Artigo de método

Preparação de nanopartículas poliméricos neutralmente carregadas e responsivas ao pH para entrega de siRNA citosólica

DOI:

10.3791/59549

⸱

2 de maio de 2019

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of Mississippi, 2Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi, 3Biomedical Engineering Program, University of Mississippi

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

São apresentados métodos para preparar e caracterizar as propriedades físico-químicas e a bioatividade de nanopartículas de siRNA com carga neutra e pH responsivo. Os critérios para nanomedicinas bem sucedidas de siRNA tais como o tamanho, a morfologia, a carga de superfície, o carregamento de siRNA, e o silenciamento do gene são discutidos.

Resumo

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O sucesso de siRNA como uma medicina molecular alvejada é dependente em cima de sua entrega citosólica eficiente às pilhas dentro do tecido da patologia. O sucesso clínico para tratar previamente "undruggable" alvos hepatic da doença com siRNA foi conseguido. Entretanto, a entrega eficiente do siRNA do tumor necessita considerações farmacocinéticas adicionais do projeto, incluindo o tempo longo da circulação, a evasão de órgãos do afastamento (por exemplo, fígado e rins), e a penetração e a retenção do tumor. Aqui, nós descrevemos a preparação e in vitro caracterização físico-química/biológica de nanopartículas poliméricos projetadas para a entrega eficiente de siRNA, particular aos tecidos não-hepatic tais como tumores. As nanopartículas de siRNA são preparadas por complexação eletrostática de siRNA e o copolímero diblock poli (etileno glicol-b-[2-(dimetilamino) etil metacrilato-co-butil metacrilato]) (PEG-DB) para formar complexos de poliíons ( polyplexes) onde o siRNA é seqüestrado dentro do núcleo do Polyplex e o Peg dá forma a uma Corona hidrófila, neutrally-carregada. Além disso, o bloco do DB transforma-se membrana-Lytic como os vesículas da via endolysosomal acidificar (< pH 6,8), provocando o escape endossomal e a entrega citosólica de siRNA. Métodos para caracterizar as características físico-químicas de nanopartículas de siRNA como tamanho, carga superficial, morfologia de partículas e carregamento de siRNA são descritos. A bioatividade de nanopartículas de siRNA é medida usando a luciferase como um gene modelo em um ensaio de silenciamento gênico rápido e de alta taxa de transferência. Os projetos que passam estes testes iniciais (tais como polyplexes PEG-DB-baseados) são considerados apropriados para a tradução aos estudos animais pré-clínicos que avaliam a entrega de siRNA aos tumores ou aos outros locais da patologia.

Introdução

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Como as siRNAs inibem a tradução de proteínas de seqüências de mRNA, teoricamente podem ser usadas para drogas todas as patologias conhecidas1,2,3,4,5. No entanto, o uso de siRNA em medicina é limitado pelo perfil farmacocinético exaustivamente pobre de moléculas de siRNA6,7. Quando injetadas intravenosamente, as siRNAs são rapidamente desmarcadas através dos rins e/ou degradadas por nucleases8,9. Devido ao seu grande tamanho e carga negativa, o siRNA não pode entrar em células ou escapar da via endolysosomal para acessar o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) que reside no citosol10,11,12, treze anos. Assim, o amplo esforço tem focado no desenho e implementação das estratégias de entrega do siRNA14. Este esforço concentrou-se em grande parte no desenvolvimento de nanopartículas baseadas em lipídios e polímeros que empacotem siRNA, protegem-na do afastamento e da degradação in vivo, e iniciam a captação celular e o escape endossomal através dos grupos ionizable, catiônicos da amina. Muitos sucessos pré-clínicos foram relatados e mais recentemente, o primeiro sucesso clínico foi relatado para a entrega hepatic Nanoparticle-baseada do siRNA para tratar o amiloidose transthyretin-negociado hereditário (hattr)15.

