Visualizando proteína quinase uma atividade na cabeça-corrigido ratos comportando-se usando in vivo microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão

A neuromodulação, também conhecida como transmissão sináptica lenta, impõe um forte controle sobre a função cerebral durante diferentes Estados comportamentais, como estresse, excitação, atenção e locomoção^1,2,^{3 4}. apesar de sua importância, o estudo de quando e onde os eventos neuromodulatórios acontecem ainda está em sua infância. Neuromoduladores, incluindo acetilcolina, dopamina, noradrenalina, serotonina, e muitos neuropeptídeos, ativam receptores acoplados à proteína G (GPCRs), que por sua vez desencadeiam vias de mensageiro intracelular segundo com uma ampla janela de escalas de tempo variando de segundos a horas. Enquanto cada neuromodulador desencadeia um conjunto distinto de eventos de sinalização, a via de campo/proteína quinase a (PKA) é uma via de downstream comum para muitos Neuromoduladores^1,5. O caminho do acampamento/pKa regula a excitabilidade neuronal, a transmissão sináptica e a plasticidade^6,7,8,9e, portanto, ajusta a dinâmica da rede neuronal. Como diferentes neurônios ou tipos neuronais expressam diferentes tipos ou níveis de receptores do neuromodulador¹⁰, os efeitos intracelulares do mesmo neuromodulador extracelular podem ser heterogêneos em diferentes neurônios e, portanto, devem ser estudado com resolução celular. Até o momento, continua a ser desafiador monitorar eventos neuromodulatórios em neurônios individuais in vivo durante o comportamento.

Para estudar a dinâmica espaciotemporal da neuromodulação, é necessária uma modalidade de gravação adequada. A microdiálise e a voltametria cíclica de varredura rápida são freqüentemente usadas para estudar a liberação de Neuromoduladores, mas não têm a resolução espacial para monitorar eventos celulares^11,12. Análoga à dinâmica do cálcio que está sendo usada como um proxy para a atividade elétrica neuronal na imagem latente da população¹³, a imagem latente de pKa pode ser usada para ler para fora eventos neuromoduladoras através de uma população neuronal na definição celular. O protocolo atual descreve o uso de um repórter melhorado da atividade da um-quinase (AKAR) para monitorar atividades do PKA in vivo durante o comportamento animal. O método descrito aqui permite a imagem latente simultânea de populações neuronal na definição subcellular com uma definição temporal que rastreia eventos neuromodulatórios fisiológicos.

Os akars são compostos por um doador e um aceitador de proteínas fluorescentes ligadas por um peptídeo de substrato de fosforilação de pKa e um domínio associado à forkhead (FHA) que se liga à serina fosforilada ou treonina do substrato^14,15. Após a ativação da via PKA, o peptídeo de substrato de AKAR é fosforilado. Como resultado, o domínio FHA liga-se ao peptídeo fosforilado de substrato, trazendo assim os dois fluoróforos em estreita proximidade, referido como o estado fechado de AKAR. O estado fechado de um AKAR fosforilada conduz à transferência aumentada da energia da ressonância de Förster (fret) entre os Fluorophores do doador e do acceptor. Uma vez que a proporção de akars fosforilados está relacionada com o nível de atividade do pKa¹⁶, a quantidade de traste numa amostra biológica pode ser utilizada para quantificar o nível de atividade do pKa^{16,17,18, 19,20}.

As versões adiantadas de AKARs foram projetadas primeiramente para a imagem latente ratiométrica de duas cores¹⁴. Quando a imagem latente mais profunda no tecido de cérebro, o método raciométrica sofre da distorção do sinal devido à dispersão de luz comprimento de onda-dependente^17,18,21. Como discutido abaixo, a microscopia da imagem latente da vida da fluorescência (flim) elimina este problema porque flim mede somente os fótons emitidos pelo fluoróforo fornecedor^18,21. Como resultado, a quantificação de FLIM de FRET não é afetada pela profundidade do tecido¹⁷. Além disso, uma variante "escura" (i.e., baixa produção quântica [QY]) do fluoróforo aceptor pode ser usada. Isso libera um canal de cor para facilitar a medição multiplexada de propriedades neuronais ortogonais via imagem simultânea de um segundo sensor ou um marcador morfológico^17,19,20.

