É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Estudo de toxicidade de nanopartículas de óxido de zinco em cultura celular e em Drosophila melanogaster

10.9K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/59510

⸱

19 de setembro de 2019

 ,  ,  ,  , 
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos um protocolo detalhado para avaliar os perfis toxicológicos de nanopartículas do óxido de zinco (ZnO NPs) no detalhe, o tipo de morte da pilha em fibroblastos humanos do pulmão MRC5 e na formação dos ROS na mosca da fruta Drosophila.

Resumo

As nanopartículas de óxido de zinco (ZnO NPs) têm uma ampla gama de aplicações, mas o número de relatos sobre a toxicidade associada ao ZnO NP cresceu rapidamente nos últimos anos. No entanto, estudos que elucidar os mecanismos subjacentes para a toxicidade induzida por ZnO NP são escassos. Nós determinamos os perfis da toxicidade de ZnO NPs usando modelos in vitro e in vivo experimentais. Uma diminuição significativa na viabilidade celular foi observada em fibroblastos pulmonares MRC5 expostos ao ZnO NP, mostrando que os NPs ZnO exercem efeitos citotóxicos. Da mesma forma, curiosamente, o intestino exposto a ZnO NPs exibiu um aumento dramático nos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) na mosca da fruta Drosophila. São necessários estudos mais aprofundados para estabelecer uma avaliação de risco para o aumento da utilização de ZnO NPs pelos consumidores.

Introdução

A nanotecnologia refere-se à aplicação de materiais nanodimensionados que são utilizados em todos os campos científicos, incluindo medicina, ciência dos materiais e bioquímica. Por exemplo, ZnO NPs que são conhecidos por sua dispersão ultravioleta, sensoriamento químico, e propriedades antimicrobianas, bem como alta condutividade elétrica, são utilizados na produção de vários produtos de consumo, tais como embalagens de alimentos, cosméticos, têxteis, borrachas, baterias, catalisador para o tratamento de gás de cauda de automóvel, e aplicações biomédicas1,2,3.

No entanto, as aplicações crescentes de produtos baseados em ZnO NP, que levam ao aumento da exposição humana ao ZnO NPs, suscitou preocupações sobre os seus potenciais efeitos adversos na saúde humana. Vários estudos celulares in vitro demonstraram que ZnO NPS pode induzir estresse oxidativo, citotoxicidade relacionada à autofagia, inflamação e genotoxicidade4,5,6,7,8 . Notavelmente, presume-se que a toxicidade de ZnO NPs é causada pela dissolução de Zn para liberar Zn2 + íons, bem como a reatividade superficial de ZnO, resultando em desequilíbrios celulares iônicos e metabólicos que estão ligados com a homeostase iônica prejudicada e um inibição do transporte iônico4,7,9,10. É importante ressaltar que estudos demonstraram que a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) é um dos mecanismos primários subjacentes à toxicidade associada à ZnO NPs. A atividade antioxidativa insuficiente que segue o insulto de ROS foi mostrada para ser responsável para provocar a citotoxicidade e dano do ADN9. Os efeitos tóxicos de ZnO NPS também foram relatados em modelos animais, incluindo roedor1, zebrafish11,12, bem como a Drosophilade invertebrados13.

A Drosophila serve como um modelo animal alternativo bem estabelecido para a triagem de toxicidade de entidades químicas e nanomateriais (NMS)14,15. É importante ressaltar que existem altos níveis de similaridade genética e fisiológica entre o ser humano e a Drosophila que justifica o uso da Drosophila como um modelo in vivo para avaliar respostas biológicas a contaminantes ambientais, como NMS 16. Além disso, existem muitas vantagens de usar a Drosophila devido ao seu tamanho pequeno, tempo curto, Amenability genético, e fácil e custo-benefício de manutenção. Além disso, a Drosophila tem sido amplamente adotada para o estudo da genética, biologia molecular e do desenvolvimento, desde que seu genoma completo foi totalmente seqüenciado anos atrás em 2000, tornando-o adequado para uma variedade de triagem de alta taxa de transferência e para abordar questões biológicas não resolvidas17,18,19,20,21. Nos últimos anos, vários estudos relacionados à imunotoxicidade utilizando diferentes tipos de NPS na Drosophila foram relatados15,22,23,24. Este novo conhecimento fundamental obtido a partir dos estudos que utilizam a Drosophila tem ajudado a fornecer mais insights sobre a nossa compreensão da nanotoxicologia.

