Summary
Wir beschreiben ein neuartiges Ganganalysesystem, Paw-Print Analysis of Contrast-Enhanced Recordings (PrAnCER), ein automatisiertes Open-Access-System zur Quantifizierung von Gangeigenschaften bei Ratten, das einen neuartigen halbtransparenten Boden nutzt, um automatisch Quantifizierung simonen. Dieses System wurde mit dem Haloperidol-Modell der Parkinson-Krankheit validiert.
Abstract
Die Gait-Analyse wird verwendet, um Veränderungen in der motorischen Funktion in vielen Nagetiermodellen von Krankheiten zu quantifizieren. Trotz der Bedeutung der Bewertung der Gang- und Motorfunktion in vielen Forschungsbereichen haben die verfügbaren kommerziellen Optionen mehrere Einschränkungen, wie hohe Kosten und fehlende zugängliche, offene Codes. Um diese Probleme anzugehen, haben wir PrAnCER, Paw-Print Analysis of Contrast-Enhanced Recordings, für die automatisierte Quantifizierung von Gangen entwickelt. Die kontrastverstärkten Aufnahmen werden mit einem durchscheinenden Boden erzeugt, der Objekte verdeckt, die nicht mit der Oberfläche in Berührung kommen, wodurch die Pfotenabdrücke der Ratte während des Gehens effektiv isoliert werden. Mit diesen Videos misst unser einfaches Softwareprogramm zuverlässig eine Vielzahl von raumzeitlichen Gangparametern. Um zu zeigen, dass PrAnCER Veränderungen der motorischen Funktion genau erkennen kann, haben wir ein Haloperidol-Modell der Parkinson-Krankheit (PD) verwendet. Wir testeten Ratten in zwei Dosen Haloperidol: hohe Dosis (0,30 mg/kg) und niedrige Dosis (0,15 mg/kg). Haloperidol deutlich erhöhte HaltungDauer und Hinterpfote Kontaktfläche in der niedrigen Dosis Zustand, wie in einem PD-Modell zu erwarten. In der hochdosierten Bedingung fanden wir eine ähnliche Zunahme der Kontaktfläche, aber auch eine unerwartete Zunahme der Schrittlänge. Mit weiteren Untersuchungen, Wir fanden heraus, dass diese erhöhte Schrittlänge mit dem Versteifungs-Escape-Phänomen übereinstimmen, das häufig bei höheren Dosen von Haloperidol beobachtet wird. So konnte PrAnCER sowohl erwartete als auch unerwartete Veränderungen in Nagetier-Gangmustern erkennen. Darüber hinaus haben wir bestätigt, dass PrAnCER konsistent und genau ist, wenn man es mit der manuellen Bewertung von Gangparametern vergleicht.
Introduction
Nagetiere werden häufig als Modelle verwendet, um eine breite Palette von Krankheiten und Verletzungen zu untersuchen, einschließlich Arthritis1, Parkinson-Krankheit (PD)2,3, neuromuskuläre Störungen4,5, Hydrocephalus6 , und Rückenmarksverletzung7. Unter diesen Bedingungen können Symptome wie Schmerzen, Gleichgewicht und motorische Funktion gemessen werden, indem die Gangmuster der Tiere untersucht werden. Diese Muster werden mit einer Reihe von raumzeitlichen Gangparametern quantifiziert, die die Position und das Timing von Pfotenabdrücken sowie den Bereich des Pfotenkontakts auf dem Boden zusammenfassen.
Obwohl es viele Optionen für die Ganganalyse gibt, haben aktuelle Systeme mehrere Nachteile. Bei herkömmlichen Tinten- und Papiertests werden die Pfoten eines Tieres mit Tinte überzogen, bevor es über ein Blatt weißes Papier geht (Abbildung 1A). Die resultierenden Pfotenabdrücke können dann auf Schrittlänge und Haltungsbreite gemessen werden, aber wichtige zeitliche Gangparameter wie Geschwindigkeit oder Schrittdauer können nicht beurteilt werden. Moderne videobasierte Systeme sind zuverlässiger, aber die Videoanalyse erfordert eine mühsame Frame-by-Frame-Bewertung, es sei denn, ein geeignetes automatisiertes System wird verwendet8. Es gibt viele kommerzielle automatisierte Scoring-Systeme derzeit verfügbar, aber diese Systeme können unerschwinglich teuer sein. Darüber hinaus sind diese Systeme auf klare Bodenbeläge oder in einigen Fällen Auflaufbänder angewiesen, die beide die natürliche Bewegung verändern. Laufbänder haben gezeigt, dass motorische Defizitein einigen Krankheitsmodellen maskiert 9 , während klare Bodenbeläge (Abbildung 1B) dazu führen, dass Mäuse mehr Zeit auf dem Umfang eines offenen Feldes verbringen, was auf erhöhte Angst10hindeutet. Im Idealfall würde sich ein Ganganalysegerät auch nicht darauf verlassen und die natürlichsten Bewegungsmuster mit dem geringsten Stress für das Tier erzeugen.
Verfügbare Open-Source- und kommerzielle Optionen verwenden eine Vielzahl von Methoden, um die Schwierigkeit zu überwinden, einen Fußabdruck vom Körper des Tieres trotz variabler Lichtverhältnisse, Tierfarbe und Druckformen zu isolieren. Einige verstärken den Kontrast der Kontaktpfoten mit Oberflächen, die Licht als Reaktion auf Druck7,11,12, aber diese sind teuer und technisch schwierig zu konstruieren. Andere Systeme verwenden mehrere Sichtwinkel, die dieBeobachtung der Ganzkörperkoordination 8,13ermöglichen. Diese Optionen bieten zwar Vorteile für die Messung zusätzlicher Motorparameter über den Gang hinaus, sind aber für eine einfache Ganganalyse unnötig komplex. Darüber hinaus basieren alle diese Techniken auf klarem Bodenbelag, der das natürliche Verhalten verändert.
