Um sistema de entrega e recuperação de patógenos precisos para modelos murinos de pneumonia bacteriana secundária

Resumo

Aqui, nós apresentamos métodos para melhorar estudos secundários da pneumonia bacteriana fornecendo uma rota não invasora da instilação no intervalo respiratório mais baixo seguido pela recuperação do micróbio patogénico e pela análise do transcrito. Estes procedimentos são reprodutíveis e podem ser executados sem equipamento especializado tal como cânulas, fios de guia, ou cabos da fibra óptica.

Resumo

As Pneumonias bacterianas secundárias que seguem infecções da gripe espesso consistentemente dentro das dez causas principais principais da morte nos Estados Unidos. Até o momento, os modelos murinos de coinfecção têm sido a principal ferramenta desenvolvida para explorar as patologias das infecções primárias e secundárias. Apesar da prevalência desse modelo, discrepâncias consideráveis em relação aos procedimentos de instilação, volumes de dose e eficácia são prevalentes entre os estudos. Além disso, esses esforços têm sido largamente incompletos em abordar como o patógeno pode influenciar diretamente a progressão da doença após a infecção. Nisto nós fornecemos um método preciso da entrega, da recuperação, e da análise do micróbio para ser usado em modelos murino da pneumonia bacteriana secundária. Nós demonstramos que a instilação intratraqueal permite uma entrega eficiente e exata de volumes controlados diretamente e uniformente no intervalo respiratório mais baixo. Os pulmões podem ser extirpado para recuperar e quantificar a carga do patógeno. Depois da excisão dos pulmões contaminados, nós descrevemos um método para extrair o RNA do micróbio patogénico da alta qualidade para a análise transcricional subseqüente. Este procedimento beneficia-se de ser um método não-cirúrgico da entrega sem o uso de equipamento de laboratório especializado e fornece uma estratégia reprodutível para investigar contribuições do micróbio patogénico à pneumonia bacteriana secundária.

Introdução

A pneumonia bacteriana secundária após a infecção por influenza é uma das principais causas de morte nos Estados Unidos e uma área ativa de pesquisa^1,2. Apesar de inúmeros estudos utilizando modelos murinos de pneumonia bacteriana secundária, as inconsistências quanto à instilação e interrogação do patógeno permanecem^3,4,5. Além disso, embora muitos esforços anteriores tenham se concentrado nos efeitos imunomoduladores da gripe que levam a um aumento da infecção bacteriana de forma susceptivelmente secundária, dados mais recentes sugerem que a regulação da virulência do patógeno bacteriano é igual contribuinte para o estabelecimento da doença^6,7,8,9. Esses novos dados necessitam de um método mais preciso para explorar a pneumonia bacteriana secundária em modelos murinos de co-infecção que facilitam a investigação sobre a resposta do patógeno.

Original aos modelos da co-infecção da gripe, os organismos do anfitrião são imunocomprometidos intencionalmente por uma infecção preliminar da gripe antes da administração do agente bacteriano secundário. A fim replicar melhor a patogénese da doença observada em anfitriões humanos, é imperativo que a carga do micróbio patogénico de ambos os agentes preliminares e secundários esteja controlada para observar os efeitos individuais e combinatória de cada agente infeccioso. Mais comumente, as infecções respiratórias em camundongos foram estabelecidas através de uma administração intranasal^3,4,5,6,10. Na medida em que esta rota é notável por ser tecnicamente simples e pode ser adequada em algumas aplicações de infecção de agente único, é inadequado para modelos de coinfecção, como procedimentos de instilação, volumes de dose e eficácia são altamente variáveis dentro literatura publicada^3,4,5,6.

