Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo

As defesas imunes inatas formam a primeira linha de defesa contra micróbios patogênicos. Estas respostas podem ser funcionalmente divididas em imunidade humoral e celular inata, ambos os quais são mediados por receptores de reconhecimento padrão germline codificado (PRRs) que detetam o patógeno associado padrões moleculares (PAMPs)¹. Muitas das vias de sinalização e mecanismos efetores da imunidade inata são conservados em mamíferos e invertebrados, como o nematódeo, Caenorhabditis elegans e a mosca da fruta, Drosophila melanogaster². A mosca de fruta tem emergido como um poderoso sistema para estudar a defesa do hospedeiro contra microorganismos infecciosos³. Drosófila é geneticamente tractable, fácil e barata, criados em laboratórios e tem um tempo de geração curto. Além disso, a mosca da fruta apresenta defesas altamente eficientes contra uma matriz de micróbios, permitindo que o exame da imunidade do hospedeiro contra patógenos virais, bacterianas, fúngicas ou parasitárias.

Drosófila imunologistas historicamente utilizaram telas genéticas para a frente, todo o genoma mediada por RNA interferência (RNAi seleção de linhas de células de inseto e pré-existentes cepas moscas mutantes para examinar a imunidade inata – levando à) identificação e caracterização de vários caminhos imune humoral evolutivamente conservada^4,5,6,7,8. A resposta imune inata humoral é, sem dúvida, o melhor caracterizada a defesa imunológica em moscas de fruta. Após a infecção, a resposta humoral leva para a produção e liberação sistêmica de peptídeo antimicrobiano moléculas (AMP) para a hemolinfa, o sangue equivalente em insetos. Amplificadores são produzidos pelo pedágio altamente conservado e Imd vias de sinalização. O pathway pedágio é homólogo de mamíferos receptor TLR/IL-1R sinalização e via Imd é homóloga à sinalização de mamíferos de fator de necrose tumoral-alfa. No pedágio da drosófila, sinalização é induzida por bactérias gram-positivas, fungos e Drosophila X virus^6,9,10 e Imd sinalização é induzida por bactérias Gram-negativas^{11 ,12}.

Imunidade celular, composta de encapsulamento, melanização e fagocitose de patógenos invasivos, realizada por células especializadas de sangue chamadas de hemócitos¹³. Existem três classes de hemócitos na mosca da fruta: cristal células, lamellocytes e plasmatocytes¹³. Pilhas de cristal, que compõem 5% dos hemócitos circulantes em larvas, liberam enzimas proPhenoloxidase (proPO) levando a melanização de agentes patogénicos e tecidos do hospedeiro em locais da ferida. Lamellocytes, que normalmente não são encontrados em embriões saudáveis ou larvas, são células aderentes que encapsulam objetos estranhos. Estas células são induzidas mediante pupariation ou quando parasitam ovos de Vespa são depositados em larvas. Plasmatocytes fagocíticas, que compõem 95% da circulação hemócitos em larvas e todos os restantes hemócitos em adultos, desempenhar um papel no tecido remodelação durante o desenvolvimento e, nomeadamente, servir como a célula principais efetoras da imunidade celular de Drosophila .

Fagocitose uma linha imediata e crucial de defesa imune inata; micróbios que quebrou a barreira epitelial do hospedeiro são rapidamente tragados e eliminados por células fagocíticas (para uma revisão abrangente da biologia das células de fagocitose consulte referência ¹⁴). Esse processo é iniciado quando o reconhecimento de padrões codificados germline receptores (PRRs) sobre hemócitos reconhecem patógenos associados a padrões moleculares (PAMPs) de micróbios. Uma vez acoplado para seus destinos, PRRs iniciem cascatas de sinalização que levam à formação de pseudopods através da remodelação de citoesqueleto de actina. Os pseudopods cercam o micróbio, que posteriormente é engolido e interiorizado em uma organela nascente, o fagossomo. Os micróbios são destruídos como o fagossoma sofre o processo de maturação do fagossoma quando o fagossoma é traficado para o interior do hematócito e acidifica através de uma série de interações com lisossomos. Em vitro e célula de estudos de biologia em células de mamíferos primária têm sido fundamentais para identificar e caracterizar os fatores que regulam a fagocitose, como os mamíferos do Fc-gama e C3b receptores^15,16. No entanto, a capacidade de executar telas em grande escala ou estudos in vivo são limitadas nos sistemas dos mamíferos.

