Isolação de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha para o estudo da incorporação do ácido gordo do micróbio patogénico bacteriano em phospholipids da membrana

S. aureus resistente à meticilina (MRSA) é a principal causa de infecção associada à saúde e a resistência antibiótica associadaé um desafio clínico considerável^1,2,3. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas é uma prioridade alta. Uma estratégia de tratamento promissora para patógenos gram-positivos está inibindo a síntese de ácidos graxos, uma exigência para a produção de fosfolipídios de membrana que, em S. aureus, inclui fosfatidilglicerol (PG), lysyl-PG e cardiolipina⁴. Em bactérias, a produção de ácidos graxos ocorre através da via de síntese de ácidos graxos II (fasii)⁵, que é consideravelmente diferente da contraparte eucariótica, tornando fasii um alvo atrativo para o desenvolvimento de antibióticos^5,6 . Os nervos inibidores de FASII primeiramente alvo FabI, uma enzima exigida para o alongamento da corrente do carbono do ácido gordo⁷. O inibidor da Fabi Triclosan é amplamente utilizado em bens de consumo e de saúde^8,9. Inibidores adicionais de Fabi estão sendo desenvolvidos por diversas empresas farmacêuticas para o tratamento da infecçãopor S. aureus ^{10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26}. No entanto, muitos patógenos gram-positivos, incluindo S. aureus, são capazes de eliminar os ácidos graxos exógenos para a síntese de fosfolipídios, contornando a inibição do fasii^27,28,29. Assim, o potencial clínico dos inibidores do fasii é debatido devido a lacunas consideráveis em nosso conhecimento sobre as fontes de ácidos graxos hospedeiros e os mecanismos pelos quais os patógenos extraem ácidos graxos do hospedeiro^27,28. Para abordar essas lacunas, desenvolvemos um método de análise lipidomica imparcial para monitorar a incorporação de ácidos graxos exógenos de partículas de lipoproteínas em fosfolipídios de membrana de S. aureus.

Durante a sepse, as partículas de lipoproteínas hospedeiras representam uma fonte potencial de ácidos graxos derivados do hospedeiro dentro da vasculatura, pois a maioria dos ácidos graxos hospedeiros está associada às partículas³⁰. As lipoproteínas consistem em um escudo hidrófilo composto de fosfolipídios e proteínas que envolvem um núcleo hidrofóbico de triglicerídeos e ésteres de colesterol³¹. Quatro classes principais de lipoproteínas--chylomicron, lipoproteína muito de baixa densidade, lipoproteína de alta densidade, e lipoproteína de baixa densidade (LDL)-são produzidos pelo hospedeiro e funcionam como veículos de transporte lipídico, entregando ácidos graxos e colesterol de e para células hospedeiras através da vasculatura. Os LDLs são abundantes em ácidos graxos esterificados, incluindo triglicerídeos e ésteres de colesterol³¹. Nós temos demonstrado previamente que os LDLs humanos altamente purified são uma fonte viável de ácidos gordos exógenos para a síntese do PG, assim fornecendo um mecanismo para o desvio³²do inibidor de fasii. As LDLs humanas purificantes podem ser tecnicamente desafiadoras e demoradas, enquanto as fontes comerciais de LDLs humanas purificadas são proibitivamente caras de usar em uma base rotineira ou para realizar telas bacterianas em grande escala. Para abordar estas limitações, nós modificamos um procedimento para o enriquecimento de LDLs da gema de ovo da galinha, uma fonte rica de partículas do lipoproteína³³. Nós usamos com sucesso a espectrometria maciça unalvejada, de alta resolução/exata e a espectrometria maciça em tandem para monitorar a incorporação de ácidos gordos LDL-derivados humanos na membrana de S. aureus³². Ao contrário dos métodos previamente relatados, esta aproximação pode quantificar isómeros individuais do ácido gordo para cada um dos três tipos estafilocócica principais do fosfolipídeo. O ácido oleico (18:1) é um ácido graxo insaturado presente em todas as partículas de lipoproteínas hospedeiras que é prontamente incorporada aos fosfolipídeos de S. aureus ^29,30,32. S. aureus não é capaz de síntese de ácido oleico²⁹; Portanto, a quantidade de ácido oleico incorporado ao fosfolipídios estabelece a presença de ácidos graxos derivados da lipoproteína hospedeira dentro da membrana estafilocócica²⁹. Estas espécies de fosfolípidos podem ser identificadas pelo método de espectrometria de massas de última geração descrito aqui, oferecendo uma resolução sem precedentes da composição da membrana de S. aureus cultivada na presença de uma fonte de ácidos graxos que provavelmente encontros durante a infecção.

