Protocatechuato 3,4-dioxygenase (PCD) pode enzimática remover o oxigênio diatômico livre de um sistema aquoso usando seu ácido protocatechuic substrato (PCA). Este protocolo descreve a expressão, purificação e análise de atividade desta enzima de limpeza de oxigênio.
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Artigo de método
Expressão e purificação do protocatechuato de oxigênio sem nuclease 3,4-Dioxigenase
Neste artigo
Resumo
Resumo
A microscopia de molécula única (SM) é usada no estudo de interações moleculares dinâmicas de biomoléculas rotuladas por fluorofóforos em tempo real. No entanto, os fluorofônicos são propensos à perda de sinal através do fotobranqueamento por oxigênio dissolvido (O2). Para evitar o reclareamento e estender a vida fluorofônica, os sistemas de limpeza de oxigênio (OSS) são empregados para reduzir O2. OsS comercialmente disponíveis podem ser contaminados por nucleases que danificam ou degradam os ácidos nucleicos, confundindo a interpretação dos resultados experimentais. Aqui detalhamos um protocolo para a expressão e purificação de pseudomonas altamente ativas putida protocatechuato-3,4-dioxigenase (PCD) sem contaminação por nuclease detectável. Pcd pode remover eficientemente reativo O2 espécies através da conversão do ácido protocatecogênico substrato (PCA) para 3-carboxy-cis, ácido cis-muconic. Este método pode ser usado em qualquer sistema aquoso onde O2 desempenha um papel prejudicial na aquisição de dados. Este método é eficaz na produção de PCD altamente ativo, livre de nuclease em comparação com PCD comercialmente disponível.
Introdução
A biofísica de molécula única (SM) é um campo em rápido crescimento mudando a forma como olhamos para fenômenos biológicos. Este campo tem a capacidade única de ligar as leis fundamentais da física e da química à biologia. A microscopia da fluorescência é um método biofísico que pode alcançar a sensibilidade do SM. Fluorescência é usada para detectar biomoléculas, ligando-os a pequenos fluorofônicos orgânicos ou pontos quânticos1. Estas moléculas podem emitir fótons quando excitados por lasers antes do photobleaching irreversivelmente2. Photobleaching ocorre quando os rótulos fluorescentes sofrem danos químicos que destr....
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Protocolo
1. Induzir a expressão pcd em E. coli
- Combine 1 μL pVP91A-pcaHG PCD expressão plasmid (20 ng/μL, Figura 1A)e 20 μL de E.coli BL21 (20 μL células comercialmente disponíveis, > 2 x 106 cfu/μg plasmid) em um tubo. Agite o tubo para misturar. Coloque o tubo no gelo 5 min.
- Coloque a transformação em 42 °C para 30 s. Em seguida, gelo 2 min.
- Adicionar 80 μL SOC media (super caldo ideal com repressão catabolite: 2,5 mM KCl, 10 mM NaCl, 2% tryptone, extrato de levedura de 0,5%, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2, 20 mM glicose). Agite a 225 revoluções por min (....
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Resultados
Pcd de scavenger de oxigênio comercialmente disponível é freqüentemente contaminado com uma nuclease de DNA. Contaminar a atividade da nuclease pode levar a resultados espúrios em estudos fluorescentes, particularmente estudos que analisam proteínas interagindo com DNA ou DNA. Descobrimos que pcd recombinante, um heterodimer de hexahistidina marcado pcaH e pcaG, pode ser expressa em E. coli (Figura 1). O heterodimero é primeiro purificado pela cromatografia d.......
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Discussão
Sistemas de limpeza de oxigênio são comumente incluídos na microscopia de fluorescência de molécula única para reduzir o fotobranqueamento3,7,8. Essas técnicas de microscopia são freqüentemente usadas para observar ácidos nucleicos ou interações proteicas com ácidos nucleicos1,13,14. A contaminação dos SEs com nucleases pode levar a res.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo NIH GM121284 e AI126742 para key.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M3148 | β ME |
| Solução de acrilamida e bis-acrilamida a 30%, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ácido acético, Ágar ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| , Granulado | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| Sistema AKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900 e Frac-920 | |
| Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-2 | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Sulfato de ferro amônio (II) hexahidratado | Sigma | F-2262 | |
| Persulfato de amônio (APS) Comprimidos | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicilina | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Triptona | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Aditivo de Mídia de Cultura Desidratada BD Bacto: Extrato de Levedura de Garrafa | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propano,>=99.0% (titulação) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Azul de Bromofenol | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Azul Brilhante | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96– Bem Plano– Placa inferior EIA | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT Dulbecco's | |
| Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Brometo de etídio | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Caldo LB granulado Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Agirose padrão de alta resolução | AGTC | Bioproducts AG500D1 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptina | Roche | 11017128001 | |
| Lisozima de clara de ovo de galinha | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Cloreto de Magnésio Hexahidratado | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Espectrofotômetro, com capacidade de cuvet | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Células Competentes | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC mídia incluída |
| Laranja G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pestatina | Ouro Biotecnologia | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Ácido protocatecuico | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Dodecil sulfato de sódio | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Unidades de filtro descartáveis estéreis com membrana PES > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Unidades de filtro descartáveis estéreis com membrana PES > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 gerador de imagens fluorescentes de modo variável | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
Referências
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen....
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Reimpressões e permissões