Há muitos genes causadores de câncer que são atualmente "undruggable" pela farmacologia convencional (ou seja, pequenas moléculas de drogas), motivando o projeto de nanopartículas de siRNA poliméricos (si-NPs) para tratar o câncer16. No entanto, há um conjunto separado de parâmetros de projeto que devem ser considerados para a entrega de siRNA não-hepática. O sistema de distribuição deve proteger a carga catiônica do poliplex que provoca aglutinação dentro da circulação sistêmica17,18,19. Para a entrega do tumor, especificamente, a estabilidade do si-NP é essencial para dotar a circulação longa e assim a acumulação aumentada dentro dos tumores através do efeito realçado da permeabilidade e da retenção (EPR)20,21. Além disso, o controle sobre o tamanho de si-NP é essencial, uma vez que apenas nanopartículas de aproximadamente 20 – 200 nm de diâmetro na alavancagem de tamanho EPR22, e menor si-NPS (~ 20 – 50 nm de diâmetro) exibem melhor penetração tumoral sobre nanopartículas de tamanho maior e micropartículas23.

Para abordar estas limitações adicionais do projeto para a entrega sistemática do tumor de siRNA depois da administração intravenosa, neutralmente-carregada, si-NPs pH-responsivo foi desenvolvida (Figura 1)24. Estes si-NPs são PEGylated, ou mais recentemente, Zwitterionated25, para a carga de superfície neutra e a resistência à adsorção e à opsonização da proteína na circulação. Desde que não podem depender unicamente do caráter catiônico para conduzir a entrega intracelular, o escape endossomal extremamente eficiente é imperativo para conseguir o silenciamento de gene potente. Consequentemente, o núcleo destes si-NPS é compor de um núcleo altamente endosomolytic que seja inerte no pH extracelular (7,4), mas que é provocado em um interruptor-como a maneira nas condições acidificado da via endolysosomal [pH 6,8 (endosomes adiantados) – 5,0 ( lisossomas)]. Por último, uma mistura de conteúdo catiônico e hidrofóbico dentro do núcleo do si-NPs fornecer forças de estabilização eletrostática e Van der Waals, melhorando a estabilidade do si-NPs no sangue em comparação com sistemas meramente catiônicos.

A integração de muitas funções em um projeto relativamente simples é possível usando a polimerização controlada de transferência de cadeia de adição-fragmentação reversível (RAFT) para produzir polímeros com arquitetura complexa e composição precisa. Para produzir si-NPs com carga de superfície neutra, pH-responsividade e estabilidade NP, a JANGADA é usada para sintetizar poli (etileno glicol-b-[2-(dimetilamino) metacrilato de etilo-co-butil metacrilato]) (PEG-DB; Figura 1a). O PEG-DB é complexado eletrostaticamente com siRNA, formando si-NPs com uma Corona PEG e núcleo DB/siRNA (Figura 1b). O PEG forma uma camada hidrófila inerte, neutralmente carregada na Corona do si-NP. O bloco DB consiste em uma razão molar de 50:50 de 2-(dimetilamino) de metacrilato de etilo (DMAEMA) e metacrilato de butilo (BMA). Complexos eletrostaticamente catiônicos de DMAEMA com carga negativa de siRNA. BMA Self-Associates dentro do núcleo NP por interações Van der Waals, aumentando a estabilidade NP. Em conjunto, DMAEMA e BMA concebem o comportamento lítico lipídico dependente do pH para o bloco de polímero DB. No pH extracelular, o bloco DB é sequestrado para o núcleo si-NP e é inerte a bilayers lipídicos. condições ácidas, como aquelas dentro da via endolysosomal, a DMAEMA ionizável dentro do bloco DB facilita o efeito da esponja de prótons, onde a tamponamento endossômica leva ao inchaço e ruptura osmótica26. Adicionalmente, os metades hydrofóbicos do BMA dentro do bloco do DB integram ativamente em e lyse bilayers lipídicos, tendo por resultado o endosomolysis potente. Assim, o siRNA é complexado com Peg-DB para formar si-NPS que são neutralmente carregados e altamente estáveis no pH extracelular, mas que perturbam as bicamadas lipídicas no pH ácido, assegurando a entrega citosónica do Payload siRNA.