Nota: o seguinte protocolo para enriquecimento de partículas de LDL da gema de ovo de galinha é derivado de Moussa et al. 2002³³.

1. preparação de gema de ovo de galinha para enriquecimento de partículas de LDL

1. Sanitize dois ovos de galinha grandes lavando as conchas com 70% de solução de etanol e deixe secar ao ar.
2. Sanitize o separador de ovo usando 70% solução de etanol e deixe secar ao ar. Prenda o separador de ovos no lábio de uma taça de tamanho médio.
3. Rachar cada ovo individualmente no separador do ovo e permitir que o albume flua no béquer. A gema de ovo intacta será mantida pelo separador.
4. Lave a gema de ovo duas vezes com 30 mL de soro fisiológico tampão de fosfato estéril (PBS) para remover o albúmen residual.
5. Coloque suavemente a gema de ovo no papel de filtro.
6. Perfure a membrana do vitelina com uma ponta estéril da pipeta e drene o índice da membrana em um tubo de centrifugação cônico estéril de 50 ml. Descarte a membrana e o papel de filtro.

2. fraccionamento do plasma contendo LDL da gema de ovo de galinha

1. Adicione aproximadamente dois volumes de 0,17 M de NaCl a pH 7,0 à gema de ovo e misture vigorosamente. Em seguida, misture esta solução a 4 ° c por 60 min.
2. Centrifugue a diluição da gema de ovo a 10 ° c a 10.000 x g durante 45 min. Retire a fração plasmática (sobrenadante) da fração granular (pellet) para um tubo cônica de 50 ml estéril.
3. Repita o passo 2,2.

3. isolação de partículas de LDL do plasma

1. Misture a fração plasmática com 40% de sulfato de amônio (w/v) a 4 ° c por 60 min.
2. Ajuste o pH da fração plasmática com uma solução de NaOH de 420 mM para 8,7.
3. Centrifugue a diluição da gema de ovo a 4 ° c a 10.000 x g durante uma duração de 45 min. Remova a fração amarela do semi-sólido superior na tubulação da diálise do tamanho de pore de 7 kDa. Forneça o quarto na tubulação para permitir que inchar.
4. Dialyze durante a noite a 4 ° c em 3 L de água ultrapura para remover o sulfato de amônio. Agitar suavemente a água usando uma barra de agitação.
5. Transfira a solução diafiltrado em um tubo de centrifugação cônico estéril de 50 ml.
6. Centrifugue a solução a 4 ° c a 10.000 x g durante uma duração de 45 min. Retire cuidadosamente a fração amarela do semi-sólido superior para um tubo estéril e armazene a 4 ° c.

4. avaliação de LDLs de frango como fonte de ácidos graxos

1. Células de subcultura S. aureus em 5 ml de caldo de triptona 1% sem ácidos graxos e incubar durante a noite a 37 ° c com agitação (225 rpm). Para auxotrofos de ácidos graxos, culturas de suplemento com uma fonte de ácidos graxos.
2. Diluir culturas durante a noite para uma densidade óptica (OD) em 600 nm (OD₆₀₀) de 0,1 em 1% de caldo de triptona. Pipeta 50 μL da suspensão da pilha em cada poço de uma placa 96-well do redondo-fundo.
   Nota: ao trabalhar com auxotróficos de ácidos graxos, lave as culturas durante a noite em dois volumes de caldo de triptona e ressuspender em 5 mL de caldo de triptona para limitar o transporte de ácidos graxos antes de determinar o OD da cultura.
3. Para os poços que contenham controles não tratados, adicione 50 μL de caldo de triptona a 1% por poço.
4. Para os poços contendo as suspensões de células experimentais, acrescente 50 μL de caldo de triptona a 1% suplementado com LDL a 10% de gema de ovo, 2 μM de triclosan, ou uma mistura de 10% de LDL e 2 μM de triclosan derivados de gema de ovo.
   Nota: neste ponto, cada poço conterá 100 μL e a concentração final de LDL e triclosan derivados de gema de ovo por poço será de 5% e 1 μM, respectivamente.
5. Medir OD₆₀₀ ao longo do tempo, usando um leitor de microplacas definido em 37 ° c com agitação contínua e linear para monitorar o crescimento.

