Visualizando proteína quinase uma atividade na cabeça-corrigido ratos comportando-se usando in vivo microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão

Summary

Um procedimento é apresentado para visualizar as atividades da proteína quinase A em ratos cabeça-fixados, comportando-se. Um repórter melhorado da atividade da um-quinase, tAKARα, é expressado em neurônios corticais e tornado acessível para A imagem latente através de uma janela craniana. A microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão é usada para visualizar atividades de PKA in vivo durante a locomoção forçada.

Abstract

Neuromodulação exerce controle poderoso sobre a função cerebral. A disfunção de sistemas neuromodulatórios resulta em distúrbios neurológicos e psiquiátricos. Apesar de sua importância, as tecnologias para rastrear eventos neuromodulatórios com resolução celular estão apenas começando a surgir. Neuromoduladores, como dopamina, norepinefrina, acetilcolina e serotonina, desencadeiam eventos de sinalização intracelular através de seus respectivos receptores acoplados à proteína G para modular a excitabilidade neuronal, comunicações sinápticas e outros neurônios funções, regulando assim o processamento de informações na rede neuronal. Os Neuromoduladores acima mencionados convergem para a via de campo/proteína quinase A (PKA). Conseqüentemente, a imagem latente in vivo de pKa com definição da único-pilha foi desenvolvida como um leitura para eventos neuromoduladoras em uma maneira análoga à imagem latente do cálcio para atividades elétricas neuronal. Nisto, um método é apresentado para visualizar a atividade de PKA no nível de neurônios individuais no córtice de ratos de comportamento cabeça-fixados. Para fazer assim, um repórter melhorado da atividade da um-quinase (AKAR), chamado tAKARα, é usado, que é baseado na transferência da energia da ressonância de Förster (FRET). Este sensor de PKA genetically-codificado é introduzido no córtice de motor através do Electroporation do utero (IUE) de Plasmids do ADN, ou da injeção Stereotaxic do vírus adeno-associado (AAV). As mudanças do FRET são imaged usando a microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão (2pFLIM), que oferece vantagens sobre medidas ratiométricas do FRET para quantificar o sinal do FRET no tecido de luz-espalhamento do cérebro. Para estudar as atividades de PKA durante a locomoção forçada, tAKARα é imaged através de uma janela craniana crônica acima do córtice de ratos acordados, cabeça-fixos, que correm ou descansam em uma esteira motorizada velocidade-controlada. Esta aproximação da imagem latente será aplicável a muitas outras regiões do cérebro para estudar atividades de PKA comportamento-induzidas correspondentes e a outros sensores FLIM-baseados para a imagem latente in vivo.

Introduction

A neuromodulação, também conhecida como transmissão sináptica lenta, impõe um forte controle sobre a função cerebral durante diferentes Estados comportamentais, como estresse, excitação, atenção e locomoção^1,2,^{3 4}. apesar de sua importância, o estudo de quando e onde os eventos neuromodulatórios acontecem ainda está em sua infância. Neuromoduladores, incluindo acetilcolina, dopamina, noradrenalina, serotonina, e muitos neuropeptídeos, ativam receptores acoplados à proteína G (GPCRs), que por sua vez desencadeiam vias de mensageiro intracelular segundo com uma ampla janela de escalas de tempo variando de segundos a horas. Enquanto cada neuromodulador desencadeia um conjunto distinto de eventos de sinalização, a via de campo/proteína quinase a (PKA) é uma via de downstream comum para muitos Neuromoduladores^1,5. O caminho do acampamento/pKa regula a excitabilidade neuronal, a transmissão sináptica e a plasticidade^6,7,8,9e, portanto, ajusta a dinâmica da rede neuronal. Como diferentes neurônios ou tipos neuronais expressam diferentes tipos ou níveis de receptores do neuromodulador¹⁰, os efeitos intracelulares do mesmo neuromodulador extracelular podem ser heterogêneos em diferentes neurônios e, portanto, devem ser estudado com resolução celular. Até o momento, continua a ser desafiador monitorar eventos neuromodulatórios em neurônios individuais in vivo durante o comportamento.

Para estudar a dinâmica espaciotemporal da neuromodulação, é necessária uma modalidade de gravação adequada. A microdiálise e a voltametria cíclica de varredura rápida são freqüentemente usadas para estudar a liberação de Neuromoduladores, mas não têm a resolução espacial para monitorar eventos celulares^11,12. Análoga à dinâmica do cálcio que está sendo usada como um proxy para a atividade elétrica neuronal na imagem latente da população¹³, a imagem latente de pKa pode ser usada para ler para fora eventos neuromoduladoras através de uma população neuronal na definição celular. O protocolo atual descreve o uso de um repórter melhorado da atividade da um-quinase (AKAR) para monitorar atividades do PKA in vivo durante o comportamento animal. O método descrito aqui permite a imagem latente simultânea de populações neuronal na definição subcellular com uma definição temporal que rastreia eventos neuromodulatórios fisiológicos.