PrAnCER basiert auf sogenannten Kontrast-Enhanced Recordings, die eine Kombination aus Beleuchtung und einem halbtransparenten Boden verwenden, um die Erkennung von Drucken zu verbessern. Wenn man sie von unten betrachtet, entsteht ein kontrastreiches Bild (Paw-Druck), während die Ansicht von Objekten, die nicht mit der Oberfläche (dem Körper des Tieres) in Berührung kommen, verschleiert wird (Abbildung 1D). Von oben betrachtet erscheint der Boden undurchsichtig. Die daraus resultierende Bedeutung der Pfoten in unserer Methode ermöglicht eine genaue Identifizierung einer Vielzahl von Gang- und Bewegungseigenschaften durch unser neu entwickeltes automatisiertes System. In der vorliegenden Studie beschreiben wir das Gerät, unser Ganganalyseprotokoll und unser automatisiertes Scoring-System PrAnCER. Unser Gerät lässt sich leicht montieren und PrAnCER kann verwendet werden, um motorische Defizite in einer Vielzahl von Krankheits- und Verletzungsmodellen zu bewerten.
Um zu zeigen, dass PrAnCER verwendet werden kann, um abnormale Gangmuster zu erkennen, haben wir ein Haloperidol-Modell von PD verwendet, ein einfaches Modell für die vorübergehende Induktion von Bewegungsänderungen14. Haloperidol ist ein Dopamin-Rezeptor-Antagonist weit verbreitet als Antipsychotikum1verwendet. Es wirkt sich auf motorische Systeme durch Veränderung der Dopamin-Signalisierung im Striatum, ein wichtiger Bestandteil des Motorweges in der Basalganglien14. Auch eine einzelne Dosis von Haloperidol reduziert schnell extrazelluläre Dopaminspiegel im Striatum, verursacht Parkinson-ähnliche motorische Defecits15. Die Verhaltenseffekte sind Muskelsteifheit, Akinesia und Katalepsie, die als Unfähigkeit definiert ist, zu einer normalen Haltung zurückzukehren, nachdem sie in einer ungewöhnlichen Position platziert wurde11,16. Akute Dosen von Haloperidol verursachen Bewegungsdefizite, die im Rotarod-Test der Motorfunktion17identifizierbar sind. Wir argumentierten, dass Haloperidol-vermittelte Bewegungsstörungen auch in einer Reihe von Merkmalen erkennbar sein würden, die für die automatisierte Ganganalyse zugänglich sind.
Obwohl die Reaktionen auf Haloperidol in den Studien sehr unterschiedlich sind, treten kataleptische Wirkungen von Haloperidol bei Dosen von 0,5 mg/kg und höher auf, während reduzierte Reaktionsfähigkeit und motorische Beeinträchtigung bei niedrigeren Dosen (0,1 - 0,3 mg/kg) nachweisbar sind16, 17. Um die kataleptische Wirkung von Haloperidol zu vermeiden, haben wir beschlossen, zwei Dosen Haloperidol zu testen: eine hohe Dosis (0,30 mg/kg) und eine niedrige Dosis (0,15 mg/kg). Wie in Tabelle 1dargestellt, untersuchte Experiment 1 die Auswirkungen von hochdosierten Haloperidol, während Experiment 2 die Auswirkungen von niedrig dosierten Haloperidol getestet. Wir verwendeten ein innerhalb des Subjekts Design, in dem jede Ratte in der hohen Dosis getestet wurde, niedrige Dosis, und Kontrolle (saline) Bedingungen. Die Reihenfolge der Bedingung wurde über Ratten hinweg ausgeglichen. Wir sagten voraus, dass akute Verabreichung von Haloperidol Gangbeeinträchtigungen verursachen würde, ähnlich denen, die in anderen Modellen von PD gefunden werden, wie verringerte Geschwindigkeit, verringerte Schrittlänge und längere Haltungsdauer3,14,18 ,19. Wir beobachteten Verhaltensänderungen einschließlich Akinesie nach Haloperidol-Verabreichung bei beiden Dosierungen. In der niedrig dosierten Bedingung hatten Ratten wie erwartet eine signifikant erhöhte Haltungsdauer und einen Hinterpfotenkontaktbereich. Diese Gangänderungen sind vergleichbar mit den langsamen, mischenden Schritten, die bei PD-Patienten üblich sind2,20. In der hochdosierten Bedingung sahen wir jedoch eine Erhöhung der Schrittlänge sowie eine Erhöhung der Pfotenkontaktfläche. Obwohl die Erhöhung der Schrittlänge unerwartet war, deutete eine weitere Überprüfung der Literatur darauf hin, dass es wahrscheinlich Teil einer Haloperidol-induzierten Versteifungs-Escape-Antwort ist. Wir schlussfolgern, dass PrAnCER in der Tat in der Lage ist, Parkinson-ähnliche Veränderungen im Nagetier Gang im Einklang mit der Verwendung von Neuroleptika zu erkennen.
Protocol
Alle Verfahren entsprachen den Richtlinien des Brown University Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Gait-Analysegerät
- Bereiten Sie den Ganganalyse-Laufweg vor, der aus einem durchsichtigen Plexiglas-umschlossenen Gehweg (36" L x 3" B x 4,5" H) besteht, der auf einem klaren Plexiglasboden platziert ist (Abbildung 2A). Machen Sie den Plexiglasboden halbtransparent, indem Sie ihn mit einem Stück 16 LB Baumwolle Faser Entwurf Vellum auf die gleiche Breite wie der Gehweg geschnitten.