5. incubação de S. aureus com LDLs para análise lipídica de membrana.

1. Cultura uma colônia isolada em 5 mL de ácido gordo-livre 1% caldo de triptona e incubar durante a noite a 37 ° c com agitação (225 rpm).
2. Diluir as culturas durante a noite 1:100 num balão estéril de 250 mL, contendo 50 mL de caldo de triptona a 1%. Incubar à fase do mid-log (aproximadamente 4 h) em 37 ° c com agitação.
3. Transfira 25 mL de cultura para um tubo de centrífuga estéril de 50 mL e segue as células. Retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet celular em 750 μL de 1% de caldo de triptona.
4. Combine as células ressuscipended e alíquota 300 μL da suspensão celular em um tubo de centrifugação estéril de 1,5 mL.
5. Adicionar LDLs à concentração final desejada e incubar a 37 ° c com agitação (225 rpm) por 4 h.
6. Centrifugue as culturas em 4 ° c em 16.000 x g por uma duração de 2 minutos e lave as pelotas da pilha em dois volumes de PBS estéril a seguir repita.
7. Anote o peso de cada pellet de células molhadas. Encaixe-congele as pelotas da pilha no gelo seco ou no nitrogênio líquido e armazene-o a-80 ° c ou Prossiga diretamente à seção 6.

6. extração de lipídios da membrana de S. aureus

1. Coloque as pelotas de células S. aureus congeladas em gelo seco. Adicione 0,5 mm de óxido de zircônio grânulos em cima de cada célula pellet, usando um volume de grânulos aproximadamente igual ao volume do pellet celular.
   Nota: como uma alternativa a este método de extração lipídica, os pesquisadores podem usar os métodos bem estabelecidos Bligh e Dyer ou Folch para exigentes lipídios de células bacterianas³⁴.
2. Adicionar 740 μL de 75% de metanol (grau HPLC) refrigerados a-80 ° c diretamente às pastilhas celulares.
3. Adicionar 2 μL de 50 μm ácido fosfatidilcolina (preparado em metanol) por 1 mg de células como um padrão interno. Feche o tubo de ensaio e coloque os tubos de centrifugação de 1,5 mL contendo cada amostra numa porta disponível num homogeneizador de tecido Bullet Blender. Homogeneizar as amostras em baixa velocidade, definindo 2-3, por 3 min.
4. Inspecione visualmente as amostras para a homogeneidade. Se houver aglomerações de células visíveis, continue a homogeneização no liquidificador Bullet em incrementos de 2 min.
5. Retire as amostras do Bullet Blender e transfira para uma capa de fumaça química.
6. Adicionar 270 μL de clorofórmio a cada tubo de amostragem. Vórtice as amostras vigorosamente por 30 min.
   Atenção: o clorofórmio é um possível carcinógeno.
7. Centrifugue as amostras em uma centrífuga de bancada por até 30 min a um mínimo de 2.000 x g. Velocidades mais rápidas podem ser usadas com tubos de centrifugação compatíveis e a duração da centrifugação pode ser encurtada para 10 min.
8. Em uma capa de fumaça química, colete o sobrenadante monofásico e transfira para um novo tubo de ensaio, enquanto evita cuidadosamente a pelota da proteína na parte inferior do tubo de extração.
9. Adicione 740 μL de 75% de metanol (grau HPLC) e 270 μL de clorofórmio ao pellet de proteínas e extraia cada amostra como descrito nos passos 6.6-6.8 acima. Combine o sobrenadante da segunda extração com o sobrenadante previamente coletado para cada amostra.
10. Evate os solventes da extração um córrego do gás inerte tal como o nitrogênio ou o Argon, ou o vácuo usando um concentrador da centrifugação (tabela dos materiais).
11. Extratos lipídicos secos de lavagem três vezes com 1,0 mL de solução aquosa de bicarbonato de amônio de 10 mM e resecar as amostras como na etapa 6,10.
12. Ressuscitou os extratos lipídicos secos em um solvente não polar adequado, como isopropanol. Resuspender as amostras utilizando 20 μL por 1 mg de peso das células frescas determinada no passo 5,7 Alternativamente, se o peso das pastilhas celulares for desconhecido, Ressuspender as amostras em 200 μL de isopropanol e proceder à seção 7.