Os akars são compostos por um doador e um aceitador de proteínas fluorescentes ligadas por um peptídeo de substrato de fosforilação de pKa e um domínio associado à forkhead (FHA) que se liga à serina fosforilada ou treonina do substrato^14,15. Após a ativação da via PKA, o peptídeo de substrato de AKAR é fosforilado. Como resultado, o domínio FHA liga-se ao peptídeo fosforilado de substrato, trazendo assim os dois fluoróforos em estreita proximidade, referido como o estado fechado de AKAR. O estado fechado de um AKAR fosforilada conduz à transferência aumentada da energia da ressonância de Förster (fret) entre os Fluorophores do doador e do acceptor. Uma vez que a proporção de akars fosforilados está relacionada com o nível de atividade do pKa¹⁶, a quantidade de traste numa amostra biológica pode ser utilizada para quantificar o nível de atividade do pKa^{16,17,18, 19,20}.

As versões adiantadas de AKARs foram projetadas primeiramente para a imagem latente ratiométrica de duas cores¹⁴. Quando a imagem latente mais profunda no tecido de cérebro, o método raciométrica sofre da distorção do sinal devido à dispersão de luz comprimento de onda-dependente^17,18,21. Como discutido abaixo, a microscopia da imagem latente da vida da fluorescência (flim) elimina este problema porque flim mede somente os fótons emitidos pelo fluoróforo fornecedor^18,21. Como resultado, a quantificação de FLIM de FRET não é afetada pela profundidade do tecido¹⁷. Além disso, uma variante "escura" (i.e., baixa produção quântica [QY]) do fluoróforo aceptor pode ser usada. Isso libera um canal de cor para facilitar a medição multiplexada de propriedades neuronais ortogonais via imagem simultânea de um segundo sensor ou um marcador morfológico^17,19,20.

A imagem latente de flim quantifica o tempo que um fluoróforo gasta no estado excited, isto é, a vida da fluorescência¹⁸. O retorno de um fluoróforo ao estado de terra, assim o fim do estado excitado, frequentemente concomitates com a emissão de um Photon. Embora a emissão de um fóton para uma molécula animada individual é estocástica, em uma população a vida média de fluorescência é uma característica desse fluoróforo particular. Quando uma população pura de fluoróforos são excitados simultaneamente, a fluorescência resultante seguirá uma única deterioração exponencial. A constante de tempo desta deterioração exponencial corresponde à vida média da fluorescência, que varia tipicamente de um a quatro nanossegundos para proteínas fluorescentes. O retorno de um fluoróforo doador excited ao estado à terra pode igualmente ocorrer por fret. Na presença de FRET, a vida de fluorescência do fluoróforo do doador é reduzida. Os akars resíduo exibem uma vida fornecedora relativamente mais longa da fluorescência. Após a fosforilação por PKA, o sensor exibe uma vida mais curta porque os fluoróforos doador e aceitador são trazidos perto uns dos outros e FRET é aumentada. A quantificação da vida da fluorescência em uma população de AKARs representa conseqüentemente o nível de atividade de PKA.

As primeiras versões de AKARs não foram usadas com sucesso para a imagem latente in vivo na definição da único-pilha. Isto é principalmente devido à baixa amplitude do sinal dos sensores de AKAR às ativações fisiológicas¹⁷. Recentemente, comparando sistematicamente os sensores disponíveis de AKAR para a microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão (2pflim), um sensor chamado flim-AKAR foi encontrado para superar sensores alternativos. Além disso, uma série de variantes de FLIM-AKAR chamadas de AKARs direcionados (tAKARs) foram desenvolvidas para visualizar a atividade de PKA em locais subcelulares específicos: microtúbulos (tAKARα), citosol (tAKARβ), actina (tAKARδ), actina filamentosa (tAKARε), membrana (tAKARγ), e densidade pós-sináptica (tAKARζ). Entre tAKARs, tAKARα aumentou a amplitude do sinal eliciada pela norepinefrina por 2,7 vezes. Isso é consistente com o conhecimento de que a maioria dos pKa nos neurônios está ancorada a microtúbulos no estado de repouso^22,23. tAKARα foi o melhor intérprete entre os AKARs existentes para 2pFLIM. Além disso, tAKARα detectou atividade fisiologicamente relevante de PKA eliciada por múltiplos Neuromoduladores, e a expressão de tAKARα não alterou as funções neuronais¹⁷.