São descritos aqui os procedimentos experimentais para produzir si-NPs de PEG-DB. Os métodos para caracterizar os parâmetros físico-químicos e a bioatividade de si-NPs são apresentados e discutidos. A fim de avaliar rapidamente a bioatividade de si-NP, a luciferase é usada como um gene modelo para estudos de knockdown. Firefly luciferase é a proteína responsável pelo ' fulgor ' dos vaga-lumes27. Assim, as células de mamíferos transfectadas com o gene da luciferase do vagalume produzem um "brilho" bioluminescente que pode ser capturado usando um luminômetro para quantificar os níveis de expressão de luciferase. Aqui, usamos luciferase para avaliar a bioatividade de si-NPs, entregando siRNA contra luciferase e quantificando a redução correspondente em bioluminescência em células expressando luciferase em comparação com células que recebem um siRNA mexido.

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Protocolo

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1. preparação e caracterização de si-NPs

  1. preparação para si-NP
    1. Dissolva o polímero em tampão de ácido cítrico de 10 mM (pH 4,0) a 3,33 mg/mL. O polímero pode primeiramente ser dissolvido na concentração 10x no ethanol para assegurar a dissolução.
      Nota: o polímero pode ser dissolvido em concentrações mais baixas, mas o uso em concentrações acima de 3,33 mg/mL pode impedir a formação homogénea do NP.
    2. Adicionar siRNA (50 μM em diH2O) para resultar em N+:P- rácio de 10. Misture soluções de polímero e siRNA cuidadosamente introduzindo pipetagem e deixe incubar por 30 min. O N+:P- ratio representa o número de grupos de amina com carga positiva no polímero para o número de grupos de fosfato com carga negativa no siRNA e é calculado pela fórmula abaixo:
      figure-protocol-1
      onde, mol pol é a quantidade molar de polímero, RU amina é o número de unidades de repetição de aminas positivamente carregadas por polímero, mol siRNA é a quantidade molar de siRNA, e BP siRNA é o número de pares de base por molécula de siRNA.
    3. Adicione um excesso de 5 dobras de tampão fosfato de 10 mM (pH 8,0) e misture suavemente, introduzindo pipetagem ou invertendo o tubo. Para confirmar que o pH final é neutro (~ 7,2-7,5), pipetando 10 μL de solução si-NP para tiras de teste de pH.
      Nota: os tampões do ácido cítrico e do fosfato são preparados de acordo com os gráficos do centro de referência do amortecedor de millipore Sigma.
  2. Caracterização físico-química de si-NPs
  3. Registre a carga de tamanho e superfície do si-NPs resultante usando dispersão de luz dinâmica (DLS). Prepare uma amostra de DLS filtrando 1 mL de si-NPs (0,1 – 1,0 mg/mL) através de filtros de seringa de tamanho de poros de 0,45 μm em uma cubeta quadrada de quartzo ou poliestireno. Tamanho do registro e medições de carga de superfície usando um instrumento DLS de acordo com as especificações do fabricante.
    1. Confirmar o tamanho e a morfologia do si-NPs por análise de imagem utilizando microscopia eletrônica de transmissão (Met).
      1. Adicionar 5 μL de solução de si-NP a 1 mg/mL às grelhas TEM e incubar para 60 s. blot seco durante 3 s.
      2. Adicionar 5 μL de solução de acetato de uranilo a 3% e incubar durante 20 s. secar durante 3 s. grades secas durante a noite dessecação.
      3. Grades de imagem de acordo com o protocolo estabelecido para o microscópio específico a ser usado.
    2. Caracterizar o carregamento de siRNA em si-NPs em vários N+:P- rácios usando o retardamento do gel de agarose.
      1. Para produzir o gel do agarose de 2%, adicione 2 g do pó do agarose da classe da electroforese a 100 mL do amortecedor de 1x TAE (Tris-Acetato-EDTA) em pH 8,0. Mexa para suspender agarose. Calor descoberto no microondas até que todo o agarose é dissolvido (1-3 min).
      2. Uma vez resfriado, adicionar 5 μL de brometo de etídio (10 mg/mL em H2O), e misture bem. Despeje agarose em uma bandeja de gel e coloque o pente para produzir poços, deixando secar por 30 min. Retire cuidadosamente o pente para deixar para trás os poços de carga, e encha a bandeja de gel para a linha de preenchimento máximo com 1x tampão TAE.
      3. Gere si-NPs (de acordo com o procedimento acima) em 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20, e 40 N+:P- rácios. Colocar 2 μL de alíquotas de corante de carga (sem SDS e agentes redutores) em película de parafina para cada formulação si-NP. Misturar 10 μL de solução si-NP com corante de carregamento em película de parafina por pipeta.
      4. Adicione soluções de corante si-NP/loading a poços de gel de agarose. Execute a fonte de tensão em 100 V por 35 min (ou até que as amostras tenham atravessado 80% do comprimento do gel).
      5. Visualize as bandas de siRNA em um transiluminador UV de acordo com as especificações do fabricante.

