μg/mL de DNase ....
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Resultados
Este procedimento foi implementado com sucesso para isolar as células da escova traqueal para sequenciamento de RNA3. Após isolamento da traquéia e digestão do tecido com protocolo de 2 etapas (Figura 1), as células foram coletadas e CORADAS com CD45 e epcam com rótulo fluorescently após exclusão das células mortas com PI. Após o gating para fora doublets baseado em características da dispersão da frente e do lado, nós definimos pilhas da escova como baixo/negativo pa.......
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Discussão
Nós encontramos que uma combinação de tratamento do Dispase da elevado-dose para o minuto 40 seguido por um tratamento curto do papaína (30 minutos) fornece um protocolo óptimo para a digestão tracheal e a isolação da pilha da escova. Esta combinação evita a digestão extensiva e produz o rendimento o mais elevado de pilhas da escova, comparado aos protocolos alternativos.
Enquanto a digestão pulmonar para extrair células hematopoiéticas classicamente se baseou em enzimas digestivas leves como .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a Adam Chicoine no núcleo de fluxo do centro de Imunologia humana da Brigham e da mulher por sua ajuda com a triagem citométrica de fluxo. Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de bolsas de saúde R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N. A. B), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), e K08 AI132723 (L. G. B), e pela Academia Americana de alergia, asma e Imunologia (AAAAI)/pulmão americano alérgico Prêmio de doença respiratória (N.A.B.), pelo prêmio de desenvolvimento de professores da Fundação AAAAI (L.G.B.), pelo prêmio Steven e Judy Kaye Young Innovators (N.A.B.), pelo JoYcElYn C. Austen Fund for desenvolvimento de carreira de cientistas de médicos ....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpos | |||
| Anti-GFP (Ig policlonal de cabra) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat # 118214 | |
| APC Rat IgG2a, controle de isotipo k | Biolegend | cat # 400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat # 422801 | |
| Burro anti-cabra IgG (H + L) Anticorpo secundário altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor 488 | Life Technologies / Molecular Probes | cat # A-11055 | |
| Cabra normal IgG | R & D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, controle de isotipo k | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Anticorpo | Biolegend | cat#101320 | |
| Produtos químicos, peptídeos e proteínas | |||
| Dispase | Gato Gibco | # 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat # 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode' s Tampão sem cálcio (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0,4 mM NaH2PO4, 0,25% BSA, 5,5 mM de glicose. Preparado em água de 18,2 megaohms e filtrado através de 0,22 µ Filtro | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode' s Solução (tamponada com HEPES) 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 25 mM de HEPES, 2 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl2 e 10 mM de glicose. Preparado em água de 18,2 megaohms e filtrado através de 0,22 µ m. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cisteína | Sigma | cat# C7352 | |
| Sal de trifluoroacetato de leupeptina | Sigma | cat# L2023 | |
| Papaína de látex de mamão | Sigma | cat# P3125 | |
| Iodeto de propídio | Sigma | cat# P4170 | |
| Modelos experimentais: Organismos/Cepas | |||
| ChATBAC-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 com sistema confocal Airyscan em um Microscópio Invertido Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Equipamento descartável | |||
| Tubos estéreis de 1,5 mL | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| Tubo de Poysterene de fundo redondo, 12 mm x 75 mm estilo | Falcon | 14-959-1A | |
| Tubo cônico de polipropileno de 50 mL, 30 mm x 115 mm Bisturi | de 352098 | estilo Falcon | |
| no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| placa de Petri, 100 mm x 15 mm Estilo | Falcon | 351029 | |
| Filtro de células estéreis, 100 μ m | Fisherbrand | gato#22363549 |
Referências
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M.
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Reimpressões e permissões