Recentemente, o tAKARα foi usado com sucesso para visualizar as atividades da PKA em camundongos com comportamento fixo de cabeça¹⁷. Mostrou-se que a locomoção forçada desencadeou a atividade de PKA no soma de neurônios superficiais da camada (camada 1 a 3, até uma profundidade de ~ 300 μm da pia) no motor, no tambor, e nos córtices visuais. A atividade de PKA locomoção-desencadeada era na parte dependente da sinalização através dos receptores β-adrenergic e dos receptores do dopamine D1, mas não foi afetada por um antagonista do receptor do dopamine D2. Este trabalho ilustra a capacidade de tAKARs para rastrear eventos de neuromodulação in vivo usando 2pFLIM.

No protocolo atual, o método inteiro para a imagem latente da atividade de PKA em ratos acordados cabeça-fixados durante um paradigma forçado da locomoção é descrito em seis etapas. Primeiro, a adição de capacidades 2pFLIM a um microscópio convencional de dois fótons (Figura 1). Em segundo lugar, a construção de uma esteira motorizada (Figura 2). Em terceiro lugar, a expressão do sensor de tAKARα no córtex do rato por in utero Electroporation (IUE) de plasmíos de DNA, ou injeção estereotaxica de vírus adeno-associado (AAV). Os protocolos excelentes para cirurgias para IUE^24,25 e a injeção Stereotaxic de partículas virais²⁶ foram publicados previamente. Os principais parâmetros que usamos são descritos abaixo. Adiante, a instalação de uma janela craniana. Os protocolos excelentes foram publicados previamente para a cirurgia da janela craniana^27,28. Várias etapas que foram modificadas dos protocolos padrão são descritas. Quinto, realizando in vivo 2pFLIM. Sexto, as análises das imagens 2pFLIM (Figura 3 e Figura 4). Esta aproximação deve prontamente ser aplicável a muitos outros paradigmas comportamentais cabeça-fixos e áreas do cérebro.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Oregon Health and Science University.

1. configuração do microscópio 2pFLIM

1. Instale um módulo de contagem de temporização de fóton (PTCM, tabela de materiais) e conecte-se ao computador (Figura 1) de acordo com o manual do fabricante.
   Nota: O PTCM é tipicamente uma placa do computador que receba uma entrada da "sincronização" para o sincronismo do pulso do laser e uma entrada do fóton do tubo do photomultiplicador (PMT). Ele também recebe tempo de clock para pixels, linhas e quadros, de software de controle de imagem de dois fótons. O PTCM usa os sinais de relógio para separar fótons individuais em diferentes pixels e quadros.
2. Adicione um fotodiodo com > largura de banda de 200 MHz para medir o sincronismo do laser. Coloque uma lamínula de vidro padrão no trajeto da luz para refletir uma pequena fração da luz do laser no fotodiodo colocado perpendicularmente ao trajeto da luz (Figura 1). Ligue a saída do fotodiodo à entrada "Sync" do PTCM.
   Nota: Muitos lasers modernos também output o sincronismo do laser. Para estes lasers, o fotodiodo não é necessário, e um pode diretamente conectar a saída do sincronismo do laser à entrada da sincronização do ptcm.
3. Troque o PMT, no caso do tAKARα, o canal verde PMT, com um PMT GaAsP de baixo ruído e rápido (Figura 1). Ligue a saída PMT à entrada de sinal do PTCM.
   1. Adicione um divisor opcional do sinal (Figura 1) se a aquisição simultânea da intensidade através do canal convencional da imagem latente do dois-fotão é desejada. Conecte a saída de PMT ao divisor do sinal e conecte a saída do divisor ao PTCM e ao módulo convencional da imagem latente do dois-fotão.
      Nota: Os PMTs de GaAsP dão uns sinais mais rápidos do único-fotão do que PMTs convencionais do bialcalóide e permitem uma determinação mais exata do sincronismo do fóton. Determinados modelos de PMTs de GaAsP podem ser refrigerados a 10 − 35 ° c abaixo da temperatura ambiental, permitindo a supressão de contagens escuras a um nível abaixo de algumas cem por segundo (tipicamente ≤ 200 contagens/s). Este baixo nível de ruído é importante para a medida precisa de tempos de vida da fluorescência porque as contagens do fóton do ruído não podem facilmente ser distinguidas ou subtraída da curva da vida da fluorescência.
4. Adicionar um filtro de emissão de fluorescência de banda-Pass que minimiza a contaminação espectral, se houver, do aceptor fluoróforo. Por exemplo, para takarα, um filtro de barreira de 500 nm ± 20 nm para o canal verde é usado para reduzir a contaminação do Acceptor Sreach, que é uma proteína fluorescente amarela (QY ~ 0, 7) escura (YFP)^29,30. Conecte os sinais de temporização, como os pulsos de disparo para pixéis, linhas, e frames individuais da imagem, conforme apropriado ao software de controle e descrito no manual do usuário PTCM. Instale o software de controle e aquisição de dados apropriado.
   Nota: Alguns fabricantes de PTCM (tabela de materiais) fornecem seu software para a imagem latente 2pflim. Aqui, o software feito encomenda chamado FLIMimage é usado, que foi desenvolvido pelo laboratório de Yasuda (Max Planck Florida, através da comunicação pessoal). Este software funciona como uma função de usuário Add-on para determinado software de aquisição de dois fótons (tabela de materiais). Controla e comunica-se com o PTCM no sincronismo apropriado durante a imagem latente do dois-fotão para adquirir imagens 2pFLIM.

