Artigo de método

Um protocolo de estresse de imobilização crônica para induzir o comportamento semelhante à depressão em camundongos

DOI:

10.3791/59546

⸱

15 de maio de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Convergence Medical Sciences, Institute of Health Sciences, Bio Anti-aging Medical Research Center, Gyeongsang National University Medical School, 2Department of Biological Sciences, Pusan National University, 3Department of Physiology and Convergence Medical Sciences, Institute of Health Sciences, Gyeongsang National University Medical School

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este artigo fornece um protocolo simplificado e estandardizado para a indução do comportamento depressivo-como em ratos cronicamente imobilizados usando um restringidor. Além disso, explicam-se comportamentos e técnicas fisiológicas para verificar a indução da depressão.

Resumo

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A depressão ainda não está totalmente compreendida, mas vários fatores causais foram relatados. Recentemente, a prevalência de depressão aumentou. Entretanto, os tratamentos terapêuticos para a depressão ou a pesquisa na depressão são escassos. Assim, no presente trabalho, propomos um modelo de depressão induzida pela restrição do movimento. O estresse leve crônico (CMS) é uma técnica bem conhecida para induzir o comportamento depressivo. No entanto, ele necessita de um procedimento complexo que consiste em uma combinação de várias tensões leves. Em contrapartida, o estresse crônico de imobilização (CIS) é um modelo de estresse crônico prontamente acessível, modificado a partir de um modelo de contenção que induz o comportamento depressivo restringindo o movimento usando um retentor por um determinado período. Para avaliar os comportamentos depressivos, o teste de preferência de sacarose (SPT), o teste de suspensão de cauda (TST) e o ensaio ELISA para medir os níveis de corticosterona do marcador de tensão são combinados no presente experimento. Os protocolos descritos ilustram a indução da CIS e a avaliação das alterações no comportamento e fatores fisiológicos para a validação da depressão.

Introdução

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O transtorno depressivo maior (MDD) é a principal causa de incapacidade mental em todo o mundo, com uma incidência que está aumentando mais rapidamente do que o previsto. Em 2001, a Organização Mundial de saúde previu que o MDD seria a segunda doença mais comum no mundo por 2020. No entanto, já era o segundo mais comum em 20131. Além disso, os antidepressivos atuais têm muitas limitações, incluindo efetividade tardia, resistência a drogas, recidiva e vários efeitos colaterais2,3. Os pesquisadores devem, portanto, desenvolver antidepressivos mais eficazes. No entanto, a fisiopatologia ambígua da MDD apresenta um obstáculo ao desenvolvimento de novos antidepressivos.

O estresse a longo prazo é o principal fator de risco para MDD. Pode induzir disfunção no eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (hPa), que também está relacionada à etiologia do MDD4,5. Como descrito anteriormente, o eixo HPA desempenha um papel crítico na fisiopatologia psiquiátrica induzida por estresse,incluindo transtornos de depressão e ansiedade, aumentando os níveis de corticosterona6,7,8, 9. muitos modelos animais têm sido baseados na ativação sustentada do eixo HPA, que é observado em pacientes com MDD4. Além disso, os glicocorticóides elevados induzidos pelo esforço crônico e por glicocorticóides por via subcutânea injetados causam comportamentos depressivos junto com a morte da pilha neural, a atrofia de processos neuronal, e a neurogênese adulta reduzida no cérebro dos roedores10 , 11. outra área cerebral importante associada à depressão é o córtex pré-frontal medial (mpfc). O mpfc desempenha um papel crucial no controle das sub-regiões cerebrais, como o hipotálamo e a amígdala, que controlam o comportamento emocional e as respostas de estresse8,9. Por exemplo, lesões no mpfc dorsal induziram disfunção do eixo HPA e secreção de corticosterona aumentada devido ao estresse de contenção12,13. Um estudo recente mostrou também que o stress repetido da limitação aumentou níveis do corticosterona, que poderia ser diminuído pela suplementação do glutamina através do ciclo do glutamate-glutamina entre neurônios e astrocyte no mpfc9.