Para obter uma compreensão mais completa da patogénese bacteriana secundária da pneumonia, as contribuições do anfitrião e do micróbio patogénico devem ser consideradas. Para esse fim, nós desenvolvemos uma aproximação direta e reprodutível para a recuperação de bactérias viáveis e do RNA do micróbio patogénico dos pulmões contaminados. Este método usa um procedimento de instilação intratraqueal simplificado, não invasor seguido pelo isolamento subseqüente do RNA bacteriano. O procedimento de instilação intratraqueal aqui descrito é semelhante aos métodos previamente descritos e não se limita à entrega do patógeno^11,12,13. O uso deste procedimento particular beneficia-se de ser de baixo custo e não exige o uso de equipamento especializado tal como cânulas, fios de guia, ou cabo da fibra óptica; Além disso, porque este procedimento é não-invasor assegura o esforço mínimo em assuntos murino, minimiza uma resposta inflamatório da mecânica da inoculação, e fornece uma rota eficiente da entrega para a infecção de assuntos múltiplos. Brevemente, os camundongos anestesiados com isoflurano são suspensos dos incisivos. Os fórceps são usados para agarrar delicadamente a lingüeta seguida pela inserção de um dobrado pre-loaded, Blunt-derrubado, agulha do calibre 21 na traquéia e na entrega da carga do micróbio patogénico. A validação deste procedimento é demonstrada pela confirmação visual da tintura distribuída ingualmente no compartimento pulmonar e pela recuperação da carga bacteriana. Nós demonstramos então como recuperar o Staphylococcus aureus viável (S. aureus) dos pulmões contaminados e descrever um método reprodutível para isolar o RNA do micróbio patogénico da alta qualidade.

Protocolo

Todos os métodos estão em conformidade com as diretrizes dos institutos nacionais de saúde e foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) na Universidade Estadual de Montana.

1. instilação intratraqueal

1. Prepare um espaço de trabalho contendo os seguintes suprimentos: uma plataforma de intubação, uma seringa estéril de 1 mL, pinça estéril com ponta sem corte, agulha estéril de 21 gauge e dois tubos cônicos para armazenar a seringa e o fórceps.
   Nota: as plataformas de intubação podem ser adquiridas comercialmente ou construídas em casa. A plataforma da intubação usada aqui foi construída usando o plexiglass de 0,25 polegadas. Momentaneamente, o calor foi aplicado ao plexiglass e a placa é dobrada a um ângulo interior aproximado de 65 °. No lado exterior da plataforma da intubação, dois parafusos da máquina foram semeados 3 polegadas distante e uma borracha-faixa foi suspendida entre os dois parafusos.
2. Prepare o iníbulo do patógeno por serialmente diluindo a amostra para que a concentração final desejada seja obtida em um volume total de 50 μL. Guarde o iníbulo no gelo.
3. Vestindo luvas estéreis, dobre uma agulha de 21 G Blunt-derrubado a aproximadamente 35 °.
   Nota: é necessária uma agulha separada para cada rato.
4. Fixe a agulha com ponta romba de 21 G dobrada a uma seringa de 1 mL. Desenhe uma almofada de ar de 100 μL na seringa seguida de 50 μL do agente infeccioso. Coloque a agulha e a seringa carregadas numa localização facilmente acessível pela mão dominante.
5. Anestesie profundamente um rato usando uma mistura de isoflurano/oxigênio a 4% ou um método de anestesia similar aprovado pelo IACUC. A profundidade apropriada da anestesia é obtida tipicamente quando as taxas da respiração retardam a aproximadamente 1 inalação por 5 – 8 s e podem ser confirmadas apertando um apêndice e não observando nenhuma reação do rato.
   Nota: Este método de anestesia proporcionou uma duração de anestesização suficiente de aproximadamente 1,5 min. Isto foi suficiente para que os membros do nosso laboratório aprendessem e realizem este procedimento de instilação; Entretanto^{, outrosmétodos de anestesia}institucionalmente aprovados podem ser empregados^11,12,13.
6. Retire o rato anestesiado da câmara de anestesia e suspenda o rato na plataforma de intubação dos incisivos superiores.
7. Para abrir uma passagem desobstruída na traquéia, use o fórceps Blunt-derrubado para agarrar delicadamente e estender a lingüeta fora da boca. Transfira a língua da pinça para o polegar e o dedo indicador da mão não dominante.
8. Permaneça segurando a língua na mão não dominante e pegue a seringa pré-carregada. Aponte a extremidade dobrada da agulha para longe do corpo e insira a agulha na cavidade oral na base da língua.
9. Com a agulha na base da língua, suavemente o ângulo do pulso para causar um ligeiro impulso da agulha longe do corpo. Este passo assegura que a agulha será inserida na traquéia e não no esôfago.
10. Lentamente guiar a agulha para baixo na traquéia; muitas vezes um ligeiro carrapato é sentida como a agulha passa através da prega vocal. Passe a agulha pela traquéia até que a resistência leve seja sentida à medida que a agulha encontra a Carina.
11. Levante ligeiramente a agulha na direção proximal para suspender a agulha acima da Carina. Isto permite a entrega nos dois brônquios primários. Pressione totalmente o êmbolo da seringa para entregar a carga infecciosa. Retire a agulha da traquéia levantando para cima e descarte.
12. Retire o mouse da plataforma de intubação pressionando a faixa de borracha, mas mantenha segurando o mouse em uma posição vertical. Obstrua as vias respiratórias nasais colocando um dedo diretamente sobre as Nares. Segure esta posição por aproximadamente 1 min ou até que várias respires profundas sejam observadas.
    Nota: esta última etapa assegura-se de que o volume total do inônio esteja entregado no intervalo respiratório mais baixo.
13. Retorne o rato a sua gaiola e observe uma recuperação completa da anestesia.