Aqui nós apresentamos um ensaio in vivo para fagocitose em adultos de moscas de fruta, que é baseado em um procedimento introduzido pelo laboratório de David Schneider em 2000¹⁷. O laboratório de Schneider mostrou que sessile hemócitos agrupados ao longo do vaso dorsal abdominal prontamente fagocitam bactérias e esferas de poliestireno. Para visualizar a fagocitose, moscas são injetadas com partículas fluorescente etiquetadas (tais como Escherichia coli rotulado com isotiocianato de fluoresceína (e. coli -FITC)), incubadas durante 30 minutos para permitir que o tempo de hemócitos engolir as partículas e então injetado com trypan azul, que sacia a fluorescência de partículas não fagocitados durante o período de incubação. Voar vasos dorsais são então fotografados usando um microscópio fluorescente invertido. Este trabalho seminal, utilizar um experimento relativamente simples, demonstrado que hemócitos fagocitam bactérias e grânulos de látex, a fagocitose bacteriana podem ser inibidos pela pre-injeção de moscas com grânulos de látex, e que voa sem celular e humoral respostas imunes são suscetíveis nem de Escherichia coli. O ensaio apresentado neste relatório baseia-se o trabalho do laboratório Schneider para quantificar a fagocitose in vivo medindo a intensidade da fluorescência das partículas tragado por hemócitos vaso dorsal associado.

Semelhante à abordagem tomada nos sistemas dos mamíferos, Drosophila geneticistas inicialmente usado todo o genoma in vitro RNAi telas para identificar genes necessários para a resposta imune celular^{18,19,20 ,21,22,23}. No entanto, o desenvolvimento do ensaio fagocitose in vivo adulto habilitado experimentos de acompanhamento a efectuar facilmente em animais inteiros, permitindo assim que os investigadores para verificar o biológico o papel dos factores identificados em estudos in vitro. Tal foi o caso com o receptor do transmembrane comedor, que foi identificada pela primeira vez como um receptor bacteriano em uma tela de RNAi usando S2 células²⁴ e então mais tarde mostrada para mediar a Escherichia coli (e. coli),, Enterococcus faecalis, e fagocitose de Staphylococcus aureus (S. aureus) em adultos²⁵.

Nosso laboratório empregou o ensaio in vivo de fagocitose em telas de genéticas para a frente e estudos de associação de genoma-largo (usando o painel de referência genética drosófila (DGRP)) para identificar novos genes que regulam a fagocitose de hemócitos adultos. Estes estudos levaram à caracterização os receptores PGRP-SC1A e PGRP-SA²⁶, a vesícula intracelular tráfico de proteína Rab14²⁷, o glutamato transportador Polifemo²⁸e RNA-proteína obrigatória Fox-1²⁹.

Nós antecipamos que futuras telas incorporando a fagocitose in vivo podem levar à identificação de genes adicionais que são importantes para a resposta imune celular em Drosophila. Telas usando linhas puras totalmente sequenciado, tais como o DGRP ou a drosófila sintético população recurso (DSPR), podem identificar variantes naturais que afectam a fagocitose ou hematócito desenvolvimento. Além disso, a técnica poderia ser adotada em outras espécies de Drosophila ou usada para recursos da comunidade nova tela, como a coleção de 250 espécies de Drosophila , mantido pelo nacional drosófila espécie Stock Center (NDSSC ) em Cornell. Estas experiências podem ser realizadas usando fluorescente-etiquetadas bacteriana ou fúngica-parede bioparticles que estão disponíveis comercialmente, ou podem ser realizadas usando qualquer número de espécies bacterianas ou fúngicas – desde que o micróbio expressa marcadores fluorescentes .

