Aqui, os protocolos para o isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e isolamento de seus exoproteomes são descritos. Ambos os procedimentos incorporam etapas-chave para obter polímeros ou proteínas com graus de alta pureza que podem ser usados para posterior análise ou aplicações. Eles também podem ser facilmente adaptados de acordo com as necessidades específicas do usuário.
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Artigo de método
Olhando para fora: isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas
Neste artigo
Resumo
Resumo
A cianobactéria pode secretar ativamente uma ampla gama de biomoléculas para o ambiente extracelular, como heteropolissacarídeos e proteínas. A identificação e caracterização dessas biomoléculas podem melhorar o conhecimento sobre suas vias de secreção e ajudar a manipulá-las. Além disso, algumas dessas biomoléculas também são interessantes em termos de aplicações biotecnológicas. Descritos aqui estão dois protocolos para o isolamento fácil e rápido de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas. O método de isolamento de polímeros de carboidratos liberados é baseado em técnicas convencionais de precipitação de polissacarídeos em soluções aquosas utilizando solventes orgânicos. Este método preserva as características do polímero e, simultaneamente, evita a presença de contaminantes de detritos celulares e meio de cultura. No final do processo, o polímero liofilizado está pronto para ser usado ou caracterizado ou pode ser submetido a novas rodadas de purificação, dependendo do uso final pretendido. Em relação ao isolamento do exoproteoma cianobactérias, a técnica baseia-se na concentração do meio livre de células após a remoção dos principais contaminantes por centrifugação e filtração. Essa estratégia permite o isolamento confiável de proteínas que atingem o meio extracelular através de transportadores de membrana ou vesículas de membrana externa. Essas proteínas podem ser posteriormente identificadas usando técnicas de espectrometria de massas padrão. Os protocolos aqui apresentados podem ser aplicados não apenas a uma ampla gama de cianobactérias, mas também a outras cepas bacterianas. Além disso, estes procedimentos podem facilmente ser costurados de acordo com o uso final dos produtos, o grau da pureza exigido, e a tensão bacteriana.
Introdução
As cianobactérias são amplamente reconhecidas como fontes prolíficas de produtos naturais com promissoras aplicações biotecnológicas/biomédicas. Portanto, a compreensão dos mecanismos de secreção de cianobactérias e a otimização dos métodos de extração/recuperação são essenciais para implementar cianobactérias como eficientes fábricas de células microbianas.
Muitas cepas de cianobactérias são capazes de produzir substâncias poliméricos extracelulares (EPS), formadas principalmente por heteropolissacarídeos, que permanecem associadas à superfície celular ou são liberados para o meio1. Estes polímeros de carboidratos l....
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Protocolo
1. cianobactérias liberado isolamento de polímero de carboidratos
-
Isolamento de polímeros e remoção de contaminantes
- Cultivar a estirpe de cianobactérias em condições padrão [por exemplo, 30 ° c uma luz de 12 h (50 μE m− 2s− 1)/12 h de regime escuro, com agitação orbital a 150 rpm]. Meça o crescimento usando protocolos padrão [por exemplo, densidade ótica em 730 nanômetro (OD730nm), clorofila a, seco-peso, etc.], a seguir mede a produção de polissacarídeos liberados de acordo com o método do ácido fenol-sulfúrico16.
- Transfira a cultura em membranas da diálise (12-14 k....
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Resultados
Uma representação esquemática do método descrito para extrair polímeros de carboidratos liberados de culturas de cianobactérias é descrita na Figura 1. Os polímeros precipitados do moderado produtor de EPS cianobactéria synechocystis SP. PCC 6803 e o eficiente produtor de EPS cyanothece SP. CCY 0110 são mostrados na Figura 2. Na Figura 3, são mostrados polímeros liofilizados com diferentes graus de contaminação, de.......
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Discussão
Para compreender melhor os mecanismos de secreção bacteriana e estudar os produtos liberados, é de extrema importância demonstrar o isolamento e a análise eficientes das biomoléculas presentes no ambiente bacteriano extracelular (como o liberado polímeros e proteínas de carboidratos).
Os polímeros de carboidratos extracelulares de cianobactérias são extremamente complexos, principalmente devido ao número e proporção de diferentes monossacarídeos que constituem sua composição1.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelos fundos do Fundo Europeu de desenvolvimento regional (FEDER) através do programa de competitividade e internacionalização da 2020 concorrência (POCI), Portugal 2020 e dos fundos portugueses através da FCT-Fundação para a ciência e a tecnologia/Ministério da ciência, tecnologia e ensino superior no âmbito do projecto POCI-01-0145-FEDER-028779 e a subvenção SFRH/BD/99715/2014 (CF).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Membranas de diálise | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Tamanho 7, Diâmetro 23.8 mm, Largura 39-41 mm 30m Rolo |
| Etanol 96% | AGA - Á lcool e Gé neros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentação álcool etílico 96% AGA |
| PES Filtro 0.2 μ m | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Seringa filtro de poliestireno 33MM 0.2µ M STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Filtros centrífugos com um corte de peso molecular nominal de 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Reagente de ensaio de verde a azul, preciso, compatível com detergente para medir a concentração total de proteína |
| Concentrado Coloidal Brillant Blue G | Sigma Aldrich Quí mica SL | B2025-1EA | Coomassie azul |
Referências
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al.
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Reimpressões e permissões