O primeiro paradigma de estresse crônico utilizado para estudar a etiologia da MDD foi sugerido por Katz14. Willner et al. então propuseram um modelo crônico de estresse leve (CMS) baseado nos achados de Katz. Confirmaram que o modelo teve a validez preditiva observando que os antidepressivos restauraram o comportamento anhedonic-like CMS-induzido15,16. Tipicamente, o modelo do CMS consiste em uma combinação de várias tensões suaves, tais como o ruído suave, a inclinação da gaiola, o fundamento molhado, ciclos luz-escuros alterados, agitação da gaiola, natação forçada, e derrota social. O modelo CMS é amplamente utilizado por pesquisadores; no entanto, esse modelo é de baixa replicabilidade e ineficiência de tempo e energia. Portanto, há uma demanda crescente por um protocolo padronizado e simplificado para indução de comportamento depressivo e análise fisiológica para avaliar a depressão. Comparado ao modelo CMS, o estresse crônico de imobilização (CIS; também conhecido como estresse crônico de contenção) é mais simples e eficiente; Portanto, o modelo cis pode ser amplamente utilizado nos estudos de estressecrônico17,18,19,20,21,22,23, 24. Além disso, os CIS podem ser usados em camundongos machos e fêmeas para desenvolver comportamentos depressivos25,26. Durante CIS, os animais são coloc em um cilindro feito medida corpo-cabido por 1-8 horas por o dia por 2 ou 4 semanas9,27,28. Destes, a condição de tensão de contenção por 2 horas por dia durante 2 semanas é suficiente para causar comportamentos depressivos com dor mínima em camundongos9,28. Em condições de contenção, os níveis de corticosterona no sangue aumentaram rapidamente9,28,29. Vários estudos mostraram que o modelo cis tem validade preditiva, confirmando que os sintomas depressivos-like induzida por cis são restaurados por antidepressivos19,20,30,31. Nisto, nós relatamos os procedimentos detalhados do CIS, assim como alguns resultados comportáveis e fisiológicos após CIS nos ratos.

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Protocolo

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Todos os protocolos experimentais e cuidados com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê de cuidados com animais universitários para pesquisa animal da Universidade Nacional de Gyeongsang (GLA-100917-M0093).

1. materiais

  1. Ratos
    1. Use machos do fundo da tensão de C57Bl/6 que pesa 22 – 24 g na semana pós-natal 7. Habituar-se na sala de reprodução para 1 semana antes dos experimentos.
      Nota: todos os ratos foram comprados de uma empresa de animais de laboratório.
    2. Ratos de casa individualmente em um Biotério temperatura-controlado (22 – 24 ° c) um ciclo claro/escuro de 12 horas (luzes sobre em 6:00 A.M.), com o Chow normal do laboratório e a água disponíveis ad libitum.
  2. Restrainer
    1. Use um tanque cilíndrico, transparente e acrílico (altura = 8,5 cm, diâmetro = 2,5 cm) fixado em um pedestal quadrado para conter e produzir comportamento depressivo (Figura 1a). O diâmetro deste cilindro foi feito para caber o corpo de modo que o rato não poderia girar e mover para a frente ou para trás. O contido pode ser comprado comercialmente ou feito no laboratório.
  3. Aparelho de suspensão da cauda
    1. Use uma caixa de suspensão de cauda de tamanho razoável feita de acrílico translúcido (altura = 30 cm, largura = 20 cm, comprimento = 20, Figura 1b). Para evitar interações entre os animais, use divisórias retangulares dentro da caixa para que o piso e três das quatro paredes são bloqueados por placas de acrílico. Deixe os dois lados restantes da caixa aberta para permitir a gravação de vídeo e para fixar a barra horizontal. A caixa pode ser comprada comercialmente ou feita no laboratório.
  4. Dispositivo de gravação de vídeo e software de rastreamento de vídeo
    1. Use uma câmera de televisão de circuito fechado em preto e branco (ver tabela de materiais) conectada a um computador e a um tripé (ou outros produtos de suporte) para permitir a gravação do experimento comportamental. A gravação de vídeo é essencial para permitir a pontuação comportamental neste experimento, pois pelo menos dois camundongos são testados ao mesmo tempo.
    2. Assegure-se de que a resolução da câmera seja suficientemente alta para permitir que os dados de vídeo sejam analisados usando o software de rastreamento de vídeo (consulte a tabela de materiais) instalado no computador conectado.