ROS é um bem conhecido culpado de citotoxicidade e genotoxicidade causada por NPs, em particular, NPs baseados em metal25. ROS são espécies químicas contendo oxigênio com propriedades reativas mais elevadas do que o oxigênio molecular. Os radicais livres tais como o radical do superóxido (O2-) e mesmo, moléculas não-radicais tais como o peróxido de hidrogênio (H2O2) podem actuar como Ros. condições fisiológicas normais, eles são obrigados a manter a homeostase celular26, no entanto, Ros excessivos devido à superprodução ou desregulação do sistema de defesa antioxidante pode causar estresse oxidativo, levando a danos às proteínas, lipídios e Ácido desoxirribonucleico (DNA)27. Por exemplo, à medida que os níveis de ROS aumentam e o nível de glutationa (GSH) diminui concomitantemente, a ruptura da síntese de trifosfato de adenosina (ATP) ocorre e o nível de lactato desidrogenase (LDH) aumenta no meio, culminando na morte celular27.

Aqui, nós fornecemos protocolos para a realização de análises celulares e genéticas usando células de mamíferos cultivadas e Drosophila para determinar os potenciais efeitos adversos de ZnO NPS. Uma visão geral do método utilizado para o estudo de toxicidade de ZnO NPs é mostrada na Figura 1.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. fluorescência ativada Cell Sorting (FACS) análise em células vividas/fixas

  1. SONICATE ZnO NPs em suspensão por 15 min.
  2. Prepare ZnO NPs em várias concentrações (por exemplo, 0, 10, 25, 50.100 e 200 μg/mL) usando 1 mg/mL ZnO NP solução de ações para o tratamento de células cultivadas.
  3. Sementes MRC5 fibroblastos pulmonares humanos (1 x 105 células/poço) em uma placa de cultura de 6 poços por dia de antecedência, e depois tratar as células com 2 ml de ZnO NPS (em triplicates) para 8 h, 16 h e 24 h.
  4. Em cada ponto de tempo, recolher as células por centrifugação em 300 x g por 5 min.
  5. Lave as pastilhas celulares duas vezes com tampão fosfato salina (PBS).
  6. Ressuscita as células com tampão de ligação 1x, que é composto de 0,1 M HEPES/hidróxido de sódio (NaOH), cloreto de sódio de 1,4 M (NaCl), e cloreto de cálcio de 25 mM (CaCl2), em uma concentração de 1 x 105 células por 100 μl.
  7. Adicionar 5 μL de fluoresceína isotiocianato (FITC) anexina V mancha e 5 μL de iodeto de propiídio (PI) de coloração de DNA, e incubar as células por 15 min à temperatura ambiente (RT; 25 ° c) no escuro.
  8. Top-se as amostras com um adicional de 400 μL de 1x tampão de ligação antes de classificar as células por citometria de fluxo. Um mínimo de 10.000 células é analisado para cada amostra.
  9. Tabulate o gráfico de barras usando a intensidade mediana obtida.

2. exposição de ZnO NPs a Drosophila

  1. Adicionar 1 mL de nanopartículas em diferentes concentrações em frascos, seguido de 9 mL de mosca para fazer uma concentração final de 0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL ou 0,5 mg/mL ZnO NPs.
  2. Misture as nanopartículas com alimentos cuidadosamente nos frascos usando a pipeta.
  3. Permitir que os alimentos com mosca que contenham ZnO NPs esfriem por pelo menos 2-3 h antes do uso.
  4. Introduzir moscas masculinas e fêmeas adultas nos frascos por 5 dias, e permitir que eles acasalam e põem ovos (que aparecem como manchas brancas) na superfície do alimento.
  5. Retire as moscas parentais, e permitir que os ovos para sofrer mais desenvolvimento, que consiste em 4 diferentes estágios de desenvolvimento (embrionário, larval, pupal e estágio adulto).

3. dissecção da mosca

  1. Colete larvas do final de 3RD instar da parede dos frascos para análise. Ovos recém-colocados normalmente se desenvolvem em larvas de 3RD instar tardio após 72-120 h em RT.
  2. Limpe o prato de dissecção e encha o poço com dissecção média/PBS.
  3. Dissecar as larvas (tardia 3RD instar) o estereomicroscópio, usando um par de fórceps.
  4. Use a ponta do fórceps para fazer um furo minúsculo e para quebrar aberto a camada da cutícula das larvas. Retire cuidadosamente o intestino e coloque-o num tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo o meio de Drosophila da Schneider, antes da etapa de fixação utilizando 1 ml de paraformaldeído a 4% (PF).
  5. 3.5 fixar o intestino no PF por 10 min em RT, para experimentos subsequentes, como imunocoloração.