HINWEIS: Es gibt andere Methoden, um den Boden halbtransparent zu machen. - Platzieren Sie eine Kamera mit einer Bildrate von mindestens 30 Bildern pro Sekunde (fps) direkt unter dem Laufsteg, um die Mitte der Spur zu erfassen (Abbildung 2B).
- Sichern Sie einen Streifen von 12 V LED-Leuchten mit 18 LEDs/ Fuß ca. 2 Zoll von und 1 Zoll über dem Boden des Gehwegs, um die Strecke zu beleuchten.
2. Tierzubereitung
- Lassen Sie die Tiere sich mindestens 1 Woche vor der Behandlung an das Vivarium akklimatisieren. Behandeln Sie die Ratten mindestens 5 Tage vor Beginn des Experiments. Diese Studie verwendete 8 männliche Long Evans Ratten etwa 3 Monate alt.
-
Habituate die Tiere zum Testraum und Ganggang mit ausgeschalteten Raumlichtern
- Platzieren Sie den Hauskäfig der Ratte auf der Oberflächenebene am Ende des Gangstegs, um als Torkasten zu dienen. Beachten Sie, dass Ratten, wenn der Hauskäfig tief, alt oder bewegungsbehindert ist, von einer Rampe oder einem Schritt profitieren können, um einen leichteren Zugang zum Hauskäfig zu ermöglichen.
- Lassen Sie die Ratte von der Hand des Experimentierenden die Länge des Gehwegs hinuntergehen, um seinen Heimatkäfig zu erreichen.
- Ratten halten oft am Ende des Gehwegs an, um sich umzusehen, bevor sie in den heimischen Käfig springen. Wenn eine Ratte länger als 1 min braucht, um den Gehweg zu verlassen, ermutigen Sie sie, ihren Hauskäfig mit einem sanften Druck zu betreten.
- Wenn sich die Ratte umdreht, verwenden Sie ein kleines Stück Plexiglas, um das "Start"-Ende des Gehwegs zu blockieren. Wiederholen Sie dies für insgesamt 3 Durchläufe.
- Habituate für mindestens 2 Tage oder bis die Ratten bequem den Gehweg in einem stetigen Tempo ohne Einfrieren überqueren.
3. Gait-Prüfverfahren
- Passen Sie die Einstellungen auf der Webcam-Software an, um das klarste Bild der Pfotenabdrücke zu erhalten. Schalten Sie die Raumbeleuchtung für alle Gangtests aus.
- Zeichnen Sie jeden Durchlauf separat auf und beschriften Sie ihn entsprechend für die Verwendung mit dem automatisierten Analyseprogramm.
- Stellen Sie sicher, dass sich keine Flecken oder Trümmer auf dem Pergament befinden. Beginnen Sie mit der Aufnahme ein paar Sekunden, bevor die Ratte den Gehweg betritt, und halten Sie an, sobald die Ratte den Gehweg verlässt und ihren Heimatkäfig betritt.
- Fahren Sie fort, bis entweder drei akzeptable Läufe abgeschlossen sind oder 10 min verstrichen ist.
- Wischen Sie den Gehweg mit Ethanol zwischen jeder Ratte ab und ersetzen Sie das Pergament nach Bedarf.
HINWEIS: Eine akzeptable Studie ist definiert als eine, in der das Tier konsequent und ohne Pause für die ersten 4 Schritte des Laufs geht. Wenn dies schwer zu erreichen ist, passen Sie die Kriterien so an, dass Versuche eingeschlossen werden, in denen es an jedem Punkt des Laufs 4 aufeinander folgende Schritte gibt, die ohne Pausen oder abrupte Beschleunigung auftreten.
4. Automatisierte PrAnCER-Analyse
- Legen Sie alle Videos, die analysiert werden sollen, in einen Ordner.
- Starten Sie PrAnCER, indem Sie das Python-Skript PrAnCERausführen. PrAnCER analysiert die Videos anhand der in Abbildung 3 und Abbildung 4dargestellten Schritte.
- Wählen Sie im Popup-Menü den angegebenen Ordner aus, indem Sie die Schaltfläche Ordner auswählen drücken. Wählen Sie ggf. benutzerdefinierte Optionen für die Analyse aus. Detaillierte Beschreibungen der einzelnen Parameter finden Sie, indem Sie auf das Fragezeichen neben ihnen klicken. Klicken Sie auf Weiter, wenn Sie fertig sind.
- Definieren Sie eine Region von Interesse (ROI) auf dem Bild des Gehwegs, der angezeigt wird. Klicken Sie dazu mit der linken Maustaste, um einen oberen Rand zu definieren, und mit der rechten Maustaste, um eine untere Kante zu definieren. Wenn das angezeigte Feld korrekt ist, drücken Sie N, um fortzufahren. Wenn nicht, drücken Sie Z, um dieS rückgängig zu machen. Sobald N gedrückt wird, wird das Programm automatisch ausgeführt.
- Nachdem PrAnCER abgeschlossen ist, beenden Sie das Programm, indem Sie enter in das Terminal drücken.
- Um die von PrAnCER ausgegebenen Ergebnisse manuell zu überprüfen, führen Sie das Python-Skript GaitEditorGUI aus und wählen Sie für jedes Video die entsprechende MP4-Datei aus. Korrigieren Sie bei Bedarf alle falsch identifizierten oder zusammengeführten Drucke.