A imagem latente de flim quantifica o tempo que um fluoróforo gasta no estado excited, isto é, a vida da fluorescência¹⁸. O retorno de um fluoróforo ao estado de terra, assim o fim do estado excitado, frequentemente concomitates com a emissão de um Photon. Embora a emissão de um fóton para uma molécula animada individual é estocástica, em uma população a vida média de fluorescência é uma característica desse fluoróforo particular. Quando uma população pura de fluoróforos são excitados simultaneamente, a fluorescência resultante seguirá uma única deterioração exponencial. A constante de tempo desta deterioração exponencial corresponde à vida média da fluorescência, que varia tipicamente de um a quatro nanossegundos para proteínas fluorescentes. O retorno de um fluoróforo doador excited ao estado à terra pode igualmente ocorrer por fret. Na presença de FRET, a vida de fluorescência do fluoróforo do doador é reduzida. Os akars resíduo exibem uma vida fornecedora relativamente mais longa da fluorescência. Após a fosforilação por PKA, o sensor exibe uma vida mais curta porque os fluoróforos doador e aceitador são trazidos perto uns dos outros e FRET é aumentada. A quantificação da vida da fluorescência em uma população de AKARs representa conseqüentemente o nível de atividade de PKA.

As primeiras versões de AKARs não foram usadas com sucesso para a imagem latente in vivo na definição da único-pilha. Isto é principalmente devido à baixa amplitude do sinal dos sensores de AKAR às ativações fisiológicas¹⁷. Recentemente, comparando sistematicamente os sensores disponíveis de AKAR para a microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão (2pflim), um sensor chamado flim-AKAR foi encontrado para superar sensores alternativos. Além disso, uma série de variantes de FLIM-AKAR chamadas de AKARs direcionados (tAKARs) foram desenvolvidas para visualizar a atividade de PKA em locais subcelulares específicos: microtúbulos (tAKARα), citosol (tAKARβ), actina (tAKARδ), actina filamentosa (tAKARε), membrana (tAKARγ), e densidade pós-sináptica (tAKARζ). Entre tAKARs, tAKARα aumentou a amplitude do sinal eliciada pela norepinefrina por 2,7 vezes. Isso é consistente com o conhecimento de que a maioria dos pKa nos neurônios está ancorada a microtúbulos no estado de repouso^22,23. tAKARα foi o melhor intérprete entre os AKARs existentes para 2pFLIM. Além disso, tAKARα detectou atividade fisiologicamente relevante de PKA eliciada por múltiplos Neuromoduladores, e a expressão de tAKARα não alterou as funções neuronais¹⁷.

Recentemente, o tAKARα foi usado com sucesso para visualizar as atividades da PKA em camundongos com comportamento fixo de cabeça¹⁷. Mostrou-se que a locomoção forçada desencadeou a atividade de PKA no soma de neurônios superficiais da camada (camada 1 a 3, até uma profundidade de ~ 300 μm da pia) no motor, no tambor, e nos córtices visuais. A atividade de PKA locomoção-desencadeada era na parte dependente da sinalização através dos receptores β-adrenergic e dos receptores do dopamine D1, mas não foi afetada por um antagonista do receptor do dopamine D2. Este trabalho ilustra a capacidade de tAKARs para rastrear eventos de neuromodulação in vivo usando 2pFLIM.

No protocolo atual, o método inteiro para a imagem latente da atividade de PKA em ratos acordados cabeça-fixados durante um paradigma forçado da locomoção é descrito em seis etapas. Primeiro, a adição de capacidades 2pFLIM a um microscópio convencional de dois fótons (Figura 1). Em segundo lugar, a construção de uma esteira motorizada (Figura 2). Em terceiro lugar, a expressão do sensor de tAKARα no córtex do rato por in utero Electroporation (IUE) de plasmíos de DNA, ou injeção estereotaxica de vírus adeno-associado (AAV). Os protocolos excelentes para cirurgias para IUE^24,25 e a injeção Stereotaxic de partículas virais²⁶ foram publicados previamente. Os principais parâmetros que usamos são descritos abaixo. Adiante, a instalação de uma janela craniana. Os protocolos excelentes foram publicados previamente para a cirurgia da janela craniana^27,28. Várias etapas que foram modificadas dos protocolos padrão são descritas. Quinto, realizando in vivo 2pFLIM. Sexto, as análises das imagens 2pFLIM (Figura 3 e Figura 4). Esta aproximação deve prontamente ser aplicável a muitos outros paradigmas comportamentais cabeça-fixos e áreas do cérebro.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Oregon Health and Science University.