7. análise de perfis lipídicos de S. aureus utilizando espectrometria de massas de alta resolução/exata

1. Antes da realização de uma análise lipídica completa, selecionar amostras de teste representativas do (s) grupo (es) experimental e analisá-las em uma série de fatores de diluição da amostra para determinar as faixas de diluição da amostra nas quais as concentrações totais de lipídios caem dentro da linha linear intervalo de resposta do detector para o espectrómetro de massa, como descrito anteriormente³⁵.
2. Evaporam alíquotas de cada extrato lipídico amostral para serem submetidos à análise lipídica, secando as alíquotas gás inerte ou vácuo em um concentrador centrífugos (tabela de materiais).
3. Ressuspender cada extrato lipídico seco em cromatografia líquida – espectrometria de massas (LC-MS) grau isopropanol: metanol (2:1, v:v) contendo 20 mM de amónio, utilizando volumes equivalentes a um fator de diluição da amostra ideal, conforme determinado na etapa 7,1.
4. Para uma análise lipídica não direcionada, as amostras podem ser introduzidas diretamente na plataforma de espectrometria de massas de alta resolução/precisão sem o uso de cromatografia por injeção de fluxo ou infusão direta de extratos^35,36. Transfira os extratos lipídicos diluídos preparados na etapa 7,3 para um frasco de amostrador automático apropriado ou placa de 96 poços.
5. Para análise baseada em injeção de fluxo, coloque os frascos de amostrador automático em um amostrador automático com controle de temperatura (15 ° c) de um sistema de HPLC capaz de aplicações capilares/de baixo fluxo, como uma HPLC (tabela de materiais) equipada com um fluxo eletrônico sistema de monitoramento de fluxo e dosagem.
6. Encha os reservatórios do solvente da HPLC com isopropanol da classe de LC-MS: metanol (2:1, v:v) que contem o formate do amónio de 20 milímetros.
7. Utilizando o software Agilent Chemstation, Programe o amostrador automático HPLC para realizar injeções de amostra de 5 μL. No menu instrumento , selecione Configurar Injectore digite 5,0 no campo volume de injeção. As unidades são dadas como microlitros. Assegure-se de que a HPLC esteja ajustada ao fluxo isocrática em 1 μl por o minuto de 2:1 (v:v) isopropanol: metanol que contem o formate do amónio de 20 milímetros.
8. No menu de instrumentos do chemstation, selecione Configurar bomba... e, em seguida, selecione o interruptor de alternância do modo de fluxo micro .
9. Nos campos de horário , insira: Time 0, 0, 100% B, Flow 1,0. Aperte Enter e crie uma segunda linha no cronograma inserindo time 10,0, 100% B, Flow 1,0. Selecione o botão OK na parte inferior do menu da bomba configurada . Essas configurações habilitará 10 execuções analíticas a uma taxa de fluxo de 1,0 μL por minuto.
10. Introduza o eluído da linha de transferência do HPLC ao espectrómetro maciço usando uma fonte da ionização do electrospray cabida com uma agulha do metal do baixo-fluxo (34 G).
11. Usando o software de controle de instrumentos Thermo Tune Plus, selecione o menu de configuração e selecione fonte de ESI aquecida. Defina a voltagem de ionização para 4000 V e o gás da bainha para 5 (unidades arbitrárias) digitando esses valores nos campos correspondentes da caixa de diálogo. Similarmente, ajuste o temp capilar a 150 ° c e a S-lente a 50%.
    Observação: esses valores precisam ser otimizados para cada plataforma de espectrometria de massa.
12. Para análise lipídica não direcionada, use uma plataforma de MS maciça de alta resolução/precisão (tabela de materiais) como o detector.
13. Usando o software Thermo Tune Plus, clique no botão definir digitalização e, no menu analisador , selecione FTMs. Defina o campo intervalo de massa como normal e, no campo resolução , selecione 100.000. Verifique se o tipo de digitalização está definido como completo. No menu intervalos de digitalização , insira 200 no primeiro campo de massa (m/z) e insira 2000 no último campo de massa (m/z).
14. Certifique-se de que a polaridade negativa é utilizada para detectar os lipídios S. aureus mais abundantes.
15. Repita a análise da amostra usando o mapeamento de íons em tandem espectrometria de massas (MS/MS) fragmentação de todos os íons lipídicos dentro de uma região espectral de interesse, a fim de confirmar estruturas lipídicas e constituintes de ácidos graxos. Alternativamente, os íons lipídicos selecionados de interesse podem ser submetidos à análise de MS/MS após as identificações iniciais de lipídios terem sido atribuídas na seção 8.