1. prepare as partículas de fluoresceína para injeção

1. Reconstituir a 10 mg de disponíveis comercialmente, calor-matou as bactérias partículas marcadas com fluoresceína (ver Tabela de materiais) a uma concentração das ações de 10 mg/mL, adicionando 990 µ l estéril 1X PBS e 10 µ l 50 milímetros de azida de sódio. Vórtice de misturar.
   1. Divida em 8 alíquotas de µ l descartáveis em tubos de 0,2 mL e armazenar em uma caixa escura a 4 ° C para minimizar a sensibilidade associada à luz.
      Nota: Azida de sódio conservante é opcional e pode ser omitida se a existências de 10mg/mL são feitas com 1 mL estéril 1X PBS, aliquotadas e armazenado a-20 ° C.
2. Fazer uma solução de 5% corante em 1X PBS misturando 500 µ l seringa filtrada alimento verde para colorir e 9,5 mL estéril 1X PBS 10 mL.
3. Lave as partículas antes da injeção para remover a azida de sódio. Mix 42 µ l estéril 1 x PBS e 8 µ l de 10 mg/mL em um tubo de 1,7 mL. Centrifugar a velocidade máxima de 2,5 min à temperatura ambiente.
   1. Remover o sobrenadante, adicionar 50 µ l 1 x PBS e centrifugar a velocidade máxima para 2,5 min à temperatura ambiente.
   2. Repita as etapas de 1.3 e 1.3.1 x 2, para um total de 3 lavagens.
   3. Após a última lavagem, desprezar o sobrenadante e ressuspender as partículas a 1,6 mg/mL em 50 µ l de corante de 5% em PBS 1x.
   4. Enrole o tubo em papel alumínio para proteger da luz. Armazenar a 4 ° C, descarte após 1 semana.

2. preparar a estação de injeção e moscas

1. Prepare a almofada de injeção. Para injetar até 4 genótipos de moscas ao mesmo tempo, uso fita de laboratório para dividir uma retangular CO₂ mosca almofada em 4 seções. No banco perto do microscópio, designe áreas para colocar os frascos, uma vez que foram chamadas moscas no teclado (um para cada canto da almofada).
2. Preparar frascos de idade correspondente, 4-7 dias-velhas, moscas para injeção. Para cada tensão a ser testado, transferir 5 machos e 5 fêmeas para um tubo de fresco, etiquetado de alimentos preparados voar e manter a 25 ° C.
3. Preparar o injetor pneumático (veja a Tabela de materiais), definindo o instrumento para um modo de temporizado 100 ms (rajadas curtas de pressão do gás para expulsar o líquido – permitindo a entrega de volumes de subnanolitros).
4. Prepare as lâminas de microscópio. Cortadas tiras de 1,5 polegadas de fita isolante, dobre em forma de laço com o lado adesivo para fora e coloque numa lâmina de microscópio rotulada.

3. prepare agulhas capilar de vidro

1. Puxe o vidro agulhas (capilares de vidro de parede fina) usando um extrator de agulha.
   1. Segure a agulha sob o microscópio com um micrômetro e quebrar a ponta usando #5 pinças de aço inoxidável de ponta fina. 100 µm dicas são suficientes para furar a cutícula da mosca, minimizando ferindo.
   2. Medir o volume de líquido que será injetado em cada mosca. Carregar a agulha estéril 5% corante em PBS 1x e expelir o líquido sobre uma gota de óleo mineral em um micrômetro de palco de 0.01 mm.
      Nota: Se a gota de líquido é esférica, o volume em picoliters é calculado como (tamanho)³/1910. ³⁰ uma agulha com um diâmetro de 100 µm ejetará ~ 2 nL em 100 ms.