2. indução da depressão por contenção CIS

Nota: Manuseie o rato suavemente, mas firmemente com confiança. A manipulação áspera e provisório é um outro fator do esforço no experimento e é uma razão importante para o rato que esforça-se, morder, e riscar.

  1. Ajuste a luz do quarto à luz (200 Lux) condiciona usando um medidor digital do Lux.
  2. Casa o mouse em uma gaiola separada pelo menos uma semana antes de testar e colocar o mouse na sala de testes por pelo menos 30 minutos antes do experimento.
    Nota: Manuseie os ratos pelo menos uma vez por dia durante pelo menos 3 dias consecutivos antes do experimento para que os ratos se familiarizem com o experimentador. Um período adaptacional antes do experimento é necessário para garantir que os camundongos aclimatizam à circunstância, como a sala de testes.
  3. Segure suavemente a cauda do mouse para evitar Tensing o mouse, e então cuidadosamente colocá-lo em uma superfície áspera (parte superior da barra de arame da gaiola ou tampa da gaiola).
  4. Cubra a restrição com uma pequena toalha branca e, em seguida, gentilmente Coloque o mouse na abertura da restrição para que o mouse entra na restrição voluntariamente.
    Nota: neste caso, o rato é posicionado na direcção oposta à que introduz a restrição com. Para levar o mouse para entrar na restrição voluntariamente, o contido é coberto com uma toalha pequena para tornar o interior mais escuro.
  5. Coloque o fechamento para conter o mouse o mais apertado possível, sendo cuidadoso para evitar danos ao corpo, tais como cauda, pés, e testículos.
  6. Contenha o rato por 2 h/dia (9:00 A.M. a 11:00 A.M.) durante 15 dias consecutivos.
  7. Medir o peso corporal e a ingestão de alimentos a cada 48 h durante a exposição ao retentor (ou seja, a quantidade de ingestão de alimentos durante o 48 h antes do início da contenção do movimento).
    Nota: ao medir o peso corporal e a ingestão de alimentos, coloque os ratos de controle em suas gaiolas domésticas na sala de testes durante o CIS. Assegure-se de que outros fatores ambientais sejam os mesmos que para os ratos CIS.
  8. Confirme a indução da depressão realizando testes comportamentais como o teste de preferência de sacarose (SPT) e o teste de suspensão de cauda (TST) (consulte os passos 4 e 5).
  9. Confirme a indução da depressão medindo o marcador de tensão corticosterona utilizando o ensaio ELISA (consulte a secção 6).

3. o teste de preferência de sacarose

  1. Antes de testar, habituar os ratos à presença de dois frascos bebendo (um que contem 0,1 M de sacarose e o outro que contem a água lisa) para 48 h. mude as posições dos dois frascos após 24 h para reduzir todo o confundimento produzido por um viés lateral.
  2. No dia 3RD , privar os ratos de água para 24 h.
  3. No dia do experimento SPT, expor os camundongos a duas garrafas bebendo por 6 h. Depois de 3 h, mude a posição das garrafas de água.
  4. Registre o volume (mL) de solução de sacarose e água consumida e, em seguida, calcule a afinidade dos animais com a sacarose.
  5. Geralmente, calcule a preferência de sacarose como uma porcentagem do volume de consumo de sacarose sobre o consumo total de fluido durante o teste.