8. pesquisa da base de dados para identificar S. aureus endógenos e os lipídios LDL-derivados exógenos

1. Use o software Thermo Xcalibur para refinar ainda mais a precisão da massa observada. No Xcalibur, no menu ferramentas , selecione o Recalibrate offline. Depois que a janela Recalibrate offline for aberta, carregue o arquivo de espectro de massa para ser recalibrado selecionando o menu arquivo e selecionando a opção abrir .
2. Abra o arquivo de interesse, alterne o botão Inserir linha na parte superior da janela de exibição, para exibir o cromatograma de íons total para a execução de MS. Média dos sinais de MS adquiridos clicando com o botão esquerdo do mouse em uma borda do pico de sinal observado no cromatograma de íons total e arrastando o mouse pela parte mais ampla do pico.
3. No menu filtro de digitalização , selecione o filtro correspondente aos dados de verificação completa do MS. Carregue um arquivo de referência contendo as massas teóricas monoisotópicas de pelo menos três lipídios endógenos conhecidos de S. aureus selecionando o botão Load ref... e selecionando o arquivo de referência. Verifique a caixa de uso ao lado de cada massa monoisotópica lipídica.
4. Clique no botão Pesquisar na parte inferior da janela de visualização. Re-Average o sinal do MS através do pico do sinal no cromatograma total do íon como feito previamente.
5. Clique no botão converter perto da parte inferior da janela de visualização. Quando a caixa de diálogo converter for aberta, clique em OK. Omitir esta etapa se os dados foram coletados em plataformas de espectrometria de massa de fornecedores que não sejam a thermo Scientific.
6. Usando o software Xcalibur, exporte as listas de pico de massa precisas recalibradas para cada amostra não tratada ou tratada com LDL para separar planilhas de um arquivo do Excel. Selecione o ícone do navegador de qual . Abra o arquivo recalibrado de interesse, selecionando o menu arquivo e selecionando a opção abrir.. . .
7. Média do sinal através do pico largo no cromatograma de íon total como descrito na etapa 8,2.
8. Clique com o botão direito no ícone de Thumbtack na janela de visualização do espectro de massa e selecione Ver | Lista de espectro. No mesmo menu, selecione Opções de exibição e, em seguida, todos os picos caixa de alternância no menu Exibir . Clique no botão OK para fechar a janela de visualização.
9. Botão direito do mouse no ícone de Thumbtack na janela de visualização de espectro de massa novamente e selecione o Export | Área de transferência (massa exata). Cole a célula de dados exportados a1 da primeira planilha em uma nova planilha do Excel.
10. Exclua as primeiras 8 linhas de texto no arquivo de dados exportado, de forma que a célula a1 da planilha do Excel contenha o primeiro ponto de dados em massa do espectro de massa. Repita a exportação de cada arquivo MS recalibrado, usando uma nova planilha no arquivo do Excel para cada lista de pico exportado.
11. Usando o software de análise de massa espectral de lipídios (LIMSA)³⁷ Add-in para o Excel, construa um banco de dados contendo fórmulas moleculares de espécies de lipídios de S. aureus conhecidas, conforme descrito por Hewelt-belka et al. 2014³⁸, bem como fórmulas que representam espécies lipídicas que poderiam hipoteticamente estar presentes no LDL.
    Nota: Adicionalmente, deve-se tomar cuidado para incluir fórmulas moleculares potenciais na base de dados para os lipídios bacterianos hipotéticos que incorporaram os principais ácidos graxos LDL, como os ácidos graxos oleico (18:1) e linoleico (18:2)³².
12. Para construir o banco de dados, abra uma planilha do Excel em branco. Na célula a1 da primeira planilha, digite a massa monoisotópica teórica/computada das espécies lipídicas a serem adicionadas ao banco de dados, correspondendo à massa das espécies lipídicas no estado iônico observado no Espectrómetro de massas. Na célula B1, insira um nome para as espécies lipídicas, como PG (34:0).
