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Avaliando a angiogênese terapêutica em um modelo murino de isquemia Retromembro

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DOI:

10.3791/59582

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8 de junho de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Cardiovascular da Universidade de Lisboa, Lisbon School of Medicine of the Universidade de Lisboa, 2Centro Hospitalar Universitário Lisboa Norte, 3Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa

Neste artigo

Resumo

Aqui, é apresentado um modelo experimental de isquemia do membro posterior crítico, seguido de uma bateria de testes funcionais, histológicos e moleculares para avaliar a efetividade das terapias angiogênicas.

Resumo

A isquemia crítica do membro (CLI) é uma condição séria que implique um risco elevado de uma amputação mais baixa do membro. Apesar da revascularização ser a terapia padrão-ouro, um número considerável de pacientes com CLI não é adequado para revascularização cirúrgica ou endovascular. As terapias angiogénicas estão emergindo como uma opção para estes pacientes mas estão atualmente ainda a investigação. Antes da aplicação em seres humanos, essas terapias devem ser testadas em modelos animais e seus mecanismos devem ser claramente compreendidos. Um modelo animal da isquemia do hindmembro (HLI) foi desenvolvido pela ligadura e pela excisão das artérias ilíacas e femoral externas longe do ponto de origem e das veias nos ratos. Um painel detalhado dos testes foi montado para avaliar os efeitos da isquemia e de terapias angiogênico putativo em níveis funcionais, histologic e moleculars. O laser Doppler foi utilizado para a mensuração do fluxo e avaliação funcional da perfusão. A resposta tecidual foi avaliada pela análise da densidade capilar após coloração com o anticorpo CD31 em cortes histológicos do músculo gastrocnêmio e pela mensuração da densidade de vasos colaterais após a diaphonização. A expressão de genes angiogênicos foi quantificada por RT-PCR visando fatores angiogênicos selecionados exclusivamente em células endoteliais (ECS) após microdissecção de captura a laser de músculos gastrocnêmio de camundongos. Esses métodos foram sensíveis na identificação de diferenças entre os membros isquêmicos e não isquêmicos e entre os membros tratados e não tratados. Este protocolo fornece um modelo reprodutível de CLI e uma estrutura para testar terapias angiogênico.

Introdução

A doença arterial periférica (PAD) acomete predominantemente os membros inferiores. A PAD é causada pela aterosclerose, uma obstrução da artéria que pode causar severa restrição ao fluxo sanguíneo nos membros inferiores1. A claudicação intermitente é a primeira manifestação da PAD e refere-se à dor muscular ao caminhar. A CLI é o estágio mais grave da PAD, sendo diagnosticada em pacientes que apresentam dor de repouso isquêmica, úlceras ou gangrena2. Pacientes com CLI apresentam alto risco de amputação, especialmente se não forem tratados3. A revascularização do membro inferior (seja por cirurgia aberta ou por procedimento endovascular) é atualmente a única maneira de conseguir o resgate dos membros. No entanto, cerca de 30% dos pacientes com CLI não são adequados para esses procedimentos, por razões que incluem a localização das lesões, o padrão de oclusão arterial e extensa comorbidade4,5. Portanto, novas terapias são necessárias para estes pacientes de outra forma intratáveis, com a promoção da angiogênese sendo a estratégia investigação mais intensa.