2. excisão de pulmões infectados

1. Trabalhando dentro de um exaustor do fluxo laminar para manter a esterilidade, prepare um espaço de trabalho com os seguintes artigos: uma escala e um barco estéril do pesar, uma plataforma da dissecção, um jogo da dissecção que contem tesouras e fórceps, PBS RNAse-livre estéril, e gaze estéril.
2. Eutanizar um rato infectado com CO₂ ou similar IACUC método aprovado de eutanásia.
3. Coloque um mouse infectado em uma plataforma de dissecção e fixe o mouse usando pinos no final de cada apêndice. Pulverize o rato com etanol para ajudar a manter a esterilidade das superfícies de trabalho.
4. Começando no umbigo, use um par de fórceps para levantar a pele e fazer uma incisão até a base da traquéia. Agarrando a pele em ambos os lados da incisão inicial, puxe a pele para longe do corpo e corte através das conexões do tecido.
   Nota: pode ser útil fazer diversos cortes laterais através da pele para revelar mais da região torácica.
5. A partir da base do processo xifóide, faça uma pequena incisão com a intenção de perfurar o diafragma. Isso resulta em um aumento na pressão na cavidade torácica que faz com que os pulmões para retrair. Com os pulmões retraído continuar a incisão para libertar o diafragma.
6. Retire as costelas fazendo uma incisão ao longo de ambos os lados da caixa torácica. Isto irá expor totalmente a cavidade torácica e os pulmões.
7. Para extirpar os pulmões, segure a base do coração com o fórceps e levante para cima. Coloc a tesoura atrás dos pulmões e comece a fazer incisões pequenas através das conexões do tecido ao continuar ao elevador o coração para cima.
8. Uma vez que os pulmões foram extirpado, coloque-os sobre a gaze estéril e retire o coração. O coração pode facilmente ser removido levantando o afastado dos pulmões com o fórceps e cortando as conexões restantes do tecido.
9. Transfira os pulmões para um barco de pesagem pré-encerado e registre o peso.
10. Após os pulmões terem sido pesados, transfira-os para solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) e armazene-os temporariamente no gelo até avançar para as etapas de recuperação e análise do patógeno.

