Quantificação de células T antígeno-específicas humanas proliferating de CD4+ usando o éster do Succinimidyl do carboxyfluorescein

Summary

É apresentado aqui um protocolo para medir proliferating pilhas de T CD4⁺ em resposta às proteínas antigénicas ou aos peptídeos usando a diluição da tintura. Este ensaio é particular sensível às pilhas de T antígeno-específicas raras e pode ser modificada para facilitar a clonagem de pilhas antígeno-específicas.

Abstract

Descrito é um método simples, in vitro, baseado na diluição da tintura para medir a proliferação antígeno-específica da pilha de T CD4⁺ em pilhas mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). O desenvolvimento de tinturas estáveis, não-tóxicas, fluorescentes tais como o éster do grufo do usando (CFSE) permite que as pilhas de T raras, antígeno-específicas sejam distinguidas dos transeunte pela diminuição na mancha fluorescente, como detectado pelo fluxo cytometry. Este método tem as seguintes vantagens sobre abordagens alternativas: (i) é muito sensível a células T de baixa frequência, (II) nenhum conhecimento do antígeno ou epítopo é necessária, (III) o fenótipo das células que respondem pode ser analisado, e (IV) viável, respondendo células podem ser classificadas e usadas para análise posterior, como a clonagem de células T.

Introduction

A capacidade de detectar e estudar células T antígeno-específicas é importante em estudos de imunidade mediada por células. No entanto, isso é particularmente desafiador para as respostas de células T CD4⁺ específicas do autoantígeno, que são muito fracas e difíceis de detectar. Um método comum usado para a deteção da proliferação antígeno-específica do linfócito é [3H]-thymidine, que é um nucleotide radiolabeled incorporado no ADN de pilhas proliferating. Embora o ensaio de [3h]-thymidine possa detectar a síntese do ADN, este método é uma medida indireta da divisão da pilha, porque a síntese do ADN pode iniciar independentemente da mitose (isto é, durante ....

Protocol

Todos os sujeitos deram consentimento informado antes da coleta de sangue periférico. A aprovação ética para experimentos usando PBMC foi dada por St. Vincent ' s hosptial (HREC-A 135/08, e HREC-A 161/15).

1. preparação do reagente

1. Meios humanos da pilha de T
   1. Prepare a mídia RP-5 para cultivar PBMC, que consiste em RPMI 1640, 1x aminoácidos não essenciais, dipeptídeo L-alanyl-L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U/mL)/estreptomicina (0,1 mg/mL) e 5% de soro humano agrupado (PHS).
2. Soluções de ações CFSE
   1. Prepare um estoque mestre dissolvendo 25 mgs de CFSE....

Results

Estimulação in vitro de PBMCs humanos com proteína toxóide do tétano: PBMCs foram corados com CFSE e estimulados por 7 dias na presença de toxóide tetânico. Quase todos os doadores mostraram uma resposta forte da pilha de T ao toxóide do tétano porque tinham sido vacinados, que faz o toxóide do tétano um antígeno positivo útil do controle. A Figura 2 demonstra, em triplicado, que a proliferação CFSE de células T CD4⁺ de PBMCs não estimulados foi mí.......

Discussion

A proliferação CFSE-baseada é um método simples e robusto para detectar e enumerar pilhas humanas antígeno-específicas de CD4⁺ T. Tem sido demonstrado previamente que a utilização da concentração óptima de CFSE é essencial para resultados óptimos⁴. Demasiada proliferação dos AB roga de CFSE, visto que demasiado pouco não permite que as pilhas divididas e undivide sejam distinguidas. Por outro lado, concentrações relativamente elevadas (5,0 μM) de CFSE são usadas para rotular células T m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-humano CD4-AlexaFluor647	Biolegend	317422	RRID:AB_2716180
Carboxifluoresceína éster succinimidílico (CFSE)	ThermoFisher	C1157
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00
Glutamax (1x)	Gibco	35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matriz proteína 1	Sino Biológico	40010- V07E
Aminoácidos não essenciais (1x)	Gibco	11140
Penicilina/Estreptomicina (1x)	Gibco	15070063
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Soro humano agrupado	Cruz Vermelha Australiana	N/A
Proinsulina C-peptídeo PI33-63	Purar Chemicals	N/A	Custom feito peptídeo sintético
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Proteína do toxóide tetânico	Statens Serum Intitut	N/A