Antes de testar em seres humanos, a eficácia e segurança de novas terapias in vivo deve ser considerada em modelos animais. Vários modelos foram desenvolvidos para o estudo da CLI, principalmente por indução de isquemia do membro posterior (HLI) em camundongos6,7,8,9,10. No entanto, esses modelos diferem em vários aspectos, incluindo a natureza das artérias que são ligadas e/ou extirpada e se as veias e os nervos que cercam são dissecados também6,7,8, 9,10. Tomados em conjunto, esses aspectos afetarão a severidade da lesão de isquemia-reperfusão em cada animal, dificultando a comparação dos resultados. Portanto, é fundamental desenvolver um protocolo efetivo no qual o procedimento para induzir a isquemia e a avaliação de diferentes alvos deva ser padronizado para avaliar se uma determinada terapia angiogênica será efetiva. Um protocolo experimental destinado a abranger todos esses aspectos proporcionaria uma compreensão abrangente dos mecanismos pelos quais as terapias angiogênicas exercem seus efeitos e uma medida de sua eficácia em cada um de seus desfechos. Duas obras distintas recentemente publicadas por nossa equipe são um bom exemplo11,12, em que diferentes abordagens para induzir a angiogênese terapêutica foram avaliadas usando o mesmo protocolo que será descrito com mais detalhes neste Protocolo.

O objetivo geral deste protocolo é descrever um modelo experimental reprodutível que pode imitar os efeitos da CLI e estabelecer a base experimental para uma avaliação abrangente dos efeitos funcionais, histológicos e moleculares do putativo angiogênico Agentes.

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Protocolo

Todos os procedimentos em animais estão em conformidade com a diretiva 2010/63/UE e foram aprovados pelo organismo institucional de bem-estar animal e licenciados pela DGAV, a autoridade portuguesa competente para a protecção dos animais (número de licença 023861/2013)

Cuidado: diversos dos produtos químicos usados nos protocolos são tóxicos e prejudiciais. Por favor, use todas as práticas de segurança apropriadas e equipamentos de proteção individual (luvas, jaleco, calça de corpo inteiro e sapatos de dedo fechado)

1. o modelo murino de isquemia do membro posterior

Nota: todos os experimentos são realizados em ratos fêmeas de 22 semanas de idade C57BL/6.