3. análise e recuperação de patógenos

1. Continuando a trabalhar dentro de uma capa de fluxo laminar, prepare um espaço de trabalho com as seguintes fontes: um moedor do tecido, PBS RNAse-livre estéril, tampão RLT suplementado com o ß-mercaptoethanol (1:100), e os tubos RNAse-livres do microcentrifugador de 1,5 mL.
   PRECAUÇÃO: o ß-Mercaptoetanol pode ser perigoso no caso de contacto com a pele, ingestão, contacto com os olhos ou inalação. A diluição do ß-Mercaptoetanol no tampão RLT deve ser feita em uma capa das emanações.
2. Comece adicionando primeiramente 1 mL de PBS RNAse-livre estéril ao moedor do tecido. Uma vez preenchido, guarde o moedor de tecido no gelo.
3. Prepare uma série de tubos de diluição de série RNAse-livres estéreis que serão usados para quantificar a carga bacteriana recuperada dos pulmões contaminados. Isto é conseguido mais facilmente alicitando 900 μL da água estéril em cada tubo do microcentrifugador seguido pela diluição de série do iníbulo do micróbio patogénico.
   Nota: o número de tubos de diluição necessários para a enumeração precisa do patógeno variará na entrada do patógeno inicial e na duração da infecção. Isto deve ser empiricamente determinado.
4. Usando o fórceps estéril, transfira os pulmões no moedor preparado do tecido e Homogeneize completamente o tecido pressionando para baixo no suporte ao girar.
5. Abra o moedor de tecido e a alíquota 100 μL da amostra homogeneizada no primeiro dos tubos de diluição série preparados. Serialmente diluir as amostras e enumerar CFUs por chapeamento no ágar nutriente. O CFUs pode ser registrado como CFUs/mL ou CFUs/mL/mg de tecido pulmonar.
   Nota: nesta etapa um adicional 200 μL da amostra homogeneizada pode ser removido para a purificação do RNA viral (veja a tabela de materiais) ou armazenado em-80 ° c para a análise futura.
6. Depois que as alíquotas foram removidas para a determinação de CFU e/ou o isolamento viral do RNA, substitua o suporte de moedura e pellet o tecido homogeneizado pela centrifugação em 4.000 rpm (3724 x g) por 10 minutos em 4 ° c.
7. Usando uma pipeta, retire o sobrenadante da amostra peletizada e coloque-o em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   Nota: o sobrenadante está livre de bactérias e pode ser armazenado em-80 ° c para análise de hospedeiro solúvel e fatores de patógenos secretados.
8. Ressuscitar o pellet tecido homogeneizado por pipetagem ou vortexing em 700 μL de tampão RLT-ß-Mercaptoetanol e transferir a amostra para um tubo de microcentrífuga estéril 1,5 mL RNAse-livre.
   Nota: neste ponto, as amostras podem ser armazenadas em-80 ° c durante vários meses.
9. Purify o RNA usando modificações ligeiras ao protocolo do fabricante de um jogo da purificação (veja a tabela de materiais); Ver Voyich et al. 2008¹⁴.
   1. Transfira a pasta pulmonar homogeneizada para um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo grânulos de sílica de 0,1 mm e processados através de um batedor de esferas por 20 s a 6 m/s.
   2. Centrifugue a amostra em 1.500 RPM por 3 minutos. Após a centrifugação, pipeta o sobrenadante em novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   3. Adicione 350 μL de 96% – 100% de etanol à amostra e misture completamente com pipetagem ou inversão.