- Um räumliche und zeitliche Gangparameter zu extrahieren, führen Sie das Python-Skript ParameterAnalyzeraus. Wählen Sie die Anzahl der zu analysierenden Hinterabzüge und den zu analysierenden Ordner der Videos aus, und klicken Sie dann auf Weiter. Dadurch wird für jedes Video eine CSV-Datei ausgegeben, die eine Reihe gängiger Gangparameter enthält, die in Tabelle 2 beschrieben und in Abbildung 5dargestellt sind.
HINWEIS: Die vollständigen Skripte sowie Anweisungen zum Lesen und Analysieren von Daten sind im GitHub (www.github.com/hayleybounds) des Autors verfügbar. Wir haben diesen Algorithmus mit der kostenlosen, Open-Source-Python-Bibliothek OpenCV21implementiert. Ebenfalls auf dem GitHub enthalten sind Anleitungen zum Bau unseres Ganganalysestegs.
Representative Results
Haloperidol-Verfahren
Wir entwickelten dieses Ganganalysesystem, um Gangparameter bei Kontrollratten mit denen bei experimentellen Ratten zu vergleichen, von denen erwartet wurde, dass sie eine Vielzahl von Bewegungsstörungen, Gang- und Gleichgewichtsbeeinträchtigungen aufweisen. Wir verwendeten ein innerhalb des Subjekts Design, in dem jede Ratte in der saline getestet wurde, hochdosiertes Haloperidol und niedrig dosierte Haloperidol Bedingungen. Ratten wurden in zwei Gruppen (A und B) eingeteilt, um ein Gleichgewicht zu ermöglichen; Gangprüfung wurde auf Tageszeit und Ordnung summierte. Jeder Test wurde durch 48 h getrennt. Ratten wurden leicht mit Isofluran anbeet, bevor sie intraperitoneale (IP) Injektionen von Salz- oder Haloperidol erhielten. Gait wurde 1 h nach der Injektion getestet, an diesem Punkt sollte das Haloperidol auf Spitzenwerten15,16,17sein.
Verhaltensergebnisse
Wir beobachteten prominente Verhaltensänderungen bei Tieren, die mit Haloperidol behandelt wurden. In der hochdosierten Bedingung hatten fünf der acht Ratten Phasen der Unbeweglichkeit am Anfang des Gehwegs, in denen sie nicht reagierten, um den Experimentator zu berühren und resistent gegen bewegt. In einigen Fällen blieb dieser Zustand einige Minuten lang bestehen, bis die Ratte vom Gehweg entfernt wurde. In anderen Fällen bewegte sich die unbewegliche Ratte plötzlich schnell oder "gebunden" über den Gehweg und kehrte dann gegen Ende in den unbeweglichen Zustand zurück. In der niedrig dosierten Erkrankung hatten 3 der 8 Ratten ähnliche Phasen der Unbeweglichkeit. Bei dieser Dosierung, Es gab nur eine Instanz von Grenzverhalten. Bei der Behandlung der Tiere mit Saline wurde keine Begrenzung beobachtet.
Wir analysierten die Auswirkungen von Haloperidol auf die folgenden Gangparameter: Unterstützungsbasis, Schrittlänge, Schrittgeschwindigkeit, Haltungsdauer, Haltungs-Zu-Schwenk-Verhältnis, maximale Kontaktfläche und Zwischendistanz. Da viele Gangparameter für vordere und hintere Gliedmaßen identisch sind und Haloperidol in der Regel gleichmäßige Auswirkungen auf alle Gliedmaßen hat, haben wir Parameter nur für die Hinterbeine berechnet und keine Daten für linke und rechte Gliedmaßen getrennt. Für jede Ratte haben wir den Mittelwert jedes Gaitparameters aus allen verwendbaren Durchläufen von jedem Testtag berechnet. Alle Parameter (außer Geschwindigkeitsvariabilität) wurden als Mittelwert für die ersten 4 verwendbaren Schritte eines Laufs berechnet. Um zu beurteilen, ob jede Dosierung von Haloperidol signifikant Auswirkungen auf Gang, Wir verwendet eine gepaarte Probe t-Test. In Experiment 1 gab es bei Tieren, die mit hochdosierten Haloperidolen behandelt wurden, eine signifikante Zunahme der Schrittlänge (Abbildung6A; t(7) = -2,962, p = 0,021) und der maximalen Kontaktfläche (Abbildung6A; t(7) = 0,04). Die Basis der Unterstützung, Geschwindigkeit, Haltungsdauer und Haltung sende Verhältnis waren nicht signifikant. In Experiment 2 zeigten Tiere mit niedrigem Haloperidol eine signifikante Zunahme der Haltungsdauer (Abbildung6B; t(7) = -2,444, p = 0,044) und der maximalen Kontaktfläche (Abbildung6B;t(7) = -3,085, p = 0,018) im Vergleich zur Kochsaline. Keine anderen Gangparameter waren signifikant. Zusätzlich gab es einen signifikanten Unterschied zwischen den bedingungen für hohe und niedrige Dosis Haloperidol in der Unterstützungsbasis (Abbildung6C; t(7) =2,651, p = 0,033), der maximalen Kontaktfläche (Abbildung6C;t(7) = 4,635, p = 0,002) und der Zwischenabstand ( Abbildung 6C; t(7) = 3,098, p = 0,017).