  1. Preparação de soluções
    1. Preparação da solução anestésica
      Nota: esta combinação anestésica (medetomidina e cetamina) fornece até 30 min de imobilização e uma janela cirúrgica de 15 min. O efeito pode ser revertido pela administração de atipamezole.
      1. Com uma seringa limpa de 1cc, retire 1 mL de medetomidina (1 mg/kg de peso corporal), elimine as bolhas de ar para medições precisas e adicione-a a um tubo Falcon de 15 mL.
      2. Com uma seringa limpa de 1 cc, retire 0,75 mL de cetamina (75 mg/kg de peso corporal), elimine as bolhas de ar para medições precisas e adicione-a a um tubo Falcon de 15 mL contendo a medetomidina.
      3. Adicionar 8,25 mL de soro fisiológico estéril (0,9% NaCl), a fim de obter 10 mL de solução anestésica.
      4. Identifique o tubo com o nome dos compostos, a data misturada e a data de expiração.
      5. Conservar no escuro a 4 ° c.
    2. Preparação da solução antisedativa
      1. Com uma seringa limpa de 1 cc, retire 1 mL de atipamezol (5 mg/kg de peso corporal), elimine as bolhas de ar para medições precisas e adicione-a a um tubo Falcon de 15 mL.
      2. Adicionar 9 mL de soro fisiológico estéril (0,9% NaCl), a fim de obter 10 mL de solução de reversão.
      3. Identifique o tubo com o nome dos compostos, a data misturada e a data de expiração.
      4. Conservar no escuro a 4 ° c.
    3. Preparação da solução de analgesia pós-operatória
      1. Com uma seringa limpa de 1 cc, retire 0,5 mL de buprenorfina (100 μL/15-30 g de peso corporal), elimine as bolhas de ar para medições precisas e adicione-a a um tubo Falcon de 15 mL.
      2. Adicionar 9,5 mL de soro fisiológico estéril (0,9% NaCl), a fim de obter 10 mL de solução de analgesia.
      3. Identifique o tubo com o nome dos compostos, a data misturada e a data de expiração.
      4. Conservar no escuro a 4 ° c.
  2. Indução cirúrgica da isquemia do membro posterior
    1. Ferramentas cirúrgicas necessárias para esta intervenção: pinça pontiaguda, tesoura de mola, suporte de agulha oftálmico, tesoura cirúrgica e suporte de agulha. Esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas em autoclave antes de usar. Use cotonetes de algodão para a dissecção de gordura subcutânea.
    2. Carregue a seringa com a solução anestésica antes de segurar o rato.
    3. Contenha o animal aplicando a força atrás de suas orelhas contra a grade da gaiola, segurando o máximo de pele possível para manter o mouse imóvel.
    4. Mantenha o animal inclinado com a cabeça abaixada e realize uma injeção intraperitoneal da solução anestésica, mantendo a seringa em um ângulo de 45 ° com o corpo do mouse.
    5. Verifique a ausência de reflexos de retirada do pedal, para avaliar a profundidade da anestesia.
    6. Retire o cabelo do membro posterior direito usando um barbeador elétrico. Use um sabonete desinfetante de clorexidina para preparação da pele. Use uma toalha de papel limpa para remover os Suds. Aplique uma esfoliação cirúrgica de clorexidina e proteja a área da pele com um drapejar estéril antes de transportar os camundongos para a suíte cirúrgica estéril.
    7. Coloque o animal em decúbito dorsal e contenha-o com os quatro membros espalhados e fixados com fita adesiva.
      Cuidado: realize o procedimento em uma almofada aquecida para manter a temperatura do corpo do animal estável; o procedimento cirúrgico é realizado usando um microscópio de dissecção a uma ampliação de 10x ou 20x.
    8. Aplique uma solução antisséptica de clorexidina usando gaze estéril para finalizar a preparação da pele. Usando uma lâmina cirúrgica do bisturi do número 11 realize uma incisão da pele de 1 cm que sobrejacente a coxa do hindmembro direito.
    9. Gordura subcutaneous dissecar Blunt que expõe o pacote neurovascular. Usando o fórceps pointed, as tesouras da mola e o suporte oftálmica da agulha, abrem a bainha Ilio-femoral membranous para expor os vasos ilíaco e femoral externos longe do ponto de origem.
    10. Dissecar e separar os vasos (artéria e veia) do nervo. Usando uma sutura não-absorvível do polipropileno 7,0 ligadura a artéria ilíaca externa e a veia longe do ponto de origem e a artéria e a veia femoral longe do ponto de origem.
    11. Transect o segmento da artéria e das veias Ilio-femoral entre os nós longe do ponto de origem e os proximal com as tesouras da mola.
    12. Feche a incisão com uma sutura absorvível (por exemplo, 5,0 sutura Vicryl).
    13. Coloque a seringa com a solução antisedativa e use o mesmo método detalhado em 1.2.3 e 1.2.4 para realizar uma injeção intraperitoneal da solução antisedativa.
  3. Monitorização pós-operatória
    Nota: os animais são cuidadosamente observados a cada 15-20 min para garantir que todos os animais se recuperem bem do antisedativo; animais anestesiados nunca são deixados sem vigilância.
    1. Avaliar a recuperação da anestesia: 1) monitorar a taxa e a profundidade da respiração; 2) avaliar reflexos animais (pedal e posição do olho)
    2. Realize uma injeção subcutânea da analgesia pós-operatória a cada 8-12 h.
    3. Monitore os animais diariamente após a cirurgia registrando uma breve descrição do estado de saúde do animal e da aparência do local da cirurgia, assegure-se de que todas as suturas estejam fechadas.
    4. Re-sutura da incisão, se a deiscência ocorre. Se não tiver êxito, aplique uma película de barreira cutânea na incisão para proteger da urina, excreções fecais, atrito e cisalhamento da pele e para ajudar o processo de cicatrização.

2. avaliação do efeito angiogênico

Nota: após a indução da isquemia, aplique o agente terapêutico no estudo e consiga os seguintes procedimentos. As etapas empreendidas em outros pontos do tempo são detalhadas a seção correspondente.