1. configuração do microscópio 2pFLIM

1. Instale um módulo de contagem de temporização de fóton (PTCM, tabela de materiais) e conecte-se ao computador (Figura 1) de acordo com o manual do fabricante.
   Nota: O PTCM é tipicamente uma placa do computador que receba uma entrada da "sincronização" para o sincronismo do pulso do laser e uma entrada do fóton do tubo do photomultiplicador (PMT). Ele também recebe tempo de clock para pixels, linhas e quadros, de software de controle de imagem de dois fótons. O PTCM usa os sinais de relógio para separar fótons individuais em diferentes pixels e quadros.
2. Adicione um fotodiodo com > largura de banda de 200 MHz para medir o sincronismo do laser. Coloque uma lamínula de vidro padrão no trajeto da luz para refletir uma pequena fração da luz do laser no fotodiodo colocado perpendicularmente ao trajeto da luz (Figura 1). Ligue a saída do fotodiodo à entrada "Sync" do PTCM.
   Nota: Muitos lasers modernos também output o sincronismo do laser. Para estes lasers, o fotodiodo não é necessário, e um pode diretamente conectar a saída do sincronismo do laser à entrada da sincronização do ptcm.
3. Troque o PMT, no caso do tAKARα, o canal verde PMT, com um PMT GaAsP de baixo ruído e rápido (Figura 1). Ligue a saída PMT à entrada de sinal do PTCM.
   1. Adicione um divisor opcional do sinal (Figura 1) se a aquisição simultânea da intensidade através do canal convencional da imagem latente do dois-fotão é desejada. Conecte a saída de PMT ao divisor do sinal e conecte a saída do divisor ao PTCM e ao módulo convencional da imagem latente do dois-fotão.
      Nota: Os PMTs de GaAsP dão uns sinais mais rápidos do único-fotão do que PMTs convencionais do bialcalóide e permitem uma determinação mais exata do sincronismo do fóton. Determinados modelos de PMTs de GaAsP podem ser refrigerados a 10 − 35 ° c abaixo da temperatura ambiental, permitindo a supressão de contagens escuras a um nível abaixo de algumas cem por segundo (tipicamente ≤ 200 contagens/s). Este baixo nível de ruído é importante para a medida precisa de tempos de vida da fluorescência porque as contagens do fóton do ruído não podem facilmente ser distinguidas ou subtraída da curva da vida da fluorescência.
4. Adicionar um filtro de emissão de fluorescência de banda-Pass que minimiza a contaminação espectral, se houver, do aceptor fluoróforo. Por exemplo, para takarα, um filtro de barreira de 500 nm ± 20 nm para o canal verde é usado para reduzir a contaminação do Acceptor Sreach, que é uma proteína fluorescente amarela (QY ~ 0, 7) escura (YFP)^29,30. Conecte os sinais de temporização, como os pulsos de disparo para pixéis, linhas, e frames individuais da imagem, conforme apropriado ao software de controle e descrito no manual do usuário PTCM. Instale o software de controle e aquisição de dados apropriado.
   Nota: Alguns fabricantes de PTCM (tabela de materiais) fornecem seu software para a imagem latente 2pflim. Aqui, o software feito encomenda chamado FLIMimage é usado, que foi desenvolvido pelo laboratório de Yasuda (Max Planck Florida, através da comunicação pessoal). Este software funciona como uma função de usuário Add-on para determinado software de aquisição de dois fótons (tabela de materiais). Controla e comunica-se com o PTCM no sincronismo apropriado durante a imagem latente do dois-fotão para adquirir imagens 2pFLIM.

2. construção de uma esteira motorizada

Nota: O design da esteira motorizada personalizada é mostrado na Figura 2.