Ihre Standortgenauigkeit und Fehler im automatisierten System
Um die Genauigkeit von PrAnCER zu bewerten, verglichen wir seine automatisierte Analyse mit der manuellen Bewertung von 21 zufällig ausgewählten Videos aus einer separaten Gruppe von 6 Kontrollratten. Für die Handbewertung wurden die Videos in eine Sequenz von Bildern umgewandelt, die dann verwendet wurden, um die Positionen der Drucke manuell zu markieren. Aus Gründen der Effizienz haben wir unsere Analyse auf räumliche Daten konzentriert, die nur aus Hinterdrucken gemessen werden. Wir haben die mittlere Schrittlänge und BOS für jedes Video extrahiert und mit den automatisierten Werten verglichen. Während sich die mittlere Schrittlänge zwischen manueller Bewertung und PrAnCER-Analyse nicht signifikant unterschied (Abbildung 7B; t(20) = -0,01, p = 0,99), war die Unterstützungsbasis signifikant (Abbildung 7A; t(20) = -2,21, p = 0,038). Obwohl die automatisierte und manuelle Bewertung im Allgemeinen gut korreliert war, meldete das automatisierte System durchschnittlich 5% größere BOS. Dieser Unterschied kann eher auf Abweichungen bei der Zentroidauswahl als auf Erkennungsfehler zurückzuführen sein. Für die manuelle Bewertung wurde die Druckposition markiert, indem sie ein Oval um die Basis jedes Hinterdrucks zeichnete, da es schwierig wäre, die Methode der Massenschätzung von PrAnCER manuell zu replizieren. Der klare Trend war, dass PrAnCER BOS überschätzt, vielleicht weil einige Tiere ihre Zehen asymmetrisch ausspielen können, was PrAnCER dazu veranlasste, extremere Zentroide als manuelles Scoring zu beobachten. Andere Systeme haben auch deutliche Steigerungen der BOS zwischen manueller und automatisierter Bewertung trotz konsistenter Schrittlängenmessungen17festgestellt. Unter Berücksichtigung der beobachteten kleinen Unterschiede und der Konsistenz mit anderen Systemen kommen wir zu dem Schluss, dass PrAnCER ein zuverlässiges Maß für Gangparameter ist.
Es ist wichtig zu beachten, dass alle Genauigkeitsanalysen nach der manuellen Korrektur der automatisierten Ausgabe mit der GUI von PrAnCER durchgeführt wurden. Wie bei bestehenden kommerziellen Systemen ist dieser Schritt sowohl zur Korrektur von Fehlern bei der Bewertung als auch zur Eliminierung von Durchläufen erforderlich, die nicht den Kriterien22entsprechen. Wir haben PrAnCER auf die Seite falscher Positivmeldungen eingestellt, da diese nach dem Hoc leichter zu korrigieren sind. Wir haben noch nie beobachtet, dass PrAnCER bei der manuellen Korrektur von über 5hundert Videos keinen echten Druck erkennt. Andere Arten von Fehlern wurden jedoch beobachtet. Diese kategorien in 3 Kategorien: Fehlerkennung (Erkennung eines Nichtdrucks als Druck), Fehlklassifizierungen (Druck falsch als Front/Hind oder links/rechts gekennzeichnet) und falsche Kombinationen (zwei Drucke falsch zusammengeführt). Diese Fehler können in der begleitenden GUI leicht korrigiert werden und treten in der Regel nur in einem kleinen Prozentsatz der Unter normalen Bedingungen gefilmten Videos auf. Selbst mit solchen Korrekturen verringert PrAnCER die Menge an manueller Arbeit, die mit der Ganganalyse verbunden ist, deutlich. Wir schätzen, dass es für jedes Video etwa 3 min dauert, um PrAnCER auszuführen und alle Ausgabefehler zu korrigieren (falls erforderlich), während es fast 10 min dauern würde, um das gleiche Video manuell zu bewerten und zu analysieren.
Abbildung 1. Vergleich von Ganganalysemethoden. (A) Die traditionelle Tinten- und Papiermethode erzeugt ungenaue Drucke der Pfotenform und -position. (B) Videoaufnahmen mit transparentem Boden geben eine detaillierte Ansicht der Pfotenabdrücke, enthalten aber viele markante Merkmale aus dem Körper der Ratte, die die automatisierte Bewertung erschweren. (C) Leichtes Papier über einem klaren Boden erzeugt ein lautes Bild und verliert Details. (D) Die Verwendung von Pergament, um einen durchscheinenden Boden zu schaffen, erzeugt sehr detaillierte Drucke, während der Körper optisch eliminiert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Schematische Darstellung des Ganggangapparates und Videoaufzeichnung. (A) Die Ratte geht durch einen klaren Gehweg mit einem durchscheinenden Boden zum Zielkasten des heimischen Käfigs, während sie von unten aufgezeichnet wird. In diesem Fall bedeckt das Pergament einen transparenten Boden, um es durchscheinend zu machen. Der Gehweg wird durch LED-Streifen beleuchtet, die entlang seiner Länge auf einer Ebene zwischen den Füßen und dem Körper des Tieres platziert sind. (B) Ein Screenshot einer Videoaufzeichnung, die die Auswirkungen des lichtdurchlässigen Bodens zeigt. Zwei Pfoten sind deutlich sichtbar, aber der Körper der Ratte ist im Wesentlichen nicht nachweisbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Erkennungsprozess für einen Rahmen eines Pfotendrucks. (A) Das Originalbild wird entlärmt und dann einer Hintergrundsubtraktion (B)unterzogen. (C) Es wird ein Kantenerkennungsalgorithmus angewendet, und die Ergebnisse werden in eine Reihe von X-, Y-Koordinaten, konturen (D),konvertiert. (E) Konturen werden nach Nähe gruppiert und der konvexe Rumpf (Begrenzungsrahmen) der Gruppe wird genommen, um eine einzige Kontur zu erzeugen, die den Druck umfasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Konvertierung einzelner Detektionen in einen klassifizierten