4. injetar moscas

1. Pipete 10 µ l de partículas de 1,6 mg/mL em uma pequena praça de parafilme.
   1. Puxar o líquido para a agulha e montar no bico injetor (ver Tabela de materiais).
   2. Anestesiar moscas com CO₂ e alinhá-las em sua área designada no flypad, com o lado ventral para cima e as cabeças voltadas para a frente da almofada. Colocar os frascos em áreas correspondentes no banco.
   3. Injete moscas no canto superior do abdómen com 5, bombas de 100 ms do líquido (total de ~ 10 nL).
   4. Transferir as moscas injetadas para os frascos apropriados, observe o tempo no rótulo do frasco. Manter a 25 ° C.
2. Carregar uma nova agulha com 0,4% solução de azul de Tripan.
3. Defina o injetor pneumático para GATED, que permite um fluxo constante de ar para empurrar o líquido fora a agulha.
4. Anestesiar moscas depois de eles tem descansado por 30 min e injetar com Trypan azul até o abdômen distendido e completo.
   Nota: Ao examinar a maturação do fagossoma com partículas rotuladas com um corante sensíveis ao pH, permitir moscas descansar por 1 h e não injetar com trypan azul antes de moscas de montagem.
5. Monte voa em corrediças do microscópio com fita isolante, lado ventral para baixo. Empurre as asas para o lado da mosca e fixe-os com a fita. Também, empurre suavemente a cabeça para a fita para garantir que a mosca não se moverá.
6. Afastar-se imediatamente para a etapa 5.

5. imagem de moscas

1. Imagem voa, um de cada vez, no x 25 ou 32 ampliação de x usando um microscópio de fluorescência invertido ligado a uma câmera digital e computador (consulte a Tabela de materiais). Focar o vaso dorsal da mosca usando software de computador para a câmera digital.
2. Registre o tempo de exposição e ampliação entre experiências.
   Nota: Perder a noção de genótipos é uma potencial fonte de erro quando fotografar estirpes múltiplas em uma única sessão. Para evitar moscas de tachar, anote o número de imagem da primeira e última fotografia voar para cada genótipo.

6. quantificar e normalizando a fluorescência

1. Abra o software e abra uma imagem de cada vez.
   1. Medir a intensidade da fluorescência do vaso dorsal. Desenhe um polígono ao redor do vaso dorsal. Selecione a medida e registro da intensidade de fluorescência dentro do polígono.
   2. Determine a intensidade de fluorescência do fundo. Copie o primeiro polígono e movê-lo para uma área adjacente ao vaso dorsal da mosca. Selecione a medida e intensidade de fluorescência registro da área de plano de fundo.
   3. Normalize a fluorescência de vaso dorsal por fluorescência do fundo:
      Fundo de ÷ vaso dorsal.
   4. Calcule que a média normalizada a intensidade de fluorescência vaso dorsal de todas as moscas em uma cepa.
   5. Repita a experiência 2 vezes mais.
   6. Uso um estudante está pareado t-teste para comparar as intensidades de fluorescência relativa média de controle de moscas e testar voa das experiências de três. Calcular o tamanho de efeito usando a fórmula: Cohen d = (₁M - M₂) ÷ SD_{em pool}, onde M₁ é a média do genótipo 1 e M₂ é a média de genótipo 2 &
      SD _{em pool} =
      onde SD1 é o desvio padrão de genótipo 1 e SD2 é o desvio padrão de genótipo 2.