1. Corte um rolo de espuma (Ø = 200 mm) a 150 mm de comprimento com uma serra fina. Alternativamente, Cole as duas metades de uma bola de espuma juntas e coloque fita sobre a costura. Opcionalmente, Cole uma esteira de borracha com perfil no rolo para aumentar a tração no rolo.
2. Perfure um furo do diâmetro de 1/4 polegadas através do centro do rolo no lado liso do rolo ou perfure um furo do diâmetro de 1/4 polegadas através do meio de cada metade da esfera se a esfera da espuma é usada.
3. Instale um eixo de aço do diâmetro de 1/4 polegadas através do furo. Cole o rolo de espuma/bola para o eixo usando espuma-compatível cola. Opcionalmente, modifique dois acoplamentos flexíveis do eixo (diâmetro interno de 1/4 polegadas) para reforçar o acoplamento do eixo ao rolo/esfera de espuma.
   Nota: Anote por favor que muitas colas comuns podem dissolver a espuma.
   1. Para cada acoplamento do eixo, posicione o acoplamento do eixo em seu lado liso e no centro da placa de metal do retângulo (0,7 milímetros x 15 milímetros x 76 milímetros). Soldar a chapa ao acoplamento do eixo. Perfure um furo de 1/4 polegadas no centro da placa para permitir a instalação do acoplamento de eixo modificado sobre ao eixo e dos dois furos de parafuso na placa de metal lateral do centro.
   2. Instale o acoplamento do eixo no eixo contra o rolo de espuma/bola. Se usar este último, Dobre levemente a placa para caber a curvatura da esfera. Coloque os parafusos nos orifícios laterais para fixar o rolo/bola no eixo.
4. Perfure e bata uma rosca 3/8-32 no centro de uma placa de gaiola e instale o codificador rotativo. Perfure um furo do parafuso na base do suporte do motor do direito-ângulo para permitir o acessório do motor no suporte do borne. Fixe o codificador rotativo e o motor à extremidade do eixo utilizando um acoplamento de eixo flexível.
5. Instale a esteira montada em uma placa de pão de alumínio usando postes para o motor e o codificador rotativo (Figura 2). Conecte as entradas do motor ao controlador de velocidade e a saída do codificador rotativo a uma entrada analógica da placa de aquisição de dados do computador (DAQ).
   Nota: A velocidade angular da rotação é codificada pelo codificador giratório como a tensão e é digitalizada usando o software feito encomenda chamado AnimalTracker escrito em MATLAB.
6. Instale o suporte compatível com Headplate em um suporte de ângulo reto. Instale um poste sólido na placa de pão em frente à esteira rolante e instale o suporte montado do Headplate com o suporte de ângulo reto no poste (Figura 2). Assegure-se de que as barras de suporte da placa de cabeceira estejam alinhadas com o eixo de modo que o rato possa adoptar uma posição de pé adequada e confortável na esteira (Figura 2C).