Druck. (A) Pfotenabdrücke werden zuerst in einer Reihe von Rahmen identifiziert. (B) Einzelne Objekterkennungen erhalten eine Zahl, die sie als Druck identifiziert, was eine einzelne Platzierung einer Pfote (C)darstellt. (D) Schließlich werden sie aufgrund ihrer Position relativ zur Mittellinie des Pfades des Tieres als links oder rechts klassifiziert, und sie werden aufgrund ihrer Position im Verhältnis zu den vorherigen Pfotenabdrücken als links oder rechts klassifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. Abbildung der analysierten Gangparameter. (A) Eine Beispielausgabe, die die Identifizierung und Position von Pfotenabdrücken zeigt. Die ursprünglich erkannten Kanten werden schwarz dargestellt. Die endangegebenen Pfoten und der ungefähre Bereich werden in Farben angezeigt, die auf die Pfotenklassifizierung hinweisen. In dieser Abbildung gelb: vorne links, grün: hinter links, cyan: vorne rechts und Magenta: hinter rechts. Die Farben können jedoch im Python-Skript entsprechend den Benutzereinstellungen geändert werden. (B) Ein Diagramm, das zwei wichtige zeitliche Parameter veranschaulicht: die Zeitdauer, die jede Pfote mit dem Boden (Haltungsphase) und in der Luft (Swingphase) in Berührung kommt. Farbige Blöcke zeigen die Haltungsphase und die weißen Leerzeichen die Schwenkphase an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6. Auswirkungen von Haloperidol auf Gang. (A) Ergebnisse von Experiment 1: Hochdosiertes Haloperidol (HalH) deutlich erhöhte Schrittlänge und maximale Kontaktfläche im Vergleich zur Salzbedingung (Sal). (B) Experiment 2 führte zu typischen parkinsonischen Symptomen; niedrig dosiertes Haloperidol (HalL) deutlich erhöhte Haltungsdauer und maximale Kontaktfläche. (C) Beim Vergleich der haloperidol behandelten Bedingungen aus beiden Experimenten erhöhte hochdosiertes Haloperidol die Unterstützungsbasis, die maximale Kontaktfläche und den Abstand zwischen den Gliedmaßen im Vergleich zur niedrigen Dosis. Die Daten sind Mittelwerte n SEM, n =8. Gepaarte Proben t-Test Unterschiede waren wie folgt: . p < 0,05, p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7. Genauigkeit der automatisierten Analyse. (A) Das automatisierte System unterscheidet sich bei der Messung von BOS erheblich von der manuellen Bewertung, obwohl dies eher auf Abweichungen bei der manuellen Zentroidenauswahl als auf Erkennungsfehler zurückzuführen sein kann. (B) Das automatisierte System unterscheidet sich nicht wesentlich von der manuellen Bewertung der Schrittlänge. Diese Genauigkeitsergebnisse stimmen mit denen anderer verfügbarer Systeme überein. Die Daten sind Mittelwerte für SEM, n = 21. Gepaarte Proben t-Test Unterschiede waren wie folgt: p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8. Vergleich der zeitlichen Parameter. Zeitliche Gangmuster für ein Tier, das mit Kochchen (A) und niedrig dosierten Haloperidolen (B) behandelt wird. (C) Abbildung der Versteifungs-Flucht-Reaktion einer Ratte mit hoher Dosis Haloperidol. Wie in Abbildung 5zeigen farbige Blöcke an, wann die Pfote mit dem Boden in Berührung kam (Haltungsphase) und die weißen Leerzeichen zeigen an, wann sich die Pfote in der Luft befand (Schwenkphase). Abkürzungen: FL, vorne links; HL, hinter links; FR, vorne rechts; HR, hinter rechts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Experiment 1 | Experiment 2 | |||||||
| Test 1 | Test 2 | Test 3 | Test 4 | Test 5 | Test 6 | Test 7 | Test 8 | |
| Gruppe A | HalH | Sal | HalH | Sal | Sal | HalL | Sal | HalL |
| Gruppe B | Sal | HalH | Sal | HalH | HalL | Sal | HalL | Sal |
Tabelle 1. Experimentelles Design. Diese Tabelle veranschaulicht das experimentelle Design, das in dieser Studie verwendet wird. Wir verwendeten ein innerhalb des Subjekts Design, in dem jede Ratte in der hohen Dosis Haloperidol (HalH), niedrig dosierte Haloperidol (HalL) und Salz (Sal) Bedingungen getestet wurde. Die Ratten wurden in zwei Gruppen eingeteilt; Tests wurden auf Tageszeit und Ordnung summierte.
| Parameter | erklärung |
| Stride-Länge | Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Kontakten derselben Pfote |
| Schrittlänge | Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Kontakten der kontralateralen Front oder Hinterpfoten entlang der Achse der Bewegungsrichtung |
| Basis der Unterstützung (BOS) | Abstand zwischen aufeinanderfolgenden kontralateralen Front- oder Hinterpfoten senkrecht zur Achse der Bewegungsrichtung |
| Maximale Kontaktfläche | Der maximal erkannte Bereich eines Hinterdrucks |
| Interlimb Entfernung | Abstand zwischen ipsilateraler Front und Hinterpfoten |
| Stance-Dauer | Die Dauer des Kontakts einer Pfote mit dem Boden |
| Swing-Dauer | Die Zeitdauer, in der eine Pfote nicht auf dem Boden lag |
| Stance to Swing Ratio (SSR) | Stance-Dauer/Swing-Dauer |
| Diskrete Geschwindigkeit | Schrittlänge/(Haltungsdauer + Schwingdauer) für eine Pfote |
| Durchschnittliche Geschwindigkeit | Durchschnitt der diskreten Geschwindigkeiten in der Analyse |
| Geschwindigkeitsvariabilität | Prozentuale Veränderung der diskreten Geschwindigkeiten während eines Laufs |
| Run Speed | Zeit, den Tunnel/die Länge des Tunnels zu überqueren |
Tabelle 2. Beschreibung der Gangparameter. In dieser Tabelle werden die am häufigsten verwendeten Gangparameter beschrieben. die in dieser Studie verwendeten sind fett angegeben.