2. determinação da bioactividade in vitro de si-NPs

  1. Knockdown do luciferase do gene modelo
    1. Gerar luciferase si-NPs (de acordo com o procedimento acima) usando luciferase siRNA e si-NPs mexidos usando uma seqüência de siRNA embaralhada como um controle. Formualte ambos si-NPs no mesmo final N+:P- relação e na relação óptima identificada por estudos do atraso do gel do agarose. Seqüências de exemplo siRNA estão incluídas na tabela de materiais.
    2. Semente luciferase-expressando células [MDA-MB-231/luciferase (BSD) células estáveis] em 96-bem placas de paredes pretas em uma densidade de 2.000 células por poço. Permitir aderir durante a noite em plena mídia (DMEM, 10% FBS) em uma incubadora (37 ° c, 5% CO2, 95% umidade).
    3. Diluir si-NPs em meios séricos completos para um volume final de 100 μL por poço e concentração de siRNA de 100 nM. Trate as células por 24 h com si-NPs.
    4. Após 24 h, retire os tratamentos e substitua os meios de comunicação com meios séricos completos contendo 150 μg/mL D-luciferina. Incubar células por 5 min antes de medir a luminescência em um leitor de placa ou in vivo sistema de imagem óptica de acordo com as especificações do fabricante.
    5. Substitua a mídia contendo luciferina com meios séricos frescos e cheios, e incubar mais 24 h. Repita o passo acima, removendo a mídia e substituindo com a mídia sérica completa contendo 150 μg/mL D-luciferina, seguida de uma incubação de 5 min antes da luminescência de medição no timepoint de 48 h.
    6. Para estudos longitudinais, mantenha as células condições estéreis enquanto mede a luminescência. Continue a cultura em meios frescos, cheios entre medidas após ter substituído o luciferin-conter.
      Nota: a concentração apropriada de siRNA variará com as moléculas diferentes do si-NPs e do siRNA. Ao usar polyplexes neutralmente carregados com um núcleo endosomolytic (por exemplo, PEG-DB), 100 nM é tipicamente bem tolerado pelas células e produz > 75% knockdown luciferase. A proporção de massa de PEG-DB para siRNA em 10 N+:P- ratio e 100 nm siRNA tratamentos (assumindo 26 BP sirna) é 23,3, ou seja, adicionar 23,3 ng de Peg-DB para cada 1,0 ng de siRNA. Por exemplo, adicione 1,16 μL de 3,33 mg/mL de polímero para 166,5 ng de siRNA para tratar um poço em 100 nM em uma placa de 96 poços (100 mL de volume de mídia por poço).

