Artigo de método

Expressão e purificação do protocatechuato de oxigênio sem nuclease 3,4-Dioxigenase

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DOI:

10.3791/59599

⸱

8 de novembro de 2019

 ,  ,  , 
1Cancer Biology and Genetics, College of Medicine, The Ohio State University

Neste artigo

Resumo

Protocatechuato 3,4-dioxygenase (PCD) pode enzimática remover o oxigênio diatômico livre de um sistema aquoso usando seu ácido protocatechuic substrato (PCA). Este protocolo descreve a expressão, purificação e análise de atividade desta enzima de limpeza de oxigênio.

Resumo

A microscopia de molécula única (SM) é usada no estudo de interações moleculares dinâmicas de biomoléculas rotuladas por fluorofóforos em tempo real. No entanto, os fluorofônicos são propensos à perda de sinal através do fotobranqueamento por oxigênio dissolvido (O2). Para evitar o reclareamento e estender a vida fluorofônica, os sistemas de limpeza de oxigênio (OSS) são empregados para reduzir O2. OsS comercialmente disponíveis podem ser contaminados por nucleases que danificam ou degradam os ácidos nucleicos, confundindo a interpretação dos resultados experimentais. Aqui detalhamos um protocolo para a expressão e purificação de pseudomonas altamente ativas putida protocatechuato-3,4-dioxigenase (PCD) sem contaminação por nuclease detectável. Pcd pode remover eficientemente reativo O2 espécies através da conversão do ácido protocatecogênico substrato (PCA) para 3-carboxy-cis, ácido cis-muconic. Este método pode ser usado em qualquer sistema aquoso onde O2 desempenha um papel prejudicial na aquisição de dados. Este método é eficaz na produção de PCD altamente ativo, livre de nuclease em comparação com PCD comercialmente disponível.

Introdução

A biofísica de molécula única (SM) é um campo em rápido crescimento mudando a forma como olhamos para fenômenos biológicos. Este campo tem a capacidade única de ligar as leis fundamentais da física e da química à biologia. A microscopia da fluorescência é um método biofísico que pode alcançar a sensibilidade do SM. Fluorescência é usada para detectar biomoléculas, ligando-os a pequenos fluorofônicos orgânicos ou pontos quânticos1. Estas moléculas podem emitir fótons quando excitados por lasers antes do photobleaching irreversivelmente2. Photobleaching ocorre quando os rótulos fluorescentes sofrem danos químicos que destrói sua capacidade de excitar no comprimento de onda desejado2,3. A presença de espécies reativas de oxigênio (ROS) em tampão aquoso são uma das principais causas de fotobranqueamento2,4. Além disso, o ROS pode danificar biomoléculas e levar a observações errôneas nos experimentos sm5,6. Para evitar danos oxidativos, os sistemas de limpeza de oxigênio (OSS) podem ser usados3,7,8. O sistema de oxidase/catalase de glicose (GODCAT) é eficiente na remoção de oxigênio8,mas produz peróxidos potencialmente prejudiciais como intermediários. Estes podem ser prejudiciais para biomoléculas de interesse em estudos de SM.

Alternativamente, o protocatechuato 3,4 dioxygenase (PCD) removerá eficientemente O2 de uma solução aquosa usando seu ácido protocatechuic substrato (PCA)7,9. PCD é uma metalloenzima que usa ferro autónomos para coordenar PCA e catalisar a reação de abertura do anel catechol usando dissolvido O210. Esta reação de um passo é mostrado para ser um oss global melhor para melhorar a estabilidade do fluorofóbico em experimentos SM7. Infelizmente, muitas enzimas oss comercialmente disponíveis, incluindo PCD, contêm nucleases contaminantes11. Esses contaminantes podem levar ao dano de substratos à base de ácido nucleico usados em experimentos com SM. Este trabalho irá elucidar um protocolo de purificação à base de cromatografia para o uso de PCD recombinante em sistemas de SM. Pcd pode ser amplamente aplicado a qualquer experimento onde ROS estão prejudicando os substratos necessários para a aquisição de dados.

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Protocolo

1. Induzir a expressão pcd em E. coli

  1. Combine 1 μL pVP91A