3. expressão do sensor tAKARα no córtex do rato

1. No utero Electroporation
   1. Prepare uma solução de DNA para IUE adicionando 0,2% de concentração final de corante verde rápido (para visualização durante a injeção) a um DNA plasmídeo (3 − 4 μg/μl; as construções do sensor contendo um promotor CAG, seqüência de sensores e um vírus da hepatite de marmota elemento de resposta pós-transcricional [WPRE] potenciador translacional) dissolvido/diluído em água ou Tris-EDTA.
   2. Prepare um rato fêmea grávido cronometrado (por exemplo, C57BL/6) para IUE em E16²⁴. Anestesie o camundongo com isoflurano (4% para indução e 1,5% para manutenção, em 95% O2 com 5% CO₂) e aplique injeção subcutânea de analgésicos peri-operatórios contendo 5 mg/kg de Meloxicam e 4 mg/kg de bupivacaína. Corte abrir a cavidade abdominal com um bisturi e um par de tesouras e expor cuidadosamente os chifres uterinos.
   3. Injetar 1 μL de solução de DNA por embrião no ventrículo lateral de um hemisfério, conforme descrito anteriormente²⁴.
   4. Realize o IUE²⁴ regular para neurônios corticais colocando o pé de extremidade positivo do elétrodo no córtice e usando pulsos quadrados de 5 100-ms (38 V) em 1 Hertz com um electroporator.
      Nota: as regiões corticais diferentes podem ser alvejadas para o electroporation mudando a colocação do pé de extremidade do elétrodo relativo ao ventrículo lateral.
2. Injeção estereotótaxica
   1. Prepare um rato no dia pós-natal 30 para a cirurgia Stereotaxic²⁶. Anestesiar o rato como descrito no passo 3.1.2., e aplicar injeção subcutânea de analgésicos peri-operatórios contendo 5 mg/kg de carprofeno.
   2. Diluir o serotipo 2/1 do AAV (AAV2/1) que expressa hsyn-takarα-wpre a um Titer empiricamente determinado (~ 1 x 10⁹− 1 x 10¹⁰ genomes/μL) na seringa-filtrada (membrana do acetato de celulose de 0,2 μm) Saline fosfato-tamponado.
   3. Perfure um furo do diâmetro do ~ 500 μm usando uma broca handheld um estereomicroscópio nas seguintes coordenadas para o córtice de motor: 0,5 milímetros anterior a Bregma, 1,2 milímetros lateral ao Midline.
   4. Monte um injector (por exemplo, manipulador hidráulico do óleo, com o suporte feito-à-medida do êmbolo/pipeta de vidro) a um manipulador motorizado. Coloque a agulha de injeção em um ângulo de 15 ° em relação ao plano de Bregma-lambda. Programe um movimento diagonal entre os eixos x e z equivalentes a uma progressão de 700 μm e 200 μm ao longo dos eixos ântero-posterior e dorsal-ventral, respectivamente.
      Nota: Para evitar danos ao tecido diretamente acima do campo de imagem pretendido, as partículas de AAV são injetadas em um ângulo relativo ao plano de Bregma-lambda.
   5. Posicione a ponta da agulha de injeção na pia no centro do orifício de perfuração e execute lentamente o movimento diagonal (~ 25 μm/s) descrito acima. Este procedimento posicionará o centro de injeção a 1,2 mm anterior a Bregma, 1,2 mm lateral à linha média, 0,2 mm abaixo da pia.
   6. Injetar 20 nL de partículas virais diluídas (~ 10 nL/min). Aguarde pelo menos 10 min e retraia lentamente a agulha de injecção (~ 12,5 μm/s).
   7. Termine o procedimento da injeção Stereotaxic e cola/sutura a pele²⁶.

4. instalação da janela craniana

1. Realize a colocação da janela craniana em camundongos expressando tAKARα via IUE (seção 3,1) ou injeção estereotaxica de partículas virais (seção 3,2), entre os dias pós-natal 30 e 60. Para o rato infectado com partículas virais, implemente a janela craniana pelo menos duas semanas após a injecção de vírus. Instale a janela craniana como descrito anteriormente^27,28, com os seguintes detalhes. Anestesie o rato como descrito no passo 3.1.2., e aplique injeção subcutânea de analgésicos peri-operatórios 0, 75 mg/kg Buprenex e agente anti-inflamatório dexametasona a 4 mg/kg.
2. Retire o periósteo e retrair o músculo do pescoço. Cole a borda da pele ao crânio com o adesivo do tecido para evitar a exposição da musculatura da garganta após a cirurgia.
3. Seque e retire qualquer periósteo do crânio, raspando suavemente usando um bisturi. Coloque a placa de imagem (diâmetro interno de 8 mm) para cercar o campo de imagem pretendido. Cole o Headplate ao crânio usando a colagem cyanoacrylate-baseada, seguida pelo cimento acrílico dental. Para a aderência óptima, assegure-se de que o Headplate repouse sobre o crânio exposto e secado. O acelerador de cola pode ser usado para acelerar o endurecimento.
4. Desenhe um círculo de 5 mm de diâmetro acima do campo de imagem pretendido (coordenadas especificadas no passo 3.2.3) utilizando uma broca dentária e exponha a dura-máter.
5. Aplique uma camada fina de polímero transparente, também chamado de dura artificial, para a superfície dura para cobrir toda a janela craniana. O polímero protegerá e estabilizará a dura-máter. Coloque uma lamínula circular estéril (5 mm de diâmetro) na dura-máter. Fixe o lamela com a colagem do cianoacrilato aplicada em torno das bordas da janela seguidas pelo cimento acrílico dental.