13. Na célula C1, entrar a fórmula molecular para as espécies lipídicas, correspondendo ao estado iônico do lipídio observado no Espectrómetro de massa. Na célula D1, entrar a carga da espécie lipídica, como observado no Espectrómetro de massa. Mova para a célula A2 para iniciar uma nova entrada para a próxima espécie lipídica a ser inserida no banco de dados pesquisável.
14. Repita as etapas 8,12 e 8,13 até que todas as espécies de lipídios desejadas tenham sido inseridas no banco de dados. Salve o arquivo de banco de dados e deixe-o aberto no Excel.
15. No Excel, selecione o menu Add-ins no. Selecione limsa para iniciar o software limsa. No menu principal, clique no botão biblioteca composta. ... Na nova janela que aparece, clique em importar compostos. Isso carregará o banco de dados composto para uso pelo software LIMSA.
16. Realize identificações de lipídios com base em massa exata em todos os espectros MS usando o software LIMSA Add-in para Excel de acordo com as instruções do fornecedor³⁵. No menu principal do LIMSA, selecione lista de picos no menu tipo de espectro . Selecione modo positivo ou modo negativo para corresponder com a polaridade na qual os dados de MS foram adquiridos.
17. Na janela de pico FWHM (m/z) , insira a janela de pesquisa em massa desejada para encontrar o pico. Uma janela de pesquisa de tolerância maciça de 0,003-0,005 m/z é recomendada para dados de MS em massa de alta resolução/precisos.
18. Na janela de sensibilidade , insira o corte de linha de base desejado (por exemplo, 0, 1% de abundância relativa). No menu de correção de isótopos , selecione ajuste linear ou subtrair algoritmos, um dos quais pode ser usado com dados de lista de pico.
19. Realce compostos lipídicos para incluir na pesquisa de banco de dados clicando em espécies lipídicas desejadas dentro da janela de compostos disponíveis . Clique no botão Adicionar para adicionar espécies de lipídios destacadas ao grupo de pesquisa.
20. Definir padrões internos clicando em compostos adicionados, em seguida, alterando a janela de concentração para a concentração correspondente do padrão interno selecionado.
21. Assegure-se de que o padrão interno e as espécies de lipídios selecionadas a serem quantificadas pertençam ao mesmo nome de classe selecionando cada espécie lipídica adicionada e padrão interno e digitando um nome de classe (como PG ou lipídio) no campo classe.
22. Para salvar o grupo pesquisável de compostos lipídicos para uso futuro, clique no botão salvar ao lado do menu grupos .
23. Certifique-se de que o arquivo do Excel que contém todas as listas de pico de MS exportadas esteja aberto à folha correspondente à primeira execução de S. aureus MS e clique no botão Pesquisar no menu principal do limsa.
    Observação: a saída da pesquisa de banco de dados LIMSA incluirá uma lista de recursos espectrais de massa combinados com lipídios presentes no banco de dados construídos nas etapas 8.13, bem como concentrações para cada recurso correspondente após a normalização para um ou mais selecionados normas internas.
24. Use o software Xcalibur para examinar espectros de MS/MS em massa precisos para m/z correspondendo a íons lipídicos de interesse, a fim de confirmar os constituintes de ácidos graxos presentes em cada espécie molecular lipídica identificada. Selecione o ícone do navegador de qual . Abra o arquivo MS/MS de interesse selecionando o menu suspenso arquivo e selecionando a opção abrir... .
25. Selecione o filtro de digitalização correspondente à análise MS/MS de um lipídio m/z de juros, clicando com o botão direito do mouse no ícone de Thumbtack na janela de visualização do espectro de massa e selecione intervalos no menu. Na nova janela exibida, selecione o menu filtro para selecionar a digitalização.
26. Média do sinal através do cromatograma de íons total conforme descrito na etapa 8,2. Use o software MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) para realizar testes estatísticos apropriados. Avalie a diferença estatisticamente significante na composição lipídica de S. aureus comparando as abundâncias de lipídios normalizadas em condições tratadas e com LDL tratada.