  1. Imagem latente da perfusão do laser Doppler
    1. Retire o cabelo de ambos os membros posteriores um dia antes da análise usando um barbeador elétrico seguido de creme depilatório.
    2. Anestesie os camundongos utilizando a solução anestésica.
    3. Coloque o animal numa almofada de aquecimento de 37 ° c durante 5 min para garantir que a temperatura não mudará durante o procedimento
    4. Coloque o animal na posição supina com as pernas fixadas em uma posição estendida. Medir a distância entre as pernas direita e esquerda e os pés para cada animal, uma vez que o posicionamento do animal deve ser semelhante sempre que o procedimento deve ser repetido, a fim de acompanhar as alterações na perfusão do membro posterior ao longo do tempo.
    5. Comece adquirindo dados usando um Imager da perfusão do laser Doppler.
    6. Após a conclusão da aquisição, reverter a anestesia com a solução antisedativa.
    7. Abra o software de análise de imagem e desenhe a região de interesse (ROI) em torno do membro posterior isquêmico e um ROI comparável em torno do membro posterior não isquêmico.
    8. Observar os valores de fluxo e determinar a perfusão como uma proporção da perfusão no membro isquêmico para o membro não isquêmico. As alterações na relação de perfusão são medidas ao longo do tempo.
  2. Análise de imunohistoquímica e densidade capilar
    1. Após anestesia, Sacrifique os camundongos por luxação cervical.
    2. Para colher os músculos gastrocnêmio de ambas as pernas, primeiro, retire a pele de ambos os membros posteriores.
    3. Identifique o tendão de Aquiles e separe o tendão do osso usando um bisturi de 11 lâminas.
    4. Segure o tendão de Aquiles e separe o músculo da tíbia e fíbula até a articulação do joelho com tesoura de mola.
    5. Separe o bíceps femoral do músculo gastrocnêmio.
    6. Use tesouras de mola para cortar as inserções dos músculos gastrocnêmio no nível da articulação do joelho.
    7. Coloque os músculos gastrocnêmio colhidas em uma orientação transversal em um pequeno disco de cortiça com a ajuda de 10% tragacanto.
    8. Congelar os espécimes em isopentano líquido refrigerado a nitrogênio e armazená-los em-80 ° c até o corte.
    9. Corte 7 μm seções dos espécimes musculares em um criostat e montagem em lâminas de vidro.
      Observação: o protocolo pode ser pausado aqui.
    10. Fixar as lâminas de vidro em uma garrafa contendo acetona pura arrefecida (aproximadamente 50 mL) por 10 min, a-20 ° c.
    11. Adicionar hidrogênio peroxidase 0,3% diluído em metanol (50 mL) por 30 min à temperatura ambiente.
    12. Lave duas vezes em solução salina tampão fosfato (PBS) (50 mL) para um total de 10 min.
    13. Use uma caneta hidrofóbica ao redor das seções.
      Nota: o uso de uma caneta hidrofóbica permite reduzir a quantidade de soluções gastas durante o protocolo. Para todas as incubações use 100 μL de todas as soluções, por seção.
    14. Aplique uma solução de bloqueio de 5% de soro de coelho em PBS por 30 min à temperatura ambiente.
    15. Incubar os espécimes por 1 h à temperatura ambiente com anticorpo monoclonal de rato CD31 diluído em 1:500 em 1% de albumina sérica bovina (BSA) em PBS.
    16. Lave três vezes em PBS durante um total de 30 min.
    17. Adicionar um secundário biotinylated coelho anticorpo IgG anti-Rat em 1:200 em 1% BSA em PBS e 5% de soro de coelho para 30 min à temperatura ambiente.
    18. Lave em PBS como antes e adicione o complexo rotulado de peroxidase avidina-conjugado por 30 min à temperatura ambiente.
    19. Enxague 3 vezes em PBS durante 5 min e adicione o kit de substrato de peroxidase de diaminobenzidina (DAB) por mais 5 min.
