Artigo de método

Segmentação de agregados Alpha synuclein em fibras nervosas periféricas cutâneas por ensaio de imunofluorescência livre-flutuante

DOI:

10.3791/59558

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25 de junho de 2019

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1Laboratory for Biomedical Neurosciences, Neurocenter of Southern Switzerland, 2Neurology Department, Neurocenter of Southern Switzerland, 3Department of Neurology, Inselspital, Bern University Hospital, University of Bern, 4Faculty of Biomedical Sciences, Università della Svizzera Italiana

Neste artigo

Resumo

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Aqui, nós apresentamos um protocolo para um ensaio indireto deflutuação da imunofluorescência em seções da biópsia da pele que permita a identificação de variações específicas da conformação da doença do sinucleína alfa envolvido na doença de Parkinson e nas proteínas múltiplas do sistema nervoso periférico.

Resumo

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Até agora, para a maioria de doenças neurodegenerativas somente um diagnóstico definitivo histopatológico post-mortem está disponível. Para a doença de Parkinson (DP), o diagnóstico ainda depende apenas de sinais clínicos de comprometimento motor que aparecem mais tarde no curso da doença, quando a maioria dos neurônios dopaminérgicos já estão perdidos. Assim, há uma forte necessidade de um biomarcador que possa identificar os pacientes no início da doença ou com o risco de desenvolvê-lo. Durante os últimos anos, a biópsia da pele provou ser uma pesquisa excelente e uma ferramenta diagnóstica para doenças periféricas do nervo tais como a neuropatia pequena da fibra. Curiosamente, uma pequena neuropatia de fibra e alfa sinucleína (αsyn) depósitos neurais têm sido mostrados por biópsia de pele em pacientes com DP. Na verdade, a biópsia da pele tem a grande vantagem de ser um procedimento facilmente acessível, minimamente invasivo e indolor que permite a análise do tecido nervoso periférico propenso à patologia. Além disso, a possibilidade de repetição da biópsia cutânea no decorrer do seguimento do mesmo paciente permite estudar a correlação longitudinal com a progressão da doença. Nós definimos um protocolo confiável padronizado para investigar a presença de agregados αSyn em fibras nervosas da pele do paciente com DP. Este protocolo envolve poucas etapas curtas da fixação, um seccionamento do cryotome e então uma imunofluorescência livre-flutuante que mancha dobro com dois anticorpos específicos: anti produto 9,5 do gene da proteína (PGP 9.5) para marcar as fibras de nervo Cutaneous e o anti 5G4 para detectar agregados αSyn. É um protocolo versátil, sensível e fácil de executar que também pode ser aplicado para direcionar outras proteínas de interesse em nervos da pele. A capacidade de marcar agregados αSyn é outro passo em frente para o uso da biópsia cutânea como ferramenta para o estabelecimento de um diagnóstico histopatológico pré-morte de DP.

Introdução

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A biópsia cutânea adquiriu grande importância como ferramenta diagnóstica e de pesquisa no campo das desordens neurológicas1. Na verdade, a epiderme e a derme contêm abundantes fibras nervosas sensoriais somáticas (mielinizadas e não mielinizadas), terminações nervosas livres nociceptivas, receptores sensoriais e inervação autonômica de glândulas sudoríparas, vasos, glândulas sebáceas e músculo arrector arrectores o 2.

Em meados do século 20 , a instalação de imunoistoquímica do anticorpo PGP 9.5 permitiu a evidência de uma extensa inervação da epiderme humana3

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Protocolo

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O protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética cantonal e todos os sujeitos inscritos deram o consentimento informado por escrito ao estudo.

1. coleção da biópsia da pele

  1. Deixe um médico qualificado realizar a biópsia da pele em um ajuste clínico apropriado.
  2. Escolha a área para realizar a biópsia da pele e limpe-a com um cotonete de álcool.
  3. Prepare a solução anestésica com 1 cc de lidocaína 2%.
  4. Com a agulha paralela à área, injete a anestesia local subcutaneously.
  5. Após verificar o efeito da anestesia, tome o perfurador descartável de 3 milímetros e aplique a pressão descendente rotacional e d....

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Resultados

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Após o procedimento descrito (Figura 1), foram detectados agregados αsyn, rotulados com anticorpo 5G4, em fascículos do nervo dérmico inervação de estruturas autonômicas de pacientes com DP. A morfologia dos depósitos de alfa-sinucleina aparece como um sinal pontilhado ao longo dos axônios dos nervos dérmicos (Figura 2). De fato, explorando esse protocolo em 19 pacientes com DP e 17 controles em biópsias cutâneas em três sítios anatômicos (cervical, coxa e perna.......

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Discussão

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Nós descrevemos um ensaio de flutuação livre da imunofluorescência para biópsias da pele para o diagnóstico do paládio: explora a imunocoloração dobro com o anticorpo de anti-PGP 9.5, um marcador panaxonal, e o anti-5G4, um anticorpo específico da conformação que reconheça a forma agregada de αSyn.

As grandes vantagens da biópsia da pele para a finalidade diagnóstica no paládio e possivelmente em outras desordens conformacional da proteína são: 1) o acesso direto ao tecido nervoso propenso à d.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Agradecemos a Parkinson Schweiz e ABREOC (o Conselho Consultivo de pesquisa científica do ente Ospedaliero CANTONALE) por seu apoio financeiro deste estudo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
5G4 (anti humano &alfa; Syneclein 5G4)Analytik Jena Roboscreen847-0102004001Mouse monoclonal 
AlexaFluor 488 IgG anti coelho para cabras Invitrogen19714182 mg/mL
AlexaFluor 594 IgG anti camundongo para cabras Invitrogen19228492 mg/mL
Merk Millipore106586
EtilenoglicolSigma-Aldrich324558
GlicerolSigma-AldrichG7757
Cloridrato de L-lisinaSigma-AldrichL5626
ParaformaldeídoAldrich Química
PGP9.5Abcamab15503Cloreto de Sódio policlonal para coelhos
Sigma S3014
Dihidrogenofosfato de Sódio MonohidratadoMerck Millipore106346
(meta)periodato de sódio Sigma-AldrichS1878
Trizma BaseSigma T1503
Tryton X-100Sigma-AldrichX100
Vectashield Vector LaboratoriesH-1000Meio de montagem
solução de hidrogenofosfato dissódico de 441244

Referências

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  1. McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
  2. Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
  3. Weddell, G., et al.

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Etiquetas

Alpha Synuclein AggregatesCutaneous Nerve FibersFree floating ImmunofluorescenceSkin Biopsy ProtocolParkinson Disease BiomarkerPGP9 5 Nerve Marker5G4 Antibody DetectionCryotome SectioningFluorescence Microscopy AnalysisPeripheral Nervous Tissue

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