2. construção de uma esteira motorizada

Nota: O design da esteira motorizada personalizada é mostrado na Figura 2.

1. Corte um rolo de espuma (Ø = 200 mm) a 150 mm de comprimento com uma serra fina. Alternativamente, Cole as duas metades de uma bola de espuma juntas e coloque fita sobre a costura. Opcionalmente, Cole uma esteira de borracha com perfil no rolo para aumentar a tração no rolo.
2. Perfure um furo do diâmetro de 1/4 polegadas através do centro do rolo no lado liso do rolo ou perfure um furo do diâmetro de 1/4 polegadas através do meio de cada metade da esfera se a esfera da espuma é usada.
3. Instale um eixo de aço do diâmetro de 1/4 polegadas através do furo. Cole o rolo de espuma/bola para o eixo usando espuma-compatível cola. Opcionalmente, modifique dois acoplamentos flexíveis do eixo (diâmetro interno de 1/4 polegadas) para reforçar o acoplamento do eixo ao rolo/esfera de espuma.
   Nota: Anote por favor que muitas colas comuns podem dissolver a espuma.
   1. Para cada acoplamento do eixo, posicione o acoplamento do eixo em seu lado liso e no centro da placa de metal do retângulo (0,7 milímetros x 15 milímetros x 76 milímetros). Soldar a chapa ao acoplamento do eixo. Perfure um furo de 1/4 polegadas no centro da placa para permitir a instalação do acoplamento de eixo modificado sobre ao eixo e dos dois furos de parafuso na placa de metal lateral do centro.
   2. Instale o acoplamento do eixo no eixo contra o rolo de espuma/bola. Se usar este último, Dobre levemente a placa para caber a curvatura da esfera. Coloque os parafusos nos orifícios laterais para fixar o rolo/bola no eixo.
4. Perfure e bata uma rosca 3/8-32 no centro de uma placa de gaiola e instale o codificador rotativo. Perfure um furo do parafuso na base do suporte do motor do direito-ângulo para permitir o acessório do motor no suporte do borne. Fixe o codificador rotativo e o motor à extremidade do eixo utilizando um acoplamento de eixo flexível.
5. Instale a esteira montada em uma placa de pão de alumínio usando postes para o motor e o codificador rotativo (Figura 2). Conecte as entradas do motor ao controlador de velocidade e a saída do codificador rotativo a uma entrada analógica da placa de aquisição de dados do computador (DAQ).
   Nota: A velocidade angular da rotação é codificada pelo codificador giratório como a tensão e é digitalizada usando o software feito encomenda chamado AnimalTracker escrito em MATLAB.
6. Instale o suporte compatível com Headplate em um suporte de ângulo reto. Instale um poste sólido na placa de pão em frente à esteira rolante e instale o suporte montado do Headplate com o suporte de ângulo reto no poste (Figura 2). Assegure-se de que as barras de suporte da placa de cabeceira estejam alinhadas com o eixo de modo que o rato possa adoptar uma posição de pé adequada e confortável na esteira (Figura 2C).