    20. Contratura as secções com hematoxilina por 10 s antes da montagem.
    21. Meça as densidades capilares usando um microscópio de brightfield ereto (isto é, número de capilares por o número de myocytes) em 2 seções diferentes de 4 áreas anatômicas distintas em cada espécime.
  3. Perfusão do agente de contraste
    1. Anestesie os camundongos utilizando a solução anestésica.
    2. Realize uma laparotomia mediana usando uma lâmina de bisturi número 15.
    3. Expor a aorta abdominal e a veia cava caudal, após retrar lateralmente o intestino delgado e usar tesouras de mola.
    4. Insira o cateter 1 26-Gauge cranialmente na aorta abdominal e outro na veia cava caudal na mesma direção.
    5. Fixe cateteres no lugar usando uma sutura de seda 5/0 para executar uma sutura da estada.
    6. Lave o sistema vascular com uma solução salina de 37 ° c contendo heparina (500 unidades/100 mL) empurrada para a aorta abdominal usando uma seringa de 10 mL. Continue a perfusão suave até que uma solução clara seja vista saindo do cateter colocado dentro da veia cava caudal.
      Nota: geralmente 30 a 40 mL de uma solução salina heparinizada são necessários para enxaguar o sistema vascular de um rato adulto.
    7. Administrar uma mistura de adenosina (1 mg/L) e papaverina (4 mg/L) durante 2 min.
    8. Injete no cateter aórtico 10 mL de uma mistura de 50% de sulfato de bário e 5% de gelatina.
      Nota: a solução deve ser mantida a 60 ° c para evitar espessamento.
    9. Deixe os camundongos a-4 ° c por pelo menos 4 h, a fim de permitir que o elenco vascular solidifique.
    10. Retire a pele do corpo inferior de cada rato.
  4. Diaphonization - técnica de Spalteholz
    1. Fixar os camundongos por imersão em uma solução de formaldeído a 10% por pelo menos 72 h.
    2. Bleach os camundongos por imersão em uma solução de peróxido de hidrogênio a 30% para 24 h.
    3. Deshidratar os camundongos usando a técnica de substituição de congelamento. Esta metodologia consiste em submeter os camundongos a passagens sucessivas (em média quatro) de acetona pura a-20 ° c por 24 h cada.
    4. Esclarecer os camundongos por imersão em uma solução contendo uma mistura de 100% benzoato de benzilo e 100% salicilato de metilo em uma proporção de 3:5 (esta mistura também é conhecida como solução de Spalteholz) 13.
    5. Deixe os ratos imersos na solução de Spalteholz dentro de uma câmara de vácuo até que se torne Diaphanous, que toma geralmente 5 a 7 dias.
    6. Substitua a solução, se escurecer antes que o espécime se torne desobstruído.
  5. Quantificação dos vasos colaterais
    1. Observe os camundongos suspensos na solução de Spalteholz transiluminação usando um microscópio estereotódico. Use fórceps de microcirurgia para agarrar e movê-lo suavemente.
    2. Fotografe os membros inteiros usando uma câmera digital conectada ao microscópio.
    3. Obtenha fotografias inteiras do membro usando o software apropriado.
    4. Realize uma segmentação manual dos vasos colaterais, destacando-os usando o software apropriado.
      Nota: os vasos colaterais são definidos de acordo com a definição de Longland, uma haste definida, zona média e reentrante, com diâmetro entre 20 e 300 μm, excluindo as artérias femoral, safena e poplítea e todas as estruturas venosas.
    5. Definir ROIs em cada rato na mesma região anatômica no adutor, circunvizinho e abaixo da oclusão cirúrgica.
    6. Quantificar a densidade do vaso colateral (DCV) em ROIs equivalentes correspondendo a 20% da área total do membro. A DCV é calculada como a razão entre a área vascular e as áreas de ROIs. Todas as medições de densidade são executadas usando o software ImageJ.