Um esquema do ensaio in vivo de fagocitose partículas de fluoresceína-etiquetado é mostrado na figura 1A. Moscas são montado lado ventral para baixo em um pedaço de fita isolante e os dois primeiros segmentos do abdome, onde se encontra o vaso dorsal, é claramente visível (figura 1B). Principais fontes de erro experimental surgem em etapas do processo (Figura 1) de imagem e a injeção. Usando a mesma agulha para injetar várias moscas possam causar-lhe ficar obstruídos com tecido voar ou partículas (painel superior esquerdo na Figura 1). Porque Drosophila autofluorescente sob luz GFP, moscas injetadas com uma agulha entupida serão fluorescem sumida mas falta a fluorescência clara, punctate de partículas internalizada pelos hemócitos. Outra potencial fonte de erro experimental pode ocorrer durante as injeções Trypan azul. Trinta minutos após a primeira injeção com partículas fluorescente-etiquetadas, moscas recebem uma segunda injeção com Trypan Blue, que sacia a fluorescência de partículas extracelulares, un-fagocitadas. Intensidade de fluorescência relativo para cada mosca é calculada dividindo-se a fluorescência do vaso dorsal pelo de uma área adjacente igualmente tamanho no abdômen. Moscas que não recebem suficiente azul Trypan fluorescem brilhantemente ao longo de seu abdômen inteiro (painel inferior esquerdo da Figura 1). Esta fluorescência pode reduzir a proporção do vaso dorsal para fluorescência de fundo, diminuindo assim a relação de intensidade de fluorescência verdadeiro do animal. Finalmente, moscas devem ser fotografadas enquanto imobilizados por CO2, como mover-se ativamente voa produzem imagens borradas que não podem ser quantificadas (superior e inferior, direito painéis da Figura 1).

A coleção de Zuker é um painel de Metanossulfonato de etila (EMS) Tratado voa com mutações autossômicas. 31 originalmente criado como um recurso comunitário, em 2004, as linhas têm sido utilizadas para realizar telas genéticas direta e inversa. Nosso laboratório identificou uma linha da coleção Zuker, o que não é capaz de fagocitar bactérias Gram-negativas (Escherichia coli estirpe de K-12) e bactérias gram-positivas (S. aureus madeira Coe sem proteína um) (Figura 2). Este mutante, chamado de argus, não mostra quase nenhuma fluorescência vaso dorsal no ensaio in vivo de fagocitose. Quando comparado com a tensão de fundo isogénicas Zuker, cn bw, argus mostra significativamente menos absorção de e. coli (p-valor = 0,019; Cohen d = 1.677) e S. aureus (p-valor = 0.0083; De Cohen d = 1.672). Argus fagocitose bacteriana também é significativamente prejudicada, Escherichia coli (p-valor = 0,045; De Cohen d = 0.850) e S. aureus (p-valor = 0.0136; De Cohen d = 1.422) quando comparado com outro comum laboratório controle cepa, Cantão-S.

Figura 1: Visão geral e imagens representativas de ensaio in vivo de fagocitose. R. esquemático do ensaio in vivo de fagocitose partículas de fluoresceína-rotulados. Duas injeções, 30 minutos, são usados para partícula visualizado reconhecimento e aceitação pelos glóbulos dorsais associada a embarcação. B. branco luz imagem mostrando uma mosca montada na fita, com segmentos abdominais anteriores claramente visíveis. C. exemplo em imagens de fagocitose vivo. (superior esquerdo) Uma mosca injectada com uma agulha entupida não tem nenhuma fluorescência de partícula. (canto inferior esquerdo) Uma mosca com alta fluorescência extracelular devido à insuficiente trypan azul. (superior direito) Uma mosca de imobilizar com nenhuma fluorescência extracelular – imagem ideal. (canto inferior direito) Uma mosca em movimento como CO2 anestesia desgasta fora cria uma imagem borrada. Barra de escala, 0,2 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: a fagocitose de bactérias mutantes e controle de moscas. R. imagens representativas das bactérias de fagocitose rotuladas com corante de fluoresceína; Escherichia coli (top painéis) e S. aureus (painéis de fundo). B. A relação de intensidade de fluorescência da voa injetado com fluoresceína - partículas deEscherichia coli . C. A relação de intensidade de fluorescência da voa injetado com fluoresceína - partículas deS. aureus . n = 3 experimentos para cada tipo de bactéria, com 6-8 moscas por experiência. Barras de erro, ± análise estatística SEM. = bicaudal t -teste. Barra de escala, 0,2 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.