   4. Transferir 700 μL da amostra para uma coluna de purificação colocada num tubo de recolha de 2 mL. Centrifugue a amostra a ≥ 8.000 x g por 15 s e descarte o fluxo. Execute qualquer amostra em excesso pela mesma coluna descrita acima.
   5. Lave a coluna com 700 μL de tampão RW1 e Centrifugue a amostra a ≥ 8.000 x g durante 15 s. elimine o fluxo e transfira a coluna de membrana de sílica para um novo tubo de recolha de 2 ml.
   6. Aplique 500 μL do buffer RPE à coluna. Lave a coluna por centrifugação a ≥ 8.000 x g durante 15 s. descarte o fluxo.
   7. Aplique um adicional de 500 μL de tampão RPE na coluna RNeasy e Centrifugue a 8.000 x g durante 2 min. descarte o fluxo e Centrifugue a coluna a ≥ 10.000 x g durante 1 min.
   8. Para Eluir o RNA purified, comece transferindo a coluna a um tubo novo do microcentrifugador de 1,5 ml RNase-livre. Pipetar 50 μL de água RNase-Free directamente sobre a membrana de sílica-gel da coluna e centrifugar a ≥ 8000 x g durante 1 min.
      Nota: o RNA eluída pode ser funcionado sobre a mesma coluna outra vez para aumentar o rendimento do RNA.
   9. Adicionar 50 μL de água livre de RNase ao RNA purificado para trazer o volume total para 100 μL. alíquota 350 μL de RLT-ß-Mercaptoetanol seguido de 250 μL de 96% – 100% de etanol para a amostra e misture cuidadosamente por pipetagem ou inversão.
   10. Aplique a amostra numa coluna de purificação colocada num tubo de recolha e Centrifugue a ≥ 8000 x g durante 15 s. elimine o fluxo e substitua o tubo de recolha.
   11. Lave a coluna adicionando 350 μL de tampão RW1 seguido de centrifugação a ≥ 8000 x g por 15 s.
   12. Prepare uma solução de DNase contendo aproximadamente 27 unidades Kunitz adicionando 10 μL de estoque de DNase (750 unidades Kunitz/mL) a 70 μL de RDD de buffer. Adicionar 80 μL de solução de DNase directamente sobre a membrana de sílica-gel e incubar a amostra durante 15 min à temperatura ambiente.
   13. Lave a coluna com 350 μL de tampão RW1 e Centrifugue a ≥ 8000 x g durante 15 s e elimine o fluxo.
   14. Repita os passos 3.9.6 – 3.9.8 para purificar o RNA.
       Nota: recomenda-se repetir o procedimento de limpeza do RNA seguindo os passos 3.9.9 – 3.9.10 e 3.9.6 – 3.9.8 (saltar DNase Steps 3.9.11 – 3.9.13). Esta limpeza adicional resulta em RNA de alta qualidade.
10. O rendimento de RNA pode ser quantificado usando um espectrofotômetro com leituras a 260 nM para determinar a concentração e 260:280 nM para a pureza. Após a obtenção do rendimento de RNA, padronize a concentração de cada amostra de RNA para 50 ng/μL.
    Nota: recomenda-se fazer alíquotas múltiplas em uma concentração de 50 ng/μL para evitar ciclos de congelamento/descongelação que podem levar à degradação do RNA.
11. Armazene o RNA purificado em-80 ° c ou use-o imediatamente para a análise do transcrito.
    Nota: em publicações anteriores, o RNA de 3 a 5 camundongos foi agrupada para análise de transcrição. Através da otimização da técnica acima, o RNA de 1 rato foi empiricamente determinado como suficiente para a análise de transcrição (80 – 120 ng/μL).