3. expressão do sensor tAKARα no córtex do rato

1. No utero Electroporation
   1. Prepare uma solução de DNA para IUE adicionando 0,2% de concentração final de corante verde rápido (para visualização durante a injeção) a um DNA plasmídeo (3 − 4 μg/μl; as construções do sensor contendo um promotor CAG, seqüência de sensores e um vírus da hepatite de marmota elemento de resposta pós-transcricional [WPRE] potenciador translacional) dissolvido/diluído em água ou Tris-EDTA.
   2. Prepare um rato fêmea grávido cronometrado (por exemplo, C57BL/6) para IUE em E16²⁴. Anestesie o camundongo com isoflurano (4% para indução e 1,5% para manutenção, em 95% O2 com 5% CO₂) e aplique injeção subcutânea de analgésicos peri-operatórios contendo 5 mg/kg de Meloxicam e 4 mg/kg de bupivacaína. Corte abrir a cavidade abdominal com um bisturi e um par de tesouras e expor cuidadosamente os chifres uterinos.
   3. Injetar 1 μL de solução de DNA por embrião no ventrículo lateral de um hemisfério, conforme descrito anteriormente²⁴.
   4. Realize o IUE²⁴ regular para neurônios corticais colocando o pé de extremidade positivo do elétrodo no córtice e usando pulsos quadrados de 5 100-ms (38 V) em 1 Hertz com um electroporator.
      Nota: as regiões corticais diferentes podem ser alvejadas para o electroporation mudando a colocação do pé de extremidade do elétrodo relativo ao ventrículo lateral.
2. Injeção estereotótaxica
   1. Prepare um rato no dia pós-natal 30 para a cirurgia Stereotaxic²⁶. Anestesiar o rato como descrito no passo 3.1.2., e aplicar injeção subcutânea de analgésicos peri-operatórios contendo 5 mg/kg de carprofeno.
   2. Diluir o serotipo 2/1 do AAV (AAV2/1) que expressa hsyn-takarα-wpre a um Titer empiricamente determinado (~ 1 x 10⁹− 1 x 10¹⁰ genomes/μL) na seringa-filtrada (membrana do acetato de celulose de 0,2 μm) Saline fosfato-tamponado.
   3. Perfure um furo do diâmetro do ~ 500 μm usando uma broca handheld um estereomicroscópio nas seguintes coordenadas para o córtice de motor: 0,5 milímetros anterior a Bregma, 1,2 milímetros lateral ao Midline.
   4. Monte um injector (por exemplo, manipulador hidráulico do óleo, com o suporte feito-à-medida do êmbolo/pipeta de vidro) a um manipulador motorizado. Coloque a agulha de injeção em um ângulo de 15 ° em relação ao plano de Bregma-lambda. Programe um movimento diagonal entre os eixos x e z equivalentes a uma progressão de 700 μm e 200 μm ao longo dos eixos ântero-posterior e dorsal-ventral, respectivamente.
      Nota: Para evitar danos ao tecido diretamente acima do campo de imagem pretendido, as partículas de AAV são injetadas em um ângulo relativo ao plano de Bregma-lambda.
   5. Posicione a ponta da agulha de injeção na pia no centro do orifício de perfuração e execute lentamente o movimento diagonal (~ 25 μm/s) descrito acima. Este procedimento posicionará o centro de injeção a 1,2 mm anterior a Bregma, 1,2 mm lateral à linha média, 0,2 mm abaixo da pia.
   6. Injetar 20 nL de partículas virais diluídas (~ 10 nL/min). Aguarde pelo menos 10 min e retraia lentamente a agulha de injecção (~ 12,5 μm/s).
   7. Termine o procedimento da injeção Stereotaxic e cola/sutura a pele²⁶.

4. instalação da janela craniana

1. Realize a colocação da janela craniana em camundongos expressando tAKARα via IUE (seção 3,1) ou injeção estereotaxica de partículas virais (seção 3,2), entre os dias pós-natal 30 e 60. Para o rato infectado com partículas virais, implemente a janela craniana pelo menos duas semanas após a injecção de vírus. Instale a janela craniana como descrito anteriormente^27,28, com os seguintes detalhes. Anestesie o rato como descrito no passo 3.1.2., e aplique injeção subcutânea de analgésicos peri-operatórios 0, 75 mg/kg Buprenex e agente anti-inflamatório dexametasona a 4 mg/kg.
2. Retire o periósteo e retrair o músculo do pescoço. Cole a borda da pele ao crânio com o adesivo do tecido para evitar a exposição da musculatura da garganta após a cirurgia.
3. Seque e retire qualquer periósteo do crânio, raspando suavemente usando um bisturi. Coloque a placa de imagem (diâmetro interno de 8 mm) para cercar o campo de imagem pretendido. Cole o Headplate ao crânio usando a colagem cyanoacrylate-baseada, seguida pelo cimento acrílico dental. Para a aderência óptima, assegure-se de que o Headplate repouse sobre o crânio exposto e secado. O acelerador de cola pode ser usado para acelerar o endurecimento.
4. Desenhe um círculo de 5 mm de diâmetro acima do campo de imagem pretendido (coordenadas especificadas no passo 3.2.3) utilizando uma broca dentária e exponha a dura-máter.
5. Aplique uma camada fina de polímero transparente, também chamado de dura artificial, para a superfície dura para cobrir toda a janela craniana. O polímero protegerá e estabilizará a dura-máter. Coloque uma lamínula circular estéril (5 mm de diâmetro) na dura-máter. Fixe o lamela com a colagem do cianoacrilato aplicada em torno das bordas da janela seguidas pelo cimento acrílico dental.