      Nota: presume-se que o valor CVD do membro não isquêmico para cada camundongo corresponda a 100% para excluir variações nos procedimentos de anatomia, perfusão ou diaphonização. A porcentagem de DCV no membro isquêmico foi, portanto, calculada em relação à não isquêmica.
    7. Determinar a porcentagem de aumento da DCV como a diferença entre o percentual de DCV entre os membros isquêmicos e não isquêmicos.
  6. Microdissecção da captação do laser dos capilares
    1. Após anestesia, Sacrifique os camundongos por luxação cervical.
    2. Para colher os músculos gastrocnêmio de ambas as pernas, retire a pele dos camundongos ambos os membros posteriores.
    3. Identifique o tendão de Aquiles e separe o tendão do osso usando um bisturi de 11 lâminas.
    4. Segure o tendão de Aquiles e separe o músculo da tíbia e fíbula até a articulação do joelho com tesoura de mola.
    5. Separe o bíceps femoral do músculo gastrocnêmio.
    6. Use tesouras de mola para cortar as inserções dos músculos gastrocnêmio no nível da articulação do joelho.
    7. Coloque os músculos gastrocnêmio colhidas em uma orientação transversal em um pequeno disco de cortiça com a ajuda de 10% tragacanto.
    8. Congelar os espécimes em isopentano líquido refrigerado a nitrogênio e armazená-los em-80 ° c até o corte.
    9. Corte em um criostat 12 μm seções dos espécimes musculares e montagem em lâminas de vidro.
      Nota: para a proteção do RNA tome um slide pré-arrefecido e toque no verso do slide com o dedo (luvas) para aquecer apenas a região para colocar a seção. Seção de transferência da faca do criostat tocando com a área aquecida e seque a-20 ° c no criostat para 2-3 min. O protocolo pode ser pausado aqui.
      1. Fixe as lâminas de vidro numa garrafa contendo acetona pura arrefecida (aproximadamente 50 mL) durante 5 min a-20 ° c e seque-as com ar.
      2. Use uma caneta hidrofóbica ao redor das seções.
        Nota: o uso da caneta hidrofóbica ajuda na redução da quantidade de soluções gastas durante o protocolo. Para todas as incubações use 100 μL de todas as soluções, por seção.
      3. Hidratar com 2 M de NaCl/PBS a 4 ° c e incubar os espécimes durante a noite a 4 ° c com anticorpo monoclonal de rato CD31 a 1:500 em 2M NaCl/PBS.
      4. Lave duas vezes em 2M NaCl/PBS para um total de 6 min.
      5. Adicione um anticorpo de IgG anti-rato biotinylated secundário do coelho em 1:200 em 2M NaCl/PBS e no soro do coelho de 5% por 30 minutos em 4 ° c.
      6. Lave em 2 M NaCl/PBS como antes e adicione o complexo rotulado de peroxidase avidina-conjugado por 30 min a 4 ° c.
      7. Enxágüe e adicione o kit de substrato de peroxidase DAB por 5 min.
      8. Desidratar as secções no gelo-frio 90% etanol seguido por 100% etanol e deixá-los a secar.
      9. Dissect 10 000 capilares por camundongos usando um sistema de microdissecção a laser equipado com um laser de estado sólido pulsado 355 NM e catapulta os capilares dissecados em um tubo de microcentrífuga adesivo-tampão.
  7. Extração de RNA, síntese de cDNA, pré-amplificação e RT-PCR
    1. Isole o RNA total dos capilares microdissecados usando um kit apropriado, o RNA total obtido é entre 1,5-3 ng/μL.
    2. Use um kit de síntese de cDNA para síntese e duas rodadas de pré-amplificação, utilizando os primers descritos na tabela 1.
    3. Execute RT-PCR para os mesmos alvos descritos na etapa anterior. Use um programa que consiste em uma etapa inicial da desnaturação em 95 ° c por 10 minutos, seguida por 50 ciclos em 95 ° c para 15 s e em 60 ° c por 1 minuto.