5. in vivo microscopia de imagem vitalícia de fluorescência de dois fótons

1. Iniciar a imagem 2pFLIM em ou além de 2 semanas após a instalação da janela craniana (seção 4). Minimize a interferência experimental devido ao stress pelo manuseio frequente e esfregar o mouse antes do início do estudo de imagem para habituar o mouse.
2. Ajuste o comprimento de onda do laser da excitação do dois-fotão a 960 nanômetro usando o software que controla o laser do dois-fóton.
3. Anestesialize o rato utilizando isoflurano a 4%. Confirme a anestesia adequada pela cauda-pitada e observando as taxas de respiração. Ou seja, não deve haver resposta à cauda-pitada e a taxa de respiração deve ser reduzida para ~ 1 respiração por segundo. Para minimizar o tempo processual desnecessário e porque a anestesia dura somente por dois a três minutos, os lubrificantes do olho não são usados.
4. Transfira o rato anestesiado para a esteira motorizada (Figura 2C) e monte a cabeça do rato no suporte do cabeçote da instalação da esteira (veja a Figura 2 para mais detalhes). Limpe a superfície da lamínula craniana do rato com 70% de etanol.
5. Coloque a esteira motorizada com o mouse montado o objetivo 2pFLIM. Aplique uma gota de água destilada entre a lamínula de janela craniana e o objetivo.
6. Deixe o rato montado acordar da anestesia e tornar-se aclimado ao ambiente de esteira e microscópio por pelo menos 10 min. monitorar a taxa de respiração do mouse enquanto o mouse montado acorda da anestesia.
7. Navegue até o local da injeção epi-iluminação. Documente características de recursos (i.e., vasos sanguíneos) brightfield para ajudar a imagem latente da mesma região de interesse (ROI) durante sessões subseqüentes da imagem latente.
8. Elimine toda a luz entrante à excepção da luz emitida do tecido de cérebro. Desligue a fonte luminosa epi-iluminação e feche o compartimento do equipamento 2pFLIM. Ative o 2pFLIM PMT ligando o controle de tensão do comando de hardware.
9. Adquira uma imagem z-Stack 2pFLIM usando o software de aquisição 2pFLIM FLIMimage com as seguintes configurações recomendadas para imagens de SOMATA tAKARα-positivas em camundongos acordados. Defina a média do quadro para 3 frames, a velocidade de digitalização para 2 MS/linha, tamanho da imagem para 128 x 128 pixels e campo de visão para 90 − 100 μm. Ajuste as configurações de imagem com base na configuração de preparação e hardware.
10. Inspecione a imagem adquirida no FLIMview (software personalizado desenvolvido em casa; ver secção 6). Ajuste as configurações de imagem após a etapa 5,9 para otimizar a contagem de fótons e minimizar o fotobranqueamento.
    Nota: Uma contagem integrada praticável do fóton em um ROI para a imagem latente da vida de um soma tAKARα-positivo in vivo é ~ 1000 − 10000 fótons dependendo da amplitude do sinal que resulta de um estímulo particular (veja a discussão).
    1. Quando necessário, use um campo de visão diminuído, velocidade de digitalização diminuída, aumento da potência do laser e aumento do número de quadros a serem calculados para aumentar as contagens de fótons integrados e reduzir o erro de estimativa de vida útil. Ao mesmo tempo, certifique-se de usar a potência mínima essencial do laser, a média do quadro e a velocidade de digitalização para minimizar o fotobranqueamento.
11. Imagem em um intervalo de tempo regular (por exemplo, cada 30 − 60 s) repetindo a aquisição da pilha z usando as configurações determinadas na etapa 5,10. Adquira imagens de 2pFLIM de linha de base por pelo menos 15 min em velocidade de esteira zero.
12. Defina a velocidade de rotação da esteira para ~ 15 cm/s por 15 min ao adquirir imagens 2pFLIM. Continuar a imagem por ≥ 20 min após desligar a rotação da esteira rolante, para avaliar a duração da atividade de PKA após a cessação da locomoção forçada.