5. in vivo microscopia de imagem vitalícia de fluorescência de dois fótons

1. Iniciar a imagem 2pFLIM em ou além de 2 semanas após a instalação da janela craniana (seção 4). Minimize a interferência experimental devido ao stress pelo manuseio frequente e esfregar o mouse antes do início do estudo de imagem para habituar o mouse.
2. Ajuste o comprimento de onda do laser da excitação do dois-fotão a 960 nanômetro usando o software que controla o laser do dois-fóton.
3. Anestesialize o rato utilizando isoflurano a 4%. Confirme a anestesia adequada pela cauda-pitada e observando as taxas de respiração. Ou seja, não deve haver resposta à cauda-pitada e a taxa de respiração deve ser reduzida para ~ 1 respiração por segundo. Para minimizar o tempo processual desnecessário e porque a anestesia dura somente por dois a três minutos, os lubrificantes do olho não são usados.
4. Transfira o rato anestesiado para a esteira motorizada (Figura 2C) e monte a cabeça do rato no suporte do cabeçote da instalação da esteira (veja a Figura 2 para mais detalhes). Limpe a superfície da lamínula craniana do rato com 70% de etanol.
5. Coloque a esteira motorizada com o mouse montado o objetivo 2pFLIM. Aplique uma gota de água destilada entre a lamínula de janela craniana e o objetivo.
6. Deixe o rato montado acordar da anestesia e tornar-se aclimado ao ambiente de esteira e microscópio por pelo menos 10 min. monitorar a taxa de respiração do mouse enquanto o mouse montado acorda da anestesia.
7. Navegue até o local da injeção epi-iluminação. Documente características de recursos (i.e., vasos sanguíneos) brightfield para ajudar a imagem latente da mesma região de interesse (ROI) durante sessões subseqüentes da imagem latente.
8. Elimine toda a luz entrante à excepção da luz emitida do tecido de cérebro. Desligue a fonte luminosa epi-iluminação e feche o compartimento do equipamento 2pFLIM. Ative o 2pFLIM PMT ligando o controle de tensão do comando de hardware.
9. Adquira uma imagem z-Stack 2pFLIM usando o software de aquisição 2pFLIM FLIMimage com as seguintes configurações recomendadas para imagens de SOMATA tAKARα-positivas em camundongos acordados. Defina a média do quadro para 3 frames, a velocidade de digitalização para 2 MS/linha, tamanho da imagem para 128 x 128 pixels e campo de visão para 90 − 100 μm. Ajuste as configurações de imagem com base na configuração de preparação e hardware.
10. Inspecione a imagem adquirida no FLIMview (software personalizado desenvolvido em casa; ver secção 6). Ajuste as configurações de imagem após a etapa 5,9 para otimizar a contagem de fótons e minimizar o fotobranqueamento.
    Nota: Uma contagem integrada praticável do fóton em um ROI para a imagem latente da vida de um soma tAKARα-positivo in vivo é ~ 1000 − 10000 fótons dependendo da amplitude do sinal que resulta de um estímulo particular (veja a discussão).
    1. Quando necessário, use um campo de visão diminuído, velocidade de digitalização diminuída, aumento da potência do laser e aumento do número de quadros a serem calculados para aumentar as contagens de fótons integrados e reduzir o erro de estimativa de vida útil. Ao mesmo tempo, certifique-se de usar a potência mínima essencial do laser, a média do quadro e a velocidade de digitalização para minimizar o fotobranqueamento.
11. Imagem em um intervalo de tempo regular (por exemplo, cada 30 − 60 s) repetindo a aquisição da pilha z usando as configurações determinadas na etapa 5,10. Adquira imagens de 2pFLIM de linha de base por pelo menos 15 min em velocidade de esteira zero.
12. Defina a velocidade de rotação da esteira para ~ 15 cm/s por 15 min ao adquirir imagens 2pFLIM. Continuar a imagem por ≥ 20 min após desligar a rotação da esteira rolante, para avaliar a duração da atividade de PKA após a cessação da locomoção forçada.

