Complexos artificiais de alongamento de RNA polimerase II para dissecar eventos co-transcricionais do processamento de RNA

Resumo

Aqui, nós descrevemos o conjunto de complexos do alongamento do polymerase II (pol II) do RNA que exigem somente o ADN sintético curto e oligonucleotídeos do RNA e o pol purificado II. Esses complexos são úteis para estudar mecanismos subjacentes ao processamento cotranscricional de transcrições associadas ao complexo de alongamento pol II.

Resumo

A síntese eucariótica do mRNA é um processo bioquímico complexo que exige a transcrição de um molde do ADN em um RNA do precursor pela enzima do RNA polymerase II do multi-subunit e o nivelamento e a emenda co-transcriptional do RNA do precursor para dar forma ao mRNA maduro. Durante a síntese de mRNA, o complexo de alongamento da RNA polimerase II é um alvo para regulação por uma grande coleção de fatores de transcrição que controlam sua atividade catalítica, bem como as enzimas de nivelamento, splicing e 3 '-Processing que criam o mRNA maduro. Por causa da complexidade inerente da síntese de mRNA, os sistemas experimentais mais simples que permitem o isolamento e a investigação de seus vários estágios co-transcriptional têm a grande utilidade.

Neste artigo, nós descrevemos um tal sistema experimental simples apropriado para investigar o tampar co-transcriptional do RNA. Este sistema confia nos complexos definidos do alongamento do polymerase II do RNA montados da polimerase purificada e das bolhas artificiais da transcrição. Quando imobilizados via DNA biotinilado, estes complexos de alongamento de RNA polimerase II fornecem uma ferramenta facilmente manipulável para dissecação de RNA de encapsulamento co-transcricional e mecanismos pelos quais o complexo de alongamento recruta e regula a enzima tampando durante capping co-transcriptional do RNA. Antecipamos que este sistema poderia ser adaptado para o estudo do recrutamento e/ou montagem de proteínas ou complexos proteicos com papéis em outros estágios de maturação do mRNA acoplados ao complexo de alongamento da RNA polimerase II.

Introdução

A síntese do RNA do mensageiro eucariótico (mRNA) é um processo bioquímico elaborado que envolva a síntese de um RNA precursor não processado pelo RNA polymerase II e Processando do RNA do precursor para render o mRNA maduro. As etapas de processamento do RNA de nivelamento, de emenda, e de poliadenilação são executadas pela maior parte co-transcripcionalmente. O complexo de alongamento pol II serve como um andaime que recruta e orquestra as atividades de muitas das enzimas de processamento de RNA. Conseqüentemente, nossa compreensão final de como os mRNAs eucarióticas maduros são gerados dependerá pesadamente no desenvolvimento de sistemas experimentais para permitir....

Protocolo

1. montagem de complexos de alongamento artificial e pol II andando

1. Imobilize 1 nmol do oligo do ADN do não-molde que contem uma molécula de 3 ' biotina em grânulos magnéticos.
   Observação: as etapas a seguir podem ser feitas com antecedência para se preparar para experimentos futuros. Todas as sequências de oligo utilizadas neste protocolo são fornecidas na tabela 1. Os oligos de RNA são sintetizados com modificações de 5 '-trifosfato.
   1. Adicione 200 μL de grânulos magnéticos (10 mg/mL) a um tubo de ligação de baixa proteína 1,5 mL e, em seguida, coloque em um rack magnético por 2 min.
   2. Enquanto o tubo est....

Resultados

As figuras 2 e 3 mostram reações representativas do resultado usadas para gerar complexos artificiais do alongamento que contêm transcrições de comprimentos diferentes estendendo ou pol II das fontes diferentes. A Figura 4 mostra como esses complexos de alongamento podem ser usados para o ensaio de fosforilação cotranscricional CTD-dependente de RNA tampando.

A

Discussão

Os estudos que procuram dissecar eventos acoplados ao complexo do alongamento de pol II tais como o processamento do RNA e a regulação do alongamento do transcrito próprio podem extremamente ser facilitados pelo uso de um sistema altamente purified da enzima. A criação de tais sistemas enzimáticos pode ser desafiador. A transcrição dependente do promotor por pol II requer pelo menos cinco fatores gerais de transcrição. Preparar e estocar esses fatores pode levar meses; Portanto, a etapa limitante deste processo é, muitas.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
[α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi	Perkin Elmer	NEG007H001MC	Para radiomarcação de RNA
2x corante de carregamento de RNA	New England Biolabs	B0363S	Altamente recomendado. Para preparar RNA durante o carregamento de gel
40% Bis:Solução de Acrilamida	Biorad	1610144
Soro Bovino Albumina (20 mg/mL)	New England Biolabs	B9000S
Cdk7/Ciclin H/MAT1 (complexo CAK) Proteína, ativa, 10 µ g	Millipore Sigma	14-476	Usado para fosforilar
oligonucleotídeos de DNA	IDT		Veja a Tabela 8 para especificações de pureza
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Life Technologies Invitrogen	65001	Também usamos Dynabeads M-280 streptavidin sem problemas, mas preferimos contas de Streptavidin MyOne porque sedimentam mais lentamente
GlycoBlue Coprecipitant (15  mg/mL)	Life Technologies Invitrogen	AM9516	Altamente recomendado. Corante azul de pellets de ácido nucleico tornando as reações muito mais fáceis de manusear
Sistema de eletroforese vertical refrigerado duplo padrão Hoefer SE600 com espaçadores de 1 mm e pente de 15 poços	Tubos de alta densidade Hoefer	SE600-15-1.5
MaXtract (1,5 mL)	Qiagen	129046	Altamente recomendado. Contém um gel de alta densidade que forma uma barreira estável entre as fases aquosa e orgânica; melhora o rendimento de RNA durante as extrações
Solução de proteinase K (20  mg/mL)	Life Technologies Invitrogen	25530049
RNA oligonucleotídeos	Trilink		Consulte a Tabela 8 para obter mais detalhes
Pirofosfatase Inorgânica de Levedura (100 unidades/mL)	New England Biolabs	NEBM2403S	Necessário apenas durante reações de capeamento

Pol II CTD