6. análise de imagens 2pFLIM

1. Abra as imagens adquiridas no FLIMview e defina os seguintes parâmetros no FLIMview.
   Observação: os detalhes do parâmetro são descritos em discussion.
   1. Clique no mínimo de contagem de fótons (SPC) campos mínimos e máximos de intervalo no FLIMview. Incorpore o valor mínimo e máximo apropriado da escala do SPC, tipicamente variando entre 1.2 − 2 e 10 − 12 NS, respectivamente.
   2. Estale sobre o campo do valor de t₀ no FLIMview e incorpore o valor de t₀ (tipicamente ~ 2 ns). Clique no campo de valor de limiar mínimo de luminância vitalícia no FLIMview e introduza o valor de limiar pretendido para 5 − 30 fótons.
2. Clique no novo botão de grupo (N) e atribua um nome de grupo de experimento. Isso gerará um grupo que combina dados de cada imagem FLIM adicionada.
3. Estale sobre o botão do ROI no módulo dos controles do ROI de flimview e desenhe um ROI em torno de um soma takarα-positive. Reduza o intervalo z-Stack, movendo o limite z inferior e superior nos controles deslizantes de controle de pilha z no FLIMview, para minimizar a contaminação do sinal proveniente de fótons de fundo em outras profundidades z.
4. Clique no botão + para adicionar a imagem flim ao grupo (etapa 6,2). Clique no botão Calc para calcular a duração média (lt, também chamada de tempo médio de emissão de fóton [MPET]), para o ROI e o erro de estimativa vitalícia (δτ).
5. Abra o próximo arquivo na série de imagens cronical 2pFLIM. Repita o passo 6,4. Certifique-se de ajustar a posição do ROI e do intervalo z-Stack para medir o mesmo soma tAKARα positivo ao longo do tempo, porque pode haver deriva de tecido ao longo do tempo.
6. Selecione o Deltampet/MPET₀ no menu suspenso do módulo de controles de grupo . Clique no campo # de linha de base e insira o índice (es) (por exemplo, 1 2 3 4 5 para as primeiras cinco imagens no grupo criado na etapa 6,3). Isso definirá as imagens usadas para calcular o tempo de vida da linha de base (LT₀).
7. Clique em plotar para gerar um gráfico contendo a resposta FLIM (δlt/lt₀) de takarα durante o experimento no Rois definido. Alterações normalizadas no tempo de vida (ΔLT) de ROIs individuais pelo tempo de vida basal correspondente (LT₀) permitem a comparação da atividade de pKa durante a locomoção em diferentes Rois.

Os sensores FRET-FLIM permitem a visualização de muitas vias de sinalização diferentes, incluindo a via cAMP/PKA envolvida na neuromodulação. O protocolo atual utiliza o sensor tAKARα recentemente desenvolvido em combinação com 2pFLIM para visualizar as atividades da PKA em camundongos com comportamento fixo na cabeça. A maioria dos microscópios de dois fótons existentes pode ser atualizada com capacidades 2pFLIM adicionando três a quatro componentes, como ilustrado na Figura 1 (consulte também a seção 1). Para visualizar a FRET em imagens adquiridas em 2pFLIM, a quantificação do tempo médio de vida foi realizada em parcelas de histograma de tempo de fóton coletadas por pixel (Figura 3a, B). A vida média foi visualizada por meio de uma imagem pseudocolorida, na qual as vidas médias de alta (cor fria) e baixa (cor morna) representam atividades de PKA baixas e altas, respectivamente, uma vez que a ativação do PKA leva à diminuição da vida útil. Deve-se ter cuidado para definir o intervalo SPC corretamente; Esta escala deve ser ajustada dentro do intervalo do pulso do laser (por exemplo, 12,5 ns de uma taxa de pulso de 80 megahertz) com os artefatos minimizados da borda do hardware (Veja também seção 6 e discussão). O cálculo da atividade de PKA dentro de ROIs foi realizado combinando o LT de todos os pixéis dentro de um ROI dado (Figura 3C, D). Em camundongos acordados na cabeça, os tempos de vida basal variaram entre 1,3 e 1,8 NS (Figura 3E). A imagem latente de tAKARα no córtice de motor em ratos acordados cabeça-fixados permitiu para a quantificação tempo real da atividade de PKA com definição celular durante a locomoção básica e forçada (Figura 4). O experimento pode ser repetido ao longo de dias e meses. A locomoção imposta desencadeia atividade de PKA em uma população de neurônios dentro das camadas superficiais do córtex motor do camundongo17. Esta atividade de pKa é dependente do neuromodulação através da ativação de receptores β-adrenergic e D117.