6. análise de imagens 2pFLIM

1. Abra as imagens adquiridas no FLIMview e defina os seguintes parâmetros no FLIMview.
   Observação: os detalhes do parâmetro são descritos em discussion.
   1. Clique no mínimo de contagem de fótons (SPC) campos mínimos e máximos de intervalo no FLIMview. Incorpore o valor mínimo e máximo apropriado da escala do SPC, tipicamente variando entre 1.2 − 2 e 10 − 12 NS, respectivamente.
   2. Estale sobre o campo do valor de t₀ no FLIMview e incorpore o valor de t₀ (tipicamente ~ 2 ns). Clique no campo de valor de limiar mínimo de luminância vitalícia no FLIMview e introduza o valor de limiar pretendido para 5 − 30 fótons.
2. Clique no novo botão de grupo (N) e atribua um nome de grupo de experimento. Isso gerará um grupo que combina dados de cada imagem FLIM adicionada.
3. Estale sobre o botão do ROI no módulo dos controles do ROI de flimview e desenhe um ROI em torno de um soma takarα-positive. Reduza o intervalo z-Stack, movendo o limite z inferior e superior nos controles deslizantes de controle de pilha z no FLIMview, para minimizar a contaminação do sinal proveniente de fótons de fundo em outras profundidades z.
4. Clique no botão + para adicionar a imagem flim ao grupo (etapa 6,2). Clique no botão Calc para calcular a duração média (lt, também chamada de tempo médio de emissão de fóton [MPET]), para o ROI e o erro de estimativa vitalícia (δτ).
5. Abra o próximo arquivo na série de imagens cronical 2pFLIM. Repita o passo 6,4. Certifique-se de ajustar a posição do ROI e do intervalo z-Stack para medir o mesmo soma tAKARα positivo ao longo do tempo, porque pode haver deriva de tecido ao longo do tempo.
6. Selecione o Deltampet/MPET₀ no menu suspenso do módulo de controles de grupo . Clique no campo # de linha de base e insira o índice (es) (por exemplo, 1 2 3 4 5 para as primeiras cinco imagens no grupo criado na etapa 6,3). Isso definirá as imagens usadas para calcular o tempo de vida da linha de base (LT₀).
7. Clique em plotar para gerar um gráfico contendo a resposta FLIM (δlt/lt₀) de takarα durante o experimento no Rois definido. Alterações normalizadas no tempo de vida (ΔLT) de ROIs individuais pelo tempo de vida basal correspondente (LT₀) permitem a comparação da atividade de pKa durante a locomoção em diferentes Rois.

Results

Os sensores FRET-FLIM permitem a visualização de muitas vias de sinalização diferentes, incluindo a via cAMP/PKA envolvida na neuromodulação. O protocolo atual utiliza o sensor tAKARα recentemente desenvolvido em combinação com 2pFLIM para visualizar as atividades da PKA em camundongos com comportamento fixo na cabeça. A maioria dos microscópios de dois fótons existentes pode ser atualizada com capacidades 2pFLIM adicionando três a quatro componentes, como ilustrado na

