Determinando a densidade do ducto biliar no fígado do rato

Resumo

Nós apresentamos um método rather simples e sensível para a quantificação exata da densidade do colagogo no fígado do rato. Este método pode ajudar a determinar os efeitos dos modificadores genéticos e ambientais e a eficácia de terapias potenciais em modelos de camundongo de doenças biliares.

Resumo

O rato é amplamente utilizado como um organismo modelo para estudar as doenças biliares. Para avaliar o desenvolvimento e a função do sistema biliar, diversas técnicas são usadas, incluindo a química do soro, a análise histológica, e a imunomarcação para marcadores específicos. Embora essas técnicas possam fornecer informações importantes sobre o sistema biliar, muitas vezes não apresentam um quadro completo de defeitos de desenvolvimento do ducto biliar (BD) em todo o fígado. Isto é em parte devido à habilidade robusta do fígado do rato para drenar a bilis mesmo nos animais com prejuízo significativo no desenvolvimento biliar. Aqui nós apresentamos um método simples para calcular o número médio de BDs associados com cada veia portal (picovolt) nas seções que cobrem todos os lóbulos de ratos mutantes/transgenic. Neste método, os fígados são montados e seccionados de forma estereotipado para facilitar a comparação entre vários genótipos e condições experimentais. Os BDs são identificados por meio de microscopia de luz de colangiócitos corados por citoqueratina e, em seguida, contados e divididos pelo número total de PVs presentes na seção hepática. Como exemplo, mostramos como esse método pode distinguir claramente entre camundongos de tipo selvagem e um modelo de rato da síndrome de Alagille. O método aqui apresentado não pode substituir técnicas que visualizem a estrutura tridimensional da árvore biliar. No entanto, oferece uma maneira fácil e direta de avaliar quantitativamente o desenvolvimento de BD e o grau de formação de reação ductular em camundongos.

Introdução

A árvore biliar é uma parte crítica do fígado de mamíferos, permitindo a passagem da bile de hepatócitos para o intestino. Os ductos biliares intrahepáticos (BDS) são formados por colangiócitos, que se diferenciam dos hepatoblastos bipotenciais através da sinalização de entalhe e TGFβ^1,2. A especificação e o compromisso apropriados dos colangiócitos e de seu conjunto em BDS maduros são críticos para o desenvolvimento da árvore biliar intrahepatic. Como o fígado cresce durante o desenvolvimento ou após a regeneração de órgãos, o sistema biliar precisa se desenvolver ao longo do fígado para garantir a drenagem b....

Protocolo

Todos os animais foram alojados em uma instalação de barreira animal no Baylor College of Medicine por diretrizes institucionais de cuidado animal e uso do Comitê e protocolos de animais aprovados.

1. coleção do tecido do fígado do rato

1. Preparação do rato para a colheita do fígado
   1. Eutanizar o rato usando isoflurano.
   2. Realize luxação cervical do mouse para garantir a morte.
   3. Faça uma incisão transversal aproximadamente uma polegada abaixo da caixa torácica.
   4. Expor toda a superfície ventral do fígado.
2. Coleção do fígado do rato

Resultados

Nós documentamos previamente defeitos biliares em Jag1 +/- Animals, um modelo do rato de algs⁸. Para determinar a relação BD com PV, nós seccionamos os fígados do mouse p30 e os cortinos para CK8 e CK19 (wsCK), juntamente com o marcador vascular αSMA. Nós então imaged todos os PVs em cada um dos lóbulos do fígado. Como mostrado na Figura 2a, definimos PVS como vasos manchados de αsma que têm coloração de wsck adjacente (pontas.......

Discussão

A análise do desenvolvimento e reparo da BD em camundongos é uma importante ferramenta para estudar a patogênese e o mecanismo de distúrbios colestáticos. Além, o desenvolvimento de terapias novas é na parte dependente em cima de estabelecer um phenotype reprodutível e preferivelmente quantificáveis. A fenotipagem atual em modelos de mouse geralmente envolve química sérica, histologia hepática e imunocoloração para marcadores específicos do tipo celular. Embora essas técnicas gerem informações valiosas sobre a estrutura .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Isothesia (Isoflurano)	Henry Schein	11695-6776-2
Dessecador	Bel-Art	16-800-552
10% PFA	Microscopia Eletrônica Ciências	15712
Tubo de 50 mL	ThermoScientific	339653
70% Etanol	Decon Laboratories	2401
95% Etanol	Decon Laboratories	2801
100% Etanol	Decon Laboratories	2701
HistoChoice	VWR Life Sciences	H103-4L	de desobstrução
Omnisette Tissue	Fisher HealthCare	15-197-710E
Macrosette	Simport	M512
Paraplast X-TRA	McCormick Scientific	39503002
Molde de Tecido	Fisher Scientific	62528-32
Microtomo		Microm HM 325
Superfrost Plus Lâminas	de Microscópio Fisher Scientific	12-550-15
Xileno	Fisher Scientific	C8H10
de Recuperação de Antígeno Baseado em Tris	Laboratórios	H-3301
Pressão Panela	Instantânea Panela	Lux Mini
Mini Pap Pen	Life Technologies	8877
Polioxietileno 20 Monolaurato de Sorbitano (Tween-20)	J.T. Baker	X251-07
Octil Fenol Etoxilato (Triton-X-100)	J.T. Baker	X198-07
Soro de Cabra Normal	Jackson Immunoresearch	005-000-121
anti-CK8	Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma	TROMA-I	ID de Registro de Anticorpos AB531826
anti-CK19	Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma	TROMA-III	ID de Registro de Anticorpos AB2133570
anti-&alfa;SMA	Sigma Aldrich	A2547, Clone 1A4
anti-rato-Alexa488	ThermoFisher	A21208
anti-mouse-Cy5	Jackson Immunoresearch	715-175-151
DAPI	Vector Laboratories	H-1000
22 x 50 mm2 micro vidro de cobertura	VWR Life Sciences	48393 059
Microscópio de fluorescência	Leica	DMI6000 B
Kimwipes	Kimtech Science	05511
VECTASHIELD	Vector Laboratories	H-1000	Meio de montagem antidesbotamento

agente Parrafin Vetor