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Resultados

Usando o protocolo descrito, as pilhas de haste mesenquimais do cabo de cordão umbilical e a radiação ionizante da baixo-dose (ldir) foram testadas como terapias angiogénicas putativo 11,12. As leituras da perfusão do laser Doppler foram obtidas antes da indução da isquemia e em temporais pré-especificados que variam de imediatamente após a indução da isquemia a 45 dias após a isquemia. As leituras de perfusão tecidual por Doppler laser foram registradas como ima...

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Discussão

Os modelos de Murine de CLI consistiram na maior parte na ligadura da artéria femoral apenas distal à origem do femoral do profunda 4,5,6,7,8,9. Isto demonstrou deixar intacta a maior parte da circulação colateral, o que restaura o fluxo sanguíneo para o membro no prazo de 7 dias 9. A remoção da cama c...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a José Rino e Tânia carvalho, chefes da unidade de Bioimagem e histologia e laboratório de patologia comparativa do Instituto de medicina molecular João Lobo Antunes, respectivamente. Agradecemos também Vyacheslav Sushchyk do departamento de anatomia da nova Medical School/Faculdade de ciências médicas, Universidade Nova de Lisboa.

Referência de financiamento: projeto financiado pela UID/IC/0306/2016 Fundação para a ciência e a tecnologia. Paula de Oliveira é apoiada por uma bolsa de estudos (SFRH/BD/80483/2011) da Fundação para a ciência e tecnologia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
7500 PCR rápido em tempo realaplicado
AcetonaMerk1000141000reagente; Cuidado - altamente inflamável
ReagenteadenosinaValdepharm
AtipamezoleOrionPharmaReagente
Sulfato de bário (Micropaque)Guebert8671404 (ref. Infarmed)Reagente
BuprenorfinaRichterPharmaReagente
Carl Zeiss Opmi-1 FCMicroscopia Carl Zeiss, AlemanhaInstrumento
cDNA RT2 PreAMP kit de síntese de cDNAQiagen7335730Reagente
Cryostat Leica CMLeica Microsystems3050S
Instrumento DAB kit de substrato de peroxidaseDAKO; Reagente Vector LaboratoriesK3468
peroxidase de hidrogênioMerk1072090250Reagente; Cuidado -
caneta hidrofóbicaDako411121Reagent; Cuidado - tóxico
KetamidorRichterpharmaCN: 580393,7 630/01/12 DfvfReagente
Laser Doppler perfusão imager moorLDI2-HIRMoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, Reino Unido5710
Instrumento Leica DM2500 microscópio de campo claro verticalLeica MicrosystemsInstrumento
MedetorVirbac037/01/07RFVPTReagente
metanolVWRUN1230Reagente; Cuidado - reagente
PapaverineLabesfal
Pentano IssoMerk1060561000Reagent; Cuidado - altamente inflamável
Power SYBR® GreenApplied Biosystems4309155
Reagente Purificado rato anti-rato CD31Pharmingen550274
Reagente RNeasy Micro kitQiagen74004Reagente
Surgic-Pro 6.0Medtronic (Coviden)VP733XSutura
VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, IgG de Rato)Kit Vectastain ABC; Vector LaboratoriesPK-4004Reagente
Vicryl5.0 / Vicryl 6.0Medtronic (Covidien)UL202 / UL101Sutura
Zeiss PALM MicroBeam Sistema de Microdissecção a LaserCarl Zeiss, Alemanha1023290916Instrumento
Microscópio estereotáxicoCarl Zeiss Microscopy, AlemanhaInstrumento
Câmera digitalLinuxinstrumento
instrumento de nocif tóxico e altamente inflamável

Referências

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  2. Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
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