Discussion
In dieser Studie haben wir PrAnCER getestet, ein neues automatisiertes Ganganalysesystem, das kontrastverstärkte Videos verwendet, die mit einem transluzenten Boden hergestellt werden, um den Körper des Tieres zu verschleiern und klar definierte Pfotenabdrücke für eine einfache automatisierte Erkennung zu liefern. PrAnCER identifiziert Pfotenabdrücke genau und ist empfindlich gegenüber Änderungen der Motorfunktion. Wir verwendeten PrAnCER, um Gangänderungen in einem akuten Haloperidol-Modell von PD zu bewerten. Obwohl Haloperidol nicht die erwarteten motorischen Defizite eines robusten PD-Modells induzierte, konnten wir dennoch nachweisen, dass PrAnCER Veränderungen in Gangmustern genau erkennen kann. Schließlich quantifizierten wir die Genauigkeit von PrAnCER und zeigten, dass seine Messung von schlüsselwerten Parametern mit der manuellen Bewertung vergleichbar ist.
In beiden Haloperidol behandelten Bedingungen beobachteten wir eine hohe Inzidenz von Gefrierverhalten (Akinesien), gefolgt von einer Fluchtreaktion des Laufens oder Der Begrenzung nach vorne. Während Akinesie in einer ähnlichen Dosis (0,25 mg/kg) in mehreren Studien16,23beobachtet wurde, stimmt dieses Grenzverhalten nicht mit den typischen Parkinson-Symptomen überein3,14,19, 24. Interessanterweise fanden wir heraus, dass eine hochdosierte Haloperidol-Behandlung zu einer signifikant erhöhten Schrittlänge führte. Dieser Befund war zunächst überraschend, da andere Haloperidol-Modelle von PD eine Abnahme der Schrittlänge3,19gezeigt haben. Sie sind jedoch angesichts des von De Ryck et al. (1980) beschriebenen Verhaltensmusters "Bracing-Escape" sinnvoll, der berichtete, dass Ratten nach akinetischen Perioden zur Flucht laufen und dass Hochgeschwindigkeitsganggänge wie Laufen und Grenzen mit erhöhtem Schritt verbunden sind. Länge4,25 (Abbildung 8C). Eine hochdosierte Behandlung führte auch zu einer signifikant erhöhten maximalen Kontaktfläche der Hinterpfoten. Die Behandlung mit niedrigem Dosishaloperidol führte zu charakteristischeren PD-Gang-Änderungen, einschließlich einer signifikanten Erhöhung der Haltungsdauer und der maximalen Kontaktfläche (Abbildung 8A-B). Diese Ergebnisse können eine Reflexion der Muskelsteifigkeit im Zusammenhang mit Haloperidol-induzierte Akinesie sein.
Trotz des ungewöhnlichen Versteifungs-Escape-Verhaltens konnten wir zeigen, dass PrAnCER tatsächlich Veränderungen im Gang erkennen kann. Wir haben gezeigt, dass bei den richtigen Lichtverhältnissen ein lichtdurchlässiger Boden ein kontrastierendes und detailliertes Bild der Pfoten erzeugen kann. In der vorliegenden Studie haben wir einen transparenten Boden durchscheinend gemacht, indem wir ihn mit Pergament bedeckt haben. Der gleiche Effekt könnte erreicht werden, indem eine weitere transluzente Abdeckung, wie Mylar, über einen transparenten Boden platziert wird. Alternativ kann der Boden selbst durchscheinend sein, indem beispielsweise milchiges Plexiglas verwendet wird. Der lichtdurchlässige Boden und der einfache Plexiglassteg sind preiswert und können nachmittags gebaut werden. Unser kantenerkennungsbasiertes Analysesystem ist widerstandsfähig gegen viele Variationen im Gerät und bietet einstellbare Schwellenwerte, um das System an verschiedene Setups, Krankheitsmodelle oder kleinere Tiere wie Mäuse anzupassen.
Einige Gaitparameteranalysen wurden aufgrund von Aspekten des Gehwegs von herkömmlichen Formeln geändert. Zum Beispiel unterscheidet sich unsere Methode zur Berechnung der Geschwindigkeit von anderen Gangstudien; der transluzente Boden in Kombination mit LED-Beleuchtung verdunkelt die Sicht des Körpers, so dass es nicht möglich ist, die Körperposition zu verfolgen, um die Geschwindigkeit zu berechnen, wie es normalerweise geschieht. Für diese Studie wurde die Geschwindigkeit berechnet, indem die zurückgelegte Entfernung zwischen zwei Kontakten derselben Pfote durch den Zeitpunkt vom ersten Kontakt zum zweiten Kontakt dividiert wurde. Natürlich könnten andere Formeln verwendet werden. Wenn z. B. ein Gesamtmaß an Geschwindigkeit erforderlich ist, könnte man den Abstand von der durchschnittlichen Vorwahl-Positionen am Anfang und am Ende des Laufs durch die Dauer des Laufs dividieren.