Discussion

Este protocolo demonstra o uso do sensor tAKARα de FRET-FLIM para visualizar a atividade de PKA neuromodulação-disparada em ratos de comportamento cabeça-fixados. Esta aplicação é baseada em testes extensivos e caracterizações de tAKARα in vitro e in vivo para demonstrar que o sinal FLIM obtido é relevante para eventos neuromodulatórios fisiológicos¹⁷. Aqui, uma aplicação in vivo, atividade de PKA locomoção induzida no córtex motor, é usada para descrever os procedimentos para entregar o sensor ao...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,2 μ m filtro de seringa de acetato de celulose	Nalgene	190-2520	Etapa 3.2.2.
Objetiva de imersão em água de 16x 0.8 NA	Nikon	MRP07220	Passo 5.5.
Cabo de 3 pinos	CA digital dos EUA		Para conectar o sensor de rotação à entrada DAQ do microscópio
Placa de pão de alumínio	Thorlabs	MB1012	Etapa 2.5.
Software AnimalTracker	MATLAB N/A	N/A	Etapa 2.5 e seções 5 - 6. Será fornecido mediante solicitação ao autor principal
Filtro de barreira passa-banda	Chroma	ET500-40m	Etapa 1.4.
Placa de gaiola	Thorlabs	CP01	Etapa 2.4. Usado como suporte para sensor de rotação
Rebarbas de aço carbono para micro broca, diâmetro da ponta de 0,5 mm	FST	19007-05	Etapas 3.2.3. e 4.4.
lamínula circular (5 mm de diâmetro)	VWR	101413-528	Passo 4.5.
Porta-agulhas de injecção por medida	N/A	N/A	Passo 3.2.4. Detalhes técnicos fornecidos mediante solicitação ao autor principal
Acrílico dental	Yates Motloid	44114	Etapas 4.3. e 4.5.
Broca odontológica; Produtos Microtorque ii	Ram	66699	Passos 3.2.3. e 4.4.
Polímero transparente Dowsil	The Dow Chemical Company	3-4680	Etapa 4.5. Eletrodo
de eletroporação	Bex	LF650P5	Etapa 3.1.4.
Eletroporador	Bex	CUY21	Etapa 3.1.4.
rápido FCF	Sigma-aldrich	F7258-25G	Etapa 3.1.1.
Software FLIMimage MATLAB	N/A	N/A	Seção 5. Gentilmente cedido pelo Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck, Flórida,
FLIMview software MATLAB	N/A	N/A	Seções 5. e 6. Será fornecido mediante solicitação ao autor principal
Cola compatível com espuma (Gorilla White Glue)	Gorilla	5201204	Etapa 2.3.
Placa de cabeça	N/A	N/A	Passo 4.3. Detalhes técnicos fornecidos mediante solicitação ao autor principal
Suporte da placa de cabeça	N/A	N/A	Etapa 2.6. Detalhes técnicos fornecidos mediante solicitação autor principal, usado em combinação com suporte de poste de montagem e suporte em ângulo reto
Micromanipulador hidráulico	Narishige	MO-10	Etapa 3.2.4.
Cola Krazy Cola	Krazy	KG82648R	Passo 4.3. Cola à base de cianoacrilato
Tubo fotomultiplicador rápido e silencioso	Hamamatsu	H7422PA-40 ou H10769PA-40	Etapa 1.3.
MATLAB 2012b	Mathworks	N/A	Etapas 2.6 e seções 5 e 6. Usado para executar o software de aquisição e análise de dados
do microscópio Motor	Zhengke	ZGA37RG	Etapa 2.4.
Controlador de velocidade do motor	Elenker	EK-G00015A1-1	Etapa 2.5.
Micromanipulador motorizado	Sutter	MP-285	Etapa 3.2.4.
Base de montagem	Thorlabs	BA1S	Etapa 2.5. Usado para postes para motor e sensor em combinação com PH4 e TR2
Poste de montagem	Thorlabs	P14	Passo 2.6. Usado para poste de suporte de placa de cabeça em combinação com PB2
Base de poste de montagem	Thorlabs	PB2	Etapa 2.6. Usado para poste de suporte de placa de cabeça em combinação com P14
Suporte de poste de montagem	Thorlabs	C1515	Passo 2.6. Usado em combinação com suporte de ângulo reto e suporte de placa de cabeça
Poste óptico	Thorlabs	TR2	Step 2.5. Usado para postes para motor e sensor em combinação com BA1S e PH4
Solução salina tamponada com fosfato	Ν/Α	Ν/&Alfa;	Etapa 3.2.2. Protocolo: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247
Fotodiodo	Thorlabs	FDS010	Etapa 1.2.
Módulo de contagem de tempo de fótons	Becker e Hickl	SPC-150	Etapa 1.1.
Plasmídeo: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE)	Addgene	119913	Etapa 3.1.3.
Porta-postes	Thorlabs	PH4	Etapa 2.5. Usado para postes para motor e sensor em combinação com BA1S e TR2
Suporte de ângulo reto	Thorlabs	AB90	Etapa 2.6 Usado em combinação com suporte de poste de montagem e suporte de placa de cabeça
Codificador de rotação	US digital	MA3-A10-250-N	Etapa 2.4.
Tapete de borracha	Rubber-Cal	B01DCR5LUG	Passo 2.1.
Acoplamento de eixo (1/4 polegada x 1/4 polegada)	McMaster	6208K433	Passos 2.3. e 2.4.
ScanImage 3.6	Svoboda Lab/Vidrio Technology	N/A	Etapas 5.9. e 6.1.
Divisor de sinal	Becker e Hickl	HPM-CON-02	Etapa 1.3.1.
Eixo de aço inoxidável (diâmetro 1/4 polegada, L = 12 polegadas)	McMaster	1327K66	Passo 2.3.
Sistema de alinhamento estereotáxico	David kopf	1900	Passos 3.2. e 4.1. modificado; Micromanipulador Sutter, porta-agulha de injeção feito sob medida, micromanipulador hidráulico
Microscópio de dois fótons	N / A	N / A	Seção 5. Construído com base no sistema modular de microscopia multifotônica in vivo (MIMMS) do HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms)
Adesivo tecidual Vetbond	3M	14006	Etapa 3.2.6.
Vírus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE)	Addgene	119921	Etapa 3.2.2.
Rolo de espuma PE branco (8 polegadas x 12 polegadas)	Empresas de fabricação INC.	30-2261	Etapa 2.1.1.
Metades de bola de poliestireno branco	GrahamSweet	200mm de diâmetro 2 metades ocas	Etapa 2.1.1.
Zipkicker	PACER	PT29	Passo 4.3. Acelerador de endurecimento