Métodos para testar a perturbação endócrina na Drosophila melanogaster

Resumo

Os produtos químicos do disruptor da glândula endócrina (EDCs) representam um problema sério para organismos e para ambientes naturais. A Drosophila melanogaster representa um modelo ideal para estudar os efeitos da EdC in vivo. Aqui, nós apresentamos métodos para investigar o rompimento da glândula endócrina em Drosophila, abordando efeitos de EDC na fecundidade, na fertilidade, no sincronismo desenvolvente, e no tempo da mosca.

Resumo

Nos últimos anos, tem havido uma crescente evidência de que todos os organismos e o meio ambiente estão expostos a produtos químicos semelhantes a hormônios, conhecidos como produtos químicos do disruptor endócrino (EDCs). Estes produtos químicos podem alterar o equilíbrio normal dos sistemas endócrinos e levar a efeitos adversos, bem como um número crescente de distúrbios hormonais na população humana ou o crescimento perturbado e redução da reprodução nas espécies selvagens. Para alguns EDCs, existem efeitos de saúde documentados e restrições sobre a sua utilização. No entanto, para a maioria deles, ainda não há evidências científicas nesse sentido. A fim de verificar os potenciais efeitos endócrinos de um produto químico no organismo completo, precisamos testá-lo em sistemas de modelo adequados, bem como na mosca da fruta, Drosophila melanogaster. Aqui nós relatamos detalhado in vivo protocolos para estudar o rompimento da glândula endócrina em Drosophila, abordando efeitos de EDC na fecundidade/fertilidade, no sincronismo desenvolvente, e no tempo da mosca. Nos últimos anos, utilizamos esses traços de vida de Drosophila para investigar os efeitos da exposição a 17-α-Etinilestradiol (EE2), bisfenol A (BPA) e bisfenol AF (BPA F). Ao todo, esses ensaios cobriram todos os estágios de vida da Drosophila e possibilitava avaliar o rompimento endócrino em todos os processos mediados por hormônios. Os ensaios de fecundidade/fertilidade e tempo de desenvolvimento foram úteis para mensurar o impacto do EDC no desempenho reprodutivo de mosca e em estágios de desenvolvimento, respectivamente. Finalmente, o ensaio da vida envolveu exposições crônicas do EDC aos adultos e mediu sua sobrevivência. No entanto, esses traços de vida também podem ser influenciados por vários fatores experimentais que tiveram que ser cuidadosamente controlados. Assim, neste trabalho, sugerimos uma série de procedimentos que otimizamos para o resultado correto desses ensaios. Estes métodos permitem que os cientistas estabeleçam o rompimento da glândula endócrina para todo o EDC ou para uma mistura de EDCs diferentes em Drosophila, embora identifique o mecanismo da glândula endócrina responsável para o efeito, uns essays mais adicionais poderiam ser necessários.

Introdução

As actividades humanas têm vindo a libertar no ambiente uma enorme quantidade de produtos químicos, que representam um grave problema para os organismos e para os ecossistemas naturais¹. Destes poluentes, estima-se que cerca de 1.000 produtos químicos diferentes podem alterar o equilíbrio normal dos sistemas endócrinos; de acordo com esta propriedade, eles são classificados como produtos químicos de desregulação endócrina (EDCs). Especificamente, com base em uma definição recente pela sociedade endócrina, os EDCs são "um produto químico exógeno, ou mistura de produtos químicos, que podem interferir com qualquer aspecto da ação hormonal"

Protocolo

1. preparação de alimentos

1. Para a manutenção de estoque e para o crescimento larval, use um meio de farinha de milho contendo 3% de fermento em pó, 10% de sacarose, 9% de farinha de milho pré-cozida, 0,4% de agar, depois chamado meio de farinha de milho (CM).
   1. Coloque 30 g de fermento em 100 mL de água da torneira, leve-o a ferver e deixe ferver por 15 min.
   2. Separadamente, misture bem 90 g de farinha de milho pré-cozida, 100 g de açúcar e 4 g de agar em 900 mL de água da torneira.
   3. Traga a solução para ferver, abaixe o calor e cozinhe por 5 minutos mexendo continuamente.
   4. Após 5 minutos, adicione a sol....

Resultados

Nesta seção, as etapas-chave dos protocolos acima são relatadas a forma de esquemas simplificados. Dado que as moscas tendem a evitar compostos inpalatáveis, a primeira coisa a fazer é o ensaio do gosto do EDC selecionado. Isto pode ser feito misturando uma coloração de alimento (por exemplo, corante vermelho do alimento no. 40)³⁵ com o alimento suplementado com o EDC selecionado em várias doses ou com o solvente sozinho. Moscas alimentadas com esses meios são examinadas um estereomicroscópio e a .......

Discussão

O Fruit Fly D. melanogaster tem sido extensivamente empregado como um sistema in vivo modelo para investigar os efeitos potenciais de EDCs ambientais, tais como DBP²⁸, BPA, 4-NP, 4-tert-op²⁹, MP³⁰, EP^{31, 32}, DEHP³³, e EE2³⁴. Várias razões levaram seu uso como modelo neste campo de pesquisa. Aparte de suas vantagens indiscutíveis como u.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ágar 17&alfa;-etinilestradiol	Sigma	E4876-1G
para Drosophila meio	BIOSIGMA	789148
Bisfenol A	Sigma	239658-50G
Bisfenol AF	Sigma	90477-100MG
Fubá	CA' BIANCA
Éter dietílico	Sigma
Frascos de Drosophila	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Frascos de Drosophila	789009	29 mm x 95 mm
Frascos de Drosophila	Kaltek	187	22 mm x 63 mm
Gaiola de coleta de embriões	Crafts		Cilindro de plexiglass (12,5 mm x 7 cm) com uma extremidade aberta e a outra extremidade fechada por uma base retangular na qual uma ranhura permite a inserção de bandejas especiais para assentamento
de etanol	FLUKA	2860
Etherizer	Crafts		recipiente de vidro cilíndrico com plugue de algodão
Garrafa de vidro Garrafas			de 250 mL
Frascos de vidro	Microtech	ST 10024	Tubo de fundo plano 100 x 24
Varinha mágica Pimmy	Ariete		processador de alimentos
Instantâneo Fermento de sucesso	ESKA		Fermento em pó
Bandeja de assentamento	Artesanato		bandejas de plexiglass (11 cm x 2,6 cm) para derramar meio para assentamento
Metil4-hidroxibenzoato	SIGMA	H5501
Placa de Petri	Falcon	351016	60x5
Corante vermelho nº 40	SIGMA	16035
Estereomicroscópio com luzes LED	Leica		S4E
Sacarose	HIMEDIA	MB025
Molho de tomate	Cirio