Unsere Analyse bestätigt, dass unser automatisiertes System zwar nicht identisch mit der manuellen Bewertung ist, aber mit hoher Genauigkeit arbeitet und zuverlässige Gaitmessungen erzeugt. Das hier beschriebene Gerät wurde für eine einfache, kostengünstige Analyse der Motorfunktion optimiert. Es könnten jedoch mehrere Änderungen vorgenommen werden, die die Nützlichkeit von PrAnCER erweitern würden. Eine Einschränkung unseres Systems ist, dass der halbtransparente Boden, während er eine ausgezeichnete Pfotenerkennung ermöglicht, die Körperachse der Tiere verdeckt. Obwohl wir es nicht für notwendig erachtet haben, könnte dies durch Hinzufügen einer Overhead-Kamera zum System behoben werden. Eine weitere Verbesserung wäre die Verwendung einer Videokamera mit einer höheren Bildrate. Während wir konsistente Schätzungen der zeitlichen Parameter erhalten konnten, wird die Genauigkeit dieser Maßnahmen bei Bildraten unter 100 fps8beeinträchtigt. Das Hinzufügen einer Hochgeschwindigkeits-Videokamera würde keine Änderung der Analysesoftware erfordern, während die Genauigkeit und Genauigkeit der zeitlichen Messungen erhöht würde. Darüber hinaus verwenden mehrere andere Gangsysteme einen Spiegel, um gleichzeitig die seitlichen und ventralen Ansichten der Ratte2,8,13aufzuzeichnen. Das Hinzufügen dieser Funktion zu unserem Gerät würde eine genauere Quantifizierung der Geschwindigkeit und eine bessere Beobachtung des Verhaltens während der Läufe ermöglichen.
In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die Verwendung eines halbtransparenten Bodens Pfotenabdrücke effektiv isoliert, indem die Sichtbarkeit von Objekten blockiert wird, die nicht mit dem Gehwegboden in Berührung kamen. Wir haben ein automatisiertes Scoring-System entwickelt, das diesen kontrastreichen Pfotenabdruck nutzt, um Pfoten genau zu identifizieren. Wir haben gezeigt, dass dieses System, PrAnCER, Gangparameter mit einer Genauigkeit quantifiziert, die mit kommerziellen Systemen vergleichbar ist. Wir stellten fest, dass die Verabreichung einer hohen Dosis von Haloperidol die Schrittlänge und die maximale Kontaktfläche im Vergleich zu Saline erhöhte. Während diese Veränderung das Gegenteil von dem ist, was wir erwartet haben, zeigt eine weitere Überprüfung der vorhandenen Literatur, dass es wahrscheinlich Teil des Fluchtverhaltens ist, das als Reaktion auf die akute Verabreichung von Haloperidol beobachtet wurde. Niedrig dosierte Haloperidol-Behandlung führte zu typischen PD-Symptomen wie erhöhter Haltungsdauer und maximaler Kontaktfläche. Wir schlussfolgern, dass die akute Hochdosis-Haloperidol-Verabreichung zwar ein schlechtes Modell zur Untersuchung von Gangstörungen im Zusammenhang mit PD ist, unsere Studie jedoch die Fähigkeit von PrAnCER gezeigt hat, Veränderungen der motorischen Funktion genau zu erkennen. In Zukunft hoffen wir, PrAnCER weiter zu validieren, indem wir die bewegungsmotorischen Veränderungen in anderen Krankheitsmodellen untersuchen.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Carney Institute for Brain Science an der Brown University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gait Walkway Apparatus | |||
| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 1 piece cut to 3 1/2" W x 36" L; 2 pieces cut to 4 1/2" W x 36" L Note: We made our walkway 36" long based off of an exisiting plexiglass table we had in house, it could easily be made longer if desired. |
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| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $10 4 pieces, cut to 1" W by 4" L These will be used to keep the tunnel in place |
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| 10 series 80/20 framing pieces, 1" x 1" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1010-S | Approximate Price: $16 2 pieces cut to 36" L |
| 12V Flexible LED Strip Lights, 16.4ft/5m LED Light Strips, Daylight White | Amazon | Approximate Price: $10 | |
| Bostik Blu-Tack Adhesive | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Clearprint 1000H drafting vellum, 16 LB cotton fiber | Dick Blick Art Supplies | 11101-1046 | Approximate Price: $50 Cut to 4" W x 36" L Note: This particular vellum comes as a roll; we kept it on the roll and cut it to 4" W. Mylar or frosted plexiglass could also be used in place of the vellum, but the camera software detection settings would need to be adjusted. |
| Logitech HD Pro Webcam C920, 1080p | Amazon | Approximate Price: $50 | |
| Mobile Laptop Computer Desk Cart Height-Adjustable | Amazon | Approximate Price: $40 Small table to place the animals' home cage on at the end of the walkway. |
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| Plastic ramp | Pets Warehouse | Approximate Price: $6 Optional: Ramp to assist the animals descend into home cage |
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| RetiCAM Tabletop Tripod with 3-Way Pan/Tilt Head | Amazon | Approximate Price: $30 | |
| SCIGRIP #16 solvent cement for acrylic - clear, medium bodied | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Plexiglass table | Approximate Price: $ | ||
| 15 series 80/20 framing pieces, 1.5" x 1.5" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1515 | Approximate Price: $110 6 pieces cut to 36" L, 2 pieces cut to 12" With both ends tapped with standard 5/16-18 threads Framing for the plexiglass table top and table legs |
| 15 series 3 Way - Light Squared Corner Connector | 80/20 Inc. | 14177 | Approximate Price: $24 4 connectors To connect the table top and legs |
| 1/4" clear plexiglass sheet | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 Cut at 15" W x 39" L |
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| 5/16-18 x 1" Button Head Socket Cap Screw | 80/20 Inc. | 3118 | Approximate Price: $5 Quantity = 12 |
| Deluxe Leveling Feet, 5/16-18 x 2" | 80/20 Inc. | 2194 | Approximate Price: $50 Quantity = 4 For table legs |
| “T” Handle Ball End Hex Wrench, 3/16" | 80/20 Inc. | 6000 | Approximate Price: $5 |
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