4. o teste de suspensão da cauda

  1. Traga os ratos CIS-induzidos na sala de testes pelo menos 30 minutos antes de começar o TST.
  2. Ajuste a luz do quarto para Dim (50 Lux) condições.
  3. Para obter o arquivo de vídeo de resolução mais alta, coloque a câmera o mais próximo possível do mouse (cerca de 40 cm do mouse).
  4. Suspenda o rato firmemente da barra horizontal (30 cm da linha inferior) usando a fita adesiva do celofane (a distância da ponta da cauda é 1 cm). Complete o processo de aplicação de fita para o mouse o mais rápido possível para minimizar outras fontes de stress.
  5. Uma vez que o mouse está posicionado no meio da caixa de suspensão, iniciar a gravação e observar as alterações comportamentais continuamente por 6 min.
    Nota: se o mouse tenta escalar sua cauda, use uma vara ou escalar rolha para impedi-lo de fazê-lo.
  6. No final do experimento, mova o mouse para sua gaiola de casa e Retire cuidadosamente a fita de sua cauda.
  7. Analise o tempo acumulado de períodos immóveis usando o software de rastreamento de vídeo.
    Nota: a duração da imobilidade é o parâmetro CIS mais importante. Isso pode ser calculado como o tempo acumulado de períodos immóveis, definidos em termos de um limiar de movimento contido no dispositivo de filtragem de nível do software.

5. medindo os níveis de corticosterona no sangue por ELISA

Nota: um dia após o teste comportamental, os camundongos são sacrificados para coleta de sangue.

  1. Anestesie o rato com 5% de isoflurano numa câmara de indução até à anestesia. Certifique-se de que o rato tem tempo suficiente na câmara de indução (pelo menos 2 min) para evitar acordar durante a cirurgia.
  2. Colete o sangue do coração usando uma seringa de 1 ml, e armazene o sangue nos de que contêm o EDTA do K3no gelo (em 9 A.M.)
  3. Separe o plasma por centrifugação a 1.000 × g durante 15 min a 4 ° c.
  4. Quantificar os níveis plasmáticos de corticosterona utilizando o kit ELISA corticosterona (ver tabela de materiais) de acordo com o protocolo do fabricante.

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Resultados

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No experimento representativo, todos os dados foram adquiridos de 6-8 camundongos por grupo. Os materiais representativos e o método para inserir o mouse voluntariamente na restrição são mostrados na Figura 1.

Para realizar o teste comportamental e a amostragem de sangue após a indução da CIS, os camundongos foram submetidos ao procedimento experimental, conforme resumido na Figura 2a. Como mostrado na Figura 2

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Discussão

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A complexidade do cérebro e a heterogeneidade do MDD fazem com que seja desafiador criar modelos animais que reproduzam completamente a condição. Muitos pesquisadores têm superado essa dificuldade usando uma abordagem baseada em endofenótipo32, em que anedonia (falta de interesse em estímulos recompensadores) e desespero são considerados comportamentos evolutivamente conservados e quantificáveis em modelos animais, que também são observados em pacientes com depressão33. No ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa de ciência básica através da Fundação Nacional de pesquisa da Coréia (NRF) financiado pelo Ministério da educação (NRF-2015R1A5A2008833 e NRF-2016R1D1A3B03934279) e a concessão do Instituto de Ciências da saúde (IHS GNU-2016-02) na Universidade Nacional de Gyeongsang.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringas descartáveis de 1 mlSungshim MedicalP000CFDO
BalanceA& D CompanyFX-2000i
Bocal esféricoJeung Do B& Câmera CCTV PJD-C-88
KOCOMKCB-381
Corticosterona ELISA kitsCayman Chemical
Digital luxímetroTESTES-1330A
Ethovision XT 7.1Noldus Tecnologia
IsofluranoHANA PHARM CO., LTD.Solução Ifran
RatosKoatechC57BL/6 strain
RestrainerDae-jong Instrument IndustryDJ-428
Sacarose (sacarose)DAEJUNG7501-4400
Sistema anestésico de isoflurano para pequenos animaisSummit
BarraO aparelho foi fabricado em laboratório para teste de TST
Caixa de suspensãoO aparelho foi feito no laboratório
TimerElectronics TomorrowTL-2530
Garrafa de águaJeung Do B& PJD-C-79
da Informação de acrílico traseira

Referências

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