Resultados

A Figura 1 utiliza uma solução azul brilhante de 0,1% de peso/volume Coomassie para demonstrar que uma instilação intratraqueal entrega o inoculante diretamente e uniformemente dentro do trato respiratório inferior. A Figura 2 mostra que as bactérias (S. aureus) cfus recuperaram diretamente do tecido pulmonar homogeneizado. A Figura 3 demonstra o uso desse sistema para a entrega precisa e recuperação do intrato respiratório inferior, traçando o cfus de entrada e recuperação de camundongos individuais. A Figura 4 mostra a curva de amplificação qRT-PCR do gene de limpeza bacteriana gyrb para demonstrar que o RNA bacteriano pode ser extraído diretamente do tecido pulmonar infectado com a contaminação mínima do DNA. A Figura 5 mostra a construção de uma curva padrão usando a amplificação de qRT-PCR do vírus da influenza a-segmento M para demonstrar que o RNA viral pode ser extraído diretamente do tecido pulmonar infectado.

Figura 1: a instilação intratraqueal permite a distribuição uniforme no trato respiratório inferior. (A, B) Os pulmões não infectados foram extirpado de um rato saudável após instilação intratraqueal de PBS estéril e fotografado a partir de (a) dorsal e (B) perspectivas ventrais. (C, D) 50 μL de a 0,1% Coomassie a solução azul brilhante foi administrada a um rato anestesiado através da administração intratraqueal. (C) dorsal. (D) ventral. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: recuperação representativa de CFUs bacterianos de homogeneatos pulmonares infectados. Os pulmões foram extirpado um dia após o desafio com S. aureus. Após a homogeneização, 100 μL da pasta pulmonar foram diluídos serialmente através de 10^-6. Para enumerar os CFUs recuperados, 10 μL de gotas foram chapeadas das diluições 10^-5 e 10^-6 no agar tripótico de soja (TSA) e incubadas a 37 ° c com 5% C0₂ durante a noite. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: fornecimento e recuperação precisos do inoculador do patógeno após administração intratraqueal. Os camundongos foram divididos em dois grupos contendo três camundongos por grupo. Camundongos foram submetidos à instilação intratraqueal de S. aureus em 1 x 10⁸ (baixo) e 2 x 10⁸ (alto) CFU/ml. Uma hora após a infecção, camundongos foram eutanasiados e os pulmões foram extirpado para demonstrar a precisão da instilação e recuperação. O iníbulo bacteriano e as bactérias recuperados do homogeneizado do pulmão foram chapeados em TSA (Agar triptic da soja). Não foram relatadas diferenças significativas entre a entrada e a recuperação bacteriana. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: recuperação e pureza representativas do RNA bacteriano. Seis horas após a instilação intratraqueal com 1 x 10⁸ UFC/50 ΜL de S. aureus, camundongos foram eutanasiados. Os pulmões foram extirpados e homogeneizados seguidos de ressuspensão da pasta pulmonar em tampão RLT-ß-Mercaptoetanol. O RNA foi purificado conforme descrito na etapa 3,9¹⁴. o qRT-PCR foi usado para detectar transcritos do gene de limpeza bacteriano Gyrb. Um controle que não contenha transcriptase reversa (nRT) foi incluído para demonstrar a pureza do RNA recuperado. Em um limiar de 0,1, os transcritos de Gyrb foram detectados em um ciclo médio de 21,1, de 20,3, e de 20,5. os controles nRT não foram detectados até as médias do ciclo 35,9, 35,5 e 35,0. n = 3 repetições biológicas, contendo 3 repetições técnicas/replicações biológicas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: recuperação do RNA viral representativo. Seis dias após A instilação intratraqueal com 100 PFU/50 μL de influenza A/PR/8/1934 (H1N1), camundongos foram eutanasiados. Os pulmões foram excisados e homogeneizados, e 200 μL da pasta homogeneizada foram coletados e passados através de um filtro de células de 70 μm antes da purificação do RNA viral. O RNA purificado foi diluído em série (10^-1-10^-4) seguido de amplificação do segmento de influenza A M. (A) parcela de amplificação do RNA influenza a recuperada de um pulmão infectado e diluída 10^-1– 10^-4. (B) curva padrão do segmento de influenza A M. Limiar = 0,2, R² = 0,994, inclinação =-3,46. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O uso deste modelo fornece um método altamente eficiente e reprodutível para estudar infecções bacterianas secundárias. A habilidade de controlar firmemente a entrega do inóculos do micróbio patogénico permite umas observações mais precisas dos efeitos individuais e combinatória de cada micróbio patogénico. As ineficiências na via de instilação intranasal mais comum provavelmente contribuíram para as discrepâncias nos volumes de dose e nas concentrações presentes na literatura. É razoável que a falta de um sistema murino preciso para estudar pneumonia bacteriana secundária tenha atrasado os achados identificando respostas bacterianas específicas que contribuem para a severidade das coinfecções pulmonares. Desenvolver um modelo reprodutível para estudar a expressão da virulência durante infecções bacterianas secundárias poderia conduzir à identificação de alvos da vacina ou da droga para amenizar estas infecções.