Figura 1: esquema de um sistema 2pFLIM. 2pFLIM pode ser implementado em um microscópio convencional de dois fótons pela adição dos componentes de hardware destacados amarelos: um módulo de contagem de temporização de fóton, um tubo fotomultiplicador rápido de baixo ruído (PMT), um fotodiodo (apenas necessário se o laser não tiver um sinalização de saída para o sincronismo do laser), e um divisor opcional do sinal. Este número foi modificado de ma et al.17. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: projeto de uma esteira motorizada costume-construída. (A) esquemático do projeto da escada rolante da parte dianteira (parte superior esquerda), lado (parte superior direita), e vistas superiores (parte inferior esquerda). O eixo da esteira rolante (esfera da espuma) é conectado a um codificador giratório e a um motor que sejam montados coletivamente em dois bornes em uma placa de alumínio contínua do pão. O suporte compatível com Headplate no suporte de ângulo reto é fixado a um poste sólido e posicionado acima da esteira. Os desenhos esquemáticos não são dimensionados. Frente (B) e lado (C) ver fotografias da esteira. O posicionamento adequado do mouse na esteira é mostrado no painel C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: a quantificação dos dados 2pFLIM. (A) uma imagem flim com cada pixel pseudo-colored para representar a vida média (lt), em relação ao sincronismo do laser, de todos os fótons nesse pixel. (B) os tempos de chegada do fóton dentro de um único pixel (quadrado roxo no painel a) foram plotados em um histograma (painel esquerdo). Os limites de integração foram definidos para determinar o intervalo de contagem de fótons único (SPC, cinza). Dentro da escala do SPC, a integral do sincronismo do fóton foi dividida pelo número total de fótons e subtraída então pelo t0 (1,65 ns, linha tracejada), tendo por resultado uma vida média (lt, distância entre linhas tracejadas e pontilhadas) de 1,74 NS. A quantificação da vida útil média de todo o campo de visão (quadrado azul claro no painel a) envolveu a integração do tempo de fóton coletado em todos os pixels (painel direito), resultando em uma vida útil média de 1,7 NS. Os Insets mostram os mesmos dados na escala de semi-log. (C e D) Quantificação do tempo médio de vida por região de interesse (ROI). (C) exemplo representativo de uma imagem 2pFLIM. Dois ROIs foram desenhados em torno de dois SOMATA na camada 2/3 do córtex motor. (D) distribuições de temporização de fótons integradas em todos os pixels dentro de cada ROI (painel esquerdo). Células ROIs foram codificados por cores (como mostrado no painel C) vermelho, célula 1; azul, célula 2. Contagens de fótons normalizados permitem a comparação de distribuições de temporização de fótons entre os dois ROIs (painel direito, vida útil média; célula 1, 1,33 NS; célula 2, 1,73 ns). Os Insets mostram os mesmos dados na escala de semi-log. (E) parcela de distribuição dos tempos de vida basais médios de 254 células imaged nas camadas superficiais do córtex motor. As células L1 (n = 186 células/11 animais, painel esquerdo), residentes dentro de 100 μm abaixo da pia, expressaram tAKARα após uma injeção estereotástrica de AAV2/1-hSyn-tAKARα-WPRE e L2/3 células piramidais (n = 68 células/4 animais, painel direito), residindo pelo menos 150 μm abaixo tAKARα expresso após o IUE de uma construção do ADN de CAG-tAKARα-WPRE. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: faixas de tAKARα impostas atividades de PKA locomoção-induzidas no córtex motor. (A) intensidade representativa (painel esquerdo) e imagens de vida (painéis médios e direito) de três células L1 no córtex motor. As células ROIs foram codificadas por cores: laranja, célula 1; azul, célula 2; amarelo, célula 3. (B) as distribuições de temporização do fóton medidas na célula 1 (painel superior) durante a condição basal (traço laranja, medida no painel médio Α) e a locomoção forçada (loco., traço alaranjado claro, como medido no painel direito A). Contagens de fótons normalizados permitidas para comparação direta da distribuição de temporização do fóton (painel inferior, vida média: basal, 1,72 NS; locomoção, 1,42 ns). Os Insets mostram os mesmos dados na escala de semi-log. (C) δvida/vida útil0 (δlt/lt0) traços das células correspondentes (painel superior, ver painel A) com velocidade de locomoção imposta (painel inferior). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.