Este método fornece um quadro para estudar a incorporação de ácidos graxos exógenos de fontes hospedeiras complexas em membranas bacterianas, particularmente Staphylococcus aureus. Para conseguir isto, os protocolos para o enriquecimento de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha e do perfil de ácido gordo subseqüente de fosfolipídios bacterianos que utilizam a espectrometria maciça são descritos.
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Artigo de método
Isolação de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha para o estudo da incorporação do ácido gordo do micróbio patogénico bacteriano em phospholipids da membrana
Neste artigo
Resumo
Resumo
Staphylococcus aureus e outros patógenos gram-positivos incorporam ácidos graxos do ambiente em fosfolipídios de membrana. Durante a infecção, a maioria dos ácidos graxos exógenos estão presentes dentro de partículas de lipoproteínas hospedeiras. A incerteza permanece quanto aos reservatórios de ácidos graxos hospedeiros e os mecanismos pelos quais as bactérias extraem ácidos graxos das partículas de lipoproteínas. Neste trabalho, descrevemos protocolos de enriquecimento de partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) da gema de ovo de frango e determinando se os LDLs servem como reservatórios de ácidos graxos para S. aureus. Este método explora análise lipidomica imparcial e LDLs de frango, um modelo eficaz e econômico para a exploração de interações entre LDLs e bactérias. A análise da integração de S. aureus de ácidos graxos exógenos de LDLs é realizada utilizando espectrometria de massas de alta resolução/acurada e espectrometria de massas em tandem, possibilitando a caracterização da composição de ácidos graxos da bactéria membrana e identificação imparcial de combinações novas de ácidos gordos que se levantam em lipídios bacterianos da membrana em cima da exposição aos LDLs. Estas técnicas avançadas da espectrometria maciça oferecem uma perspectiva incomparável da incorporação do ácido gordo revelando os ácidos gordos exógenos específicos incorporados nos phospholipids. Os métodos aqui descritos são adaptáveis ao estudo de outros patógenos bacterianos e fontes alternativas de ácidos graxos complexos.
Introdução
S. aureus resistente à meticilina (MRSA) é a principal causa de infecção associada à saúde e a resistência antibiótica associadaé um desafio clínico considerável1,2,3. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas é uma prioridade alta. Uma estratégia de tratamento promissora para patógenos gram-positivos está inibindo a síntese de ácidos graxos, uma exigência para a produção de fosfolipídios de membrana que, em S. aureus, inclui fosfatidilglicerol (PG), lysyl-PG e cardiolipina4. Em bactérias, a produção de ácidos grax....
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Protocolo
Nota: o seguinte protocolo para enriquecimento de partículas de LDL da gema de ovo de galinha é derivado de Moussa et al. 200233.
1. preparação de gema de ovo de galinha para enriquecimento de partículas de LDL
- Sanitize dois ovos de galinha grandes lavando as conchas com 70% de solução de etanol e deixe secar ao ar.
- Sanitize o separador de ovo usando 70% solução de etanol e deixe secar ao ar. Prenda o separador de ovos no lábio de uma taça de tamanho médio.
- Rachar cada ovo individualmente no separador do ovo e permitir que o albume flua no béquer. A gema de ovo intacta será mantida pelo ....
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Resultados
O protocolo para o enriquecimento de LDL da gema de ovo de galinha é ilustrado na Figura 1. Este processo começa por diluir a gema de ovo inteira com soro fisiológico e separar os sólidos de gema de ovo referidos como grânulos da fração solúvel ou plasmática contendo os LDLs (Figura 1)33. O teor de LDL da fração plasmática é ainda mais enriquecido pela precipitação do ~ 30-40 kDa β-livetins (
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Discussão
S. aureus incorpora ácidos graxos exógenos em seus fosfolipídios de membrana27,32,43. A síntese de fosfolipídios usando ácidos graxos exógenos ignora a inibição do fasii, mas também altera as propriedades biofísicas da membrana27,32,44. Embora a incorporação de ácidos graxos exógenos em fosfolipídios de patógenos gram-positivos.......
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Divulgações
Os autores não têm divulgações.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros do laboratório Hammer por sua avaliação crítica do manuscrito e apoio deste trabalho. Dr. Alex Horswill da Universidade de Colorado School of Medicine gentilmente forneceu AH1263. Dr. Chris Waters laboratório na Universidade Estadual de Michigan forneceu reagentes. Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association Grant 16SDG30170026 e os fundos de arranque fornecem pela Universidade Estadual de Michigan.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sulfato de amônio | Fisher | BP212R-1 | ≥ 99,5% puro |
| Incubadora de cultura celular | Thermo | MaxQ 6000 | |
| Centrafuge | Thermo | 75-217-420 | Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE |
| Placa de ensaio Costar | Corning | 3788 | 96 poços |
| Papel de filtro | Schleicher & Schuell | 597 | |
| Ovo de galinha grande | N/A | N/A | Ovo comprado em loja comum |
| Espectrofotômetro de microplacas | BioTek | Epoch 2 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| S. aureus cepa AH1263 | N/A | N/A | Fornecido por Alex Horswill da Universidade do Colorado |
| Tubo de diálise | Pierce | 68700 | 7.000 MWCO |
| Tryptone | Becton, Dickison and Company | 211705 | |
| grânulos de óxido de zircônio de 0,5 mm | Next Advance | ZROB05 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24B | |
| Metanol (grau LC-MS) | Fisher | A4561 | |
| Clorofórmio (grau reagente) | Fisher | MCX10559 | |
| Isopropanol (grau LC-MS) | Fisher | A4611 | |
| Dimyristoyl fosfatidilcolina | Avanti Lipídios Polares | 850345C-25mg | |
| Bicarbonato de amônio | Sigma | 9830 | ≥ Software puro |
| de | Sigma | 70221-25G-F | |
| Thermo Scientific | OPTON-30801 | ||
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Scientific | de alta resolução/massa exata MS | |
| Agilent 1260 HPLC capilar | Concentradores | ||
| SpeedVac | Thermo Scientific |
Referências
- Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
- Noskin, G. A., et al.
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Reimpressões e permissões