A etapa intratraqueal da instilação é crítica para estabelecer com sucesso uma infecção mais baixa do intervalo respiratório e toda a análise do baixo-córrego dos micróbios patogénicos. Ao aprender esta técnica, pode ser útil praticar usando um corante (como descrito nos métodos) antes de administrar o material infeccioso. Usar um corante permite a visualização direta do inuso no trato respiratório. Um erro comum que possa ocorrer é a inserção da Blunt-agulha no esófago um pouco do que a traqueia. Isso resultará na entrega do inóculo no estômago, em vez dos pulmões. Para corrigir este erro, o ângulo da agulha mais longe do corpo e passá-lo para baixo na traquéia. Uma vez dominado, este procedimento é muito eficiente e pode ser usado para realizar experimentos com um grande número de ratos. Trabalhando em lotes para anestesiar camundongos, a instilação intratraqueal pode ser concluída em aproximadamente 30 segundos por mouse. Além disso, a excisão dos pulmões pode ser concluída em 2 a 3 minutos por mouse.

A recuperação do RNA bacteriano viável e puro dos tecidos contaminados é crítica para a análise do transcrito. Os RNases são onipresentes e podem arruinar rapidamente um experimento¹⁵. Alguns métodos incluem o uso de inibidores de RNase; no entanto, descobrimos que o congelamento da amostra em-80 ° c em RLT-ß-Mercaptoetanol ou imediatamente o processamento da amostra para isolamento de RNA usando todos os tubos livres RNase e reagentes são eficazes na redução da contaminação por RNase. Adicionalmente, nós recomendamos que um máximo de seis amostras seja purificada ao mesmo tempo. Incluir mais de seis amostras pode resultar em latências prolongadas entre as etapas do protocolo que podem culminar na degradação do RNA. Uma vez purificada, o cuidado também deve ser tomado para evitar quaisquer ciclos de congelamento-Thaw desnecessários. Assim, se as análises múltiplas serão feitas em uma amostra, alicitando o RNA purified para o armazenamento em-80 ° c é recomendado.

Além das técnicas aqui revisadas, este método pode ser complementado pela realização de lavagem alveolar brônquica antes da excisão e homogeneização dos pulmões¹⁶. Isto pode ser conseguido pelo lavagem do intervalo respiratório mais baixo inteiro ou usando a linha da sutura para restringir um braço ramificando da árvore brônquica seguida pelo lavagem através da filial restante. Frequentemente isto conduz a uma redução na recuperação da carga do micróbio patogénico mas fornece uma amostra whereupon a informação tal como a atividade do desidrogenase do lactato, a identidade celular da população, e os perfis do citocinas podem ser obtidos¹⁶. Juntos, esses dados podem formar uma compreensão mais completa das interações do patógeno hospedeiro ocorridas durante a pneumonia bacteriana secundária.

Quando os métodos discutidos estiveram dentro do contexto da pneumonia bacteriana secundária, são apropriados ser estendidos a todo o modelo murino de uma mais baixa infecção respiratória; especificamente, aqueles que se beneficiariam da entrega e da recuperação firmemente controladas do inóculos instalado. Além disso, como muitas outras vias de infecção, a instilação intratraqueal pode ser utilizada em aplicações não infecciosas, como a administração de terapêutica e compostos ambientais¹².

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Matriz de lise B	MP Biomedicals	6911100	Referido no texto como "contas de sílica de 0,1 mm",
agulha romba de calibre 21	SAI	B21-150	1,5" é recomendado.
Conjunto de DNase livre de RNase	Qiagen	79254	DNase usado no texto que acompanha.
FastPrep-24 Classic Instrument	MP Biomedicals	116004500	FastPrep FP120 não está mais disponível. Referido no texto como "Bead Beater"
TaqMan AIV-Matrix Reagents	Applied Biosystems	4405543	Influenza A M-segment qRT-PCR kit.
Suporte de intubação	Kent Scientific	ETI-MES-01	Referido no texto como "plataforma de intubação". A plataforma de intubação usada no vídeo que acompanha foi feita internamente.
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	Kit de purificação de RNA; contém colunas RNeasy, Buffer RLT, Buffer RW1, e Buffer RPE
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904	Kit de purificação de RNA viral.
Moedores de Tecidos	Thermo Fisher Scientific	02-542-08
2-Mercaptoetanol (β-Mercaptoetanol)	Calbiochem	UN2966