O protocolo para o enriquecimento de LDL da gema de ovo de galinha é ilustrado na Figura 1. Este processo começa por diluir a gema de ovo inteira com soro fisiológico e separar os sólidos de gema de ovo referidos como grânulos da fração solúvel ou plasmática contendo os LDLs (Figura 1)33. O teor de LDL da fração plasmática é ainda mais enriquecido pela precipitação do ~ 30-40 kDa β-livetins (Figura 2)33. A presença de bandas proteicas em 140, 80, 65, 60 e 15 kDa correlacionou-se com as apóproteínas de LDLs (Figura 2)33,39. O tratamento com triclosan inibe o crescimento de S. aureus em meios livres de ácidos graxos32. Já demonstramos que a suplementação de culturas com plasma de gema de ovo ou LDLs humanas purificadas como fontes de ácidos graxos exógenos supera a inibição do crescimento induzido por triclosan (Figura 3)32. Da mesma forma, a suplementação de culturas tratadas com triclosan com o LDL enriquecido de gema de ovo restaura o crescimento (Figura 3). Além disso, a adição de LDLs de gema de ovo suporta o crescimento de um auxotroph de ácidos graxos de S. aureus previamente caracterizado (figura 4)32. Para o perfilamento de massa mais preciso com base em espectrometria de S. aureus incorporação de ácidos graxos exógenos, é importante limitar a presença de ácidos graxos livres no meio de crescimento. A composição de ácidos graxos livres de 1% de caldo de triptona e LMR de gema de ovo de galinha diluída em caldo de triptona foi determinada empregando-Se espectrometria de massa de alta resolução/precisão de fluxo e encontrou quantidades mínimas de ácidos graxos livres (Figura 5). A mesma análise de espectrometria de massas não direcionada foi realizada para determinar a composição de ácidos graxos de Fosfolipídeos de S. aureus após exposição a LDLs de gema de ovo de galinha. análise discriminante de mínimos quadrados ortogonais parciais (opls-DA)40 de Fosfolipídeos de membrana S. aureus abundantes demonstraram separação clara da classe de condições tratadas com a gema de ovo não tratada e de frango, como mostrado no gráfico de escores opls-da (Figura 6a). O lote de cargas OPLS-DA indicou numerosas espécies de fosfatidilgliceróis como variáveis importantes no modelo PLS-DA. Notavelmente, os fosfolipídios contendo ácidos graxos insaturados, um marcador molecular de incorporação de ácidos graxos exógenos, são enriquecidos nas culturas suplementadas com LDL, em comparação com as células incubados na ausência de LDLs (Figura 6B). Estudos prévios descobriram que as gemas de ovos de frango são uma fonte rica de ácidos graxos insaturados com ácido oleico (18:1) sendo a mais abundante41,42. De acordo com essas observações, encontramos o ácido oleico como o ácido graxo mais comum utilizado para a síntese de fosfolipídios quando as culturas de S. aureus foram suplementadas com LDLs de gema de ovo de galinha (Figura 6C). A tabela 1 ilustra ainda que os perfis de ácidos graxos dos fosfolipídios da membrana são alterados quando S. aureus é cultivado na presença de gema de ovo LDL.