4. detecção de ROS usando coloração de Dihydroethidium (DHE)

  1. Trate as larvas com várias concentrações de ZnO NPs conforme descrito na etapa 2,1.
  2. Após a dissecção do intestino de larvas de 3RD instar, conforme descrito na seção 3, incubar o intestino no meio de Drosophila da Schneider em RT antes da coloração tecidual ser realizada. Dissolva 1 μL de corante DHE (a partir da concentração de 30 mM) em 1 mL do meio Schneider, fazendo uma concentração final de trabalho de 10-30 μM de corante DHE.
  3. Incubar o intestino por 5 min em RT no escuro, e depois lave três vezes usando o meio de Schneider para cada 5 min.
  4. Fixar o intestino com 4% PF (passo opcional) e montar o intestino em lâminas de vidro, com anti-fade montagem meio contendo 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Capture imagens um microscópio confocal.

5. medindo a fluorescência usando o software de ImageJ

  1. Importe as imagens capturadas da fluorescência adquiridas usando a microscopia de fluorescência ou a microscopia confocal da exploração do laser no software de ImageJ.
  2. Clique no menu Analyze e selecione definir medições.
  3. Selecione a medida de saída, como intensidade integrada da área e valor de cinza médio.
  4. Clique em medir.
  5. Selecione uma região sem fluorescência para definir o plano de fundo.
  6. Exporte os dados para a planilha do Excel e determine a fluorescência total corrigida da célula (CTCF), usando o cálculo como mostrado abaixo.
    CTCF = densidade integrada-(área da célula selecionada X média de fluorescência de leituras de fundo)
  7. Construa um gráfico de barras e realize análises estatísticas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

As pilhas NP-expostas foram processadas com a pilha que mancha o jogo do reagente, seguida pela seleção da pilha usando a citometria do fluxo. As células tratadas com NP ZnO (inferior, painel direito) exibem uma percentagem mais elevada de células apoptóticas precoces (R3)/tardias (R6) do que as células de controlo (R5, inferior, painel esquerdo). A morte celular necrótica é indicada pelo R4 (painel superior, direito) (Figura 2). Os resultados do ensaio FITC/...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

A fim avaliar se ZnO NP pode induzir o apoptose em fibroblastos MRC5, nós usamos o fluxo citometria para distinguir as pilhas da morte Necrotic ou apoptóticas da pilha. Em células normais ao vivo, a fosfatidilserina (PS) é localizada na membrana celular. Se a apoptose ocorre, o PS é translocalizado para o folheto extracelular da membrana plasmática, permitindo a ligação da anexina V rotulada com fluoresceina (FITC anexina V)29. De um lado, o iodeto vermelho-fluorescente do propidium (PI), um coran...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

O estudo foi apoiado pelo número de subvenção R706-000-043-490. O estudo não representa a visão do patrocinador da subvenção.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
15% de metil 4-hidroxibenzoatoSigma Aldrich
4% de paraformaldeídoSigma AldrichP6148
Bacto AgarBD biosciences
cncCK6/TM3, Sba presente do Dr. Kerppola T
Fubá, glicose, fermento cervejeiroSigma Aldrich
CyAn ADP com Summit SoftwareDAKOhttps://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihidroetídio (Hidroetidina)Thermo Fisher ScientificD11347
FITC Anexina V Kit de Detecção de Apoptose IBD biosciences556547
Microscópio fluorescenteOlympus
GlucolinSupermercado
Software de ImageJNIH
MRC5 fibroblasto humanoATCCCCL-171
Schneider' s Drosophila meioThermo Fisher Scientific21720-024
Vectashield antifade com DAPIVector LaboratoriesH-1200
Wild-type Canton-S; Sod2N308 / CyO < / em >NIG-FLY
Nanopartículas de óxido de zincoSigma Aldrich721077Consulte a folha 2

Referências

  1. Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
  2. Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
  3. Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
  4. De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
  5. Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
  6. Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
  7. Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
  8. Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
  9. Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
  10. Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
  11. Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
  12. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  13. Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
  14. Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
  15. Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
  16. Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
  17. Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
  18. Jennings, B. H. Drosophila - a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
  19. Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
  20. Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
  21. Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
  22. Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
  23. Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
  24. Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
  25. Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
  26. Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
  27. Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
  28. Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
  29. Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
  30. Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , Chapter 1 (2011).
  31. Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
  32. Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
  33. Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit14.15 (2013).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Viabilidade CelularEspécies Reativas de OxigênioCitometria de FluxoMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia ConfocalFibroblastos Pulmonares MRC5Análise IntestinalColoração com Anexina V
Estudo de toxicidade de nanopartículas de óxido de zinco em cultura celular e em Drosophila melanogaster
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.