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Resultados

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Algumas características essenciais do si-NPs efetivo para a entrega in vivo de siRNA são o tamanho adequado (~ 20 – 200 nm de diâmetro), embalagem de siRNA e bioatividade de silenciamento de genes. Embora esta não seja uma lista exaustiva (como abordada na discussão), estas características básicas devem ser confirmadas antes de considerar mais testes de uma formulação.

A Figura 2 ilustra a caracteri...

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Discussão

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Os si-NPs descritos aqui são formados por associação eletrostática de siRNA aniônica e Polímeros Catiônicos em complexos de poliion (polyplexes). A complexação eletrostática de siRNA e o bloco catiônicos DB de polímeros Peg-DB são facilitadas pela mistura a baixo pH (4,0). No pH 4,0, o DMAEMA é altamente protonado e, consequentemente, o bloco DB é altamente carregado. Isto assegura-se de que os polímeros se dissolvem como unimers na solução ao contrário de formar micelas e que complexos do DB eficientemente com siRNA. Su...

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Divulgações

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Os autores não divulgam potenciais conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Os autores agradecem aos Drs. Craig Duvall e Rebecca Cook pelo acesso a dados e recursos laboratoriais para a realização desta pesquisa. Os autores são gratos ao Instituto Vanderbilt para a nanoescala de ciência e engenharia (VINSE) para o acesso a DLS e TEM (NSF EPS 1004083) instrumentos. Os autores são gratos à Fundação Nacional de ciência para apoiar o programa de bolsas de pós-graduação em pesquisa (NSF # 1445197). Os autores agradecem aos institutos nacionais de saúde pelo apoio financeiro (NIH R01 EB019409). Os autores são gratos ao departamento de defesa Congressionally dirigido programa de pesquisa médica para apoio financeiro (DOD CDMRP OR130302).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,45 μ m filtros de seringa de tamanho poroThermo Fisher ScientificF2513317 mm de diâmetro, membrana de PTFE
0-14 tiras de teste de pHMillipore SigmaP4786
10x tampão TAEThermo Fisher Scientific/InvitrogenAM9869
6-7.7 tiras de teste de pHMillipore SigmaP3536
Placas de parede preta de 96 poçosCorning3603Pó de agarose tratado com cultura de tecidos
Thermo Fisher Scientific/Invitrogen16500
Ácido cítrico monohidratadoMillipore SigmaC1909
fosfato de sódio dibásico di-hidratadoMillipore Sigma71643
D-luciferinaThermo Fisher Scientific88294Sal monopotássico
DMEMGibco11995065Alta glicose e piruvato
EtanolMillipore Sigma459836
brometo de etídioThermo Fisher Scientific/Invitrogen15585011
FBSGibco
Thermo Fisher Scientific/InvitrogenR0611
Luciferase siRNAIDTN/ASequencial da Fita Antisense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC
AAUUGUU
Sense Sequência da Filamenta: CAAUUGCACU
GAUAAUGAACUCCT*C* *Bases de DNA
MDA-MB-231 / Células estáveis da luciferase (Bsd)GenTarget IncSC059-BsdCélulas que expressam luciferase processadas para avaliar a bioatividade si-NP
fosfato de sódio monobásico monohidratadoMillipore SigmaS9638
SiRNA SCARMBLEDIDTN/ Sequencial de umfilamento anti-sentido: AUACGCGUAUU
AUACGCGAUUAACGAC
Sequencial do filamento Sense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC
GCGUA*T* *Bases de DNA
cubetas quadradas de poliestirenoFisher Scientific14-955-129com capacidade de 4,5 mL
TedPella, Inc.1GC50PELCO Grades marcadas ao centro, 50 mesh, 3,0 mm de diâmetro externo,
citrato trissódico de cobre di-hidratadoMillipore SigmaS1804
Polysciences, Inc.Rolamento 21447-25
corante de carregamento 26140079 Grades TEM Acetato de uranila

Referências

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