Figura 1: uma ilustração do enriquecimento de LDL da gema de ovo da galinha que utiliza a centrifugação e a precipitação do sulfato da amônia. (A) os reagentes necessários para o enriquecimento de LDL da gema de ovo de galinha. (B) o fluxograma retrata as etapas significativas do processo de enriquecimento de LDL. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: perfil proteico da gema de ovo de galinha antes e após o enriquecimento para LDL. Os lisados proteicos foram preparados com tampão RIPA. O lisado da proteína (15 μg) foi carregado em um gel de SDS-PAGE do acrilamida de 8%. Os géis foram manchados durante a noite com Bio Rad protein reagente. Os pesos moleculares em kDa de proteínas associadas ao LDL são denotados ao longo do lado direito da imagem. M: marcador da proteína, Y: gema de ovo da galinha, e LDL: o enriquecimento do LDL do gema de ovo da galinha estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: os LDLs derivados de gema de ovo protegem S. aureus da inibição do fasii induzida por triclosan. O crescimento de S. aureus foi monitorado ao longo do tempo através da medição de OD600 em caldo de tryptona 1% nas seguintes condições: 1% de caldo de TRIPTONA (TB), 1 μm de triclosan (TCS), 1 μm de triclosan com 1% de plasma de gema de ovo (TCS + EYP), 5% de gema de ovo Triclosan com 5% de gema de ovo LDL (TCS + LDL). A média de três experimentos independentes é mostrada. As barras de erro representam o desvio padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: crescimento de um S. o auxotroph de ácidos graxos aureus é apoiado pelo LDL derivado de gema de ovo. O crescimento de um auxotroph de ácidos graxos em 1% de caldo de triptona (TB) com ou sem suplementação de 5% de LDL de gema de ovo (LDL) foi monitorado ao longo do tempo através da mensuração de OD600. A média de três experimentos independentes é mostrada. As barras de erro representam o desvio padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: teor de ácidos graxos livres medidos em 1% de caldo de triptona ou de gema de ovo de galinha LDL. Ácidos graxos livres foram detectados por injeção de fluxo de alta resolução/espectrometria de massa exata e espectrometria de massas em tandem. O número normalizado de íons por mg de proteína foi determinado para 1% de caldo de triptona e 1% de caldo de triptona suplementado com 5% de ovo de galinha LDLs. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: as lipoproteínas de baixa densidade da gema de ovo de galinha são um reservatório de ácidos graxos exógenos para síntese de fosfatidilglicerol de S. aureus . (A) gráfico de escores de análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais de Fosfolipídeos de membrana de S. aureus tratados com LDL e sem tratamento, identificados por espectrometria de massas de alta resolução/precisão. (B) percentagem de fosfatidilglicerol insaturado (UPG) em comparação com a membrana total PG de S. aureus CULTIVADA na ausência (WT) ou presença (WT + LDL) de LDLs de gema de ovo de galinha. (C) perfil de ácidos graxos insaturados (Ufa) de membrana PG de S. aureus cultivado sem (WT) ou com (WT + LDL) de ovo de galinha LDLs de gema grafado como uma percentagem da quantidade de ácidos graxos PG totais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: perfil de ácidos graxos de S. aureus cultivado na presença de LDLs de gema de ovo de galinha. Utilizamos uma análise lipidomica imparcial, utilizando MS e MS/MS de alta resolução/precisão para determinar o perfil de ácidos graxos de s. aureus PG. s. aureus foi incubada na presença ou ausência de LDLs de gema de ovo de galinha, e o perfil PG destes as pilhas foram comparadas àquela das pilhas cultivadas no caldo de triptona de 1%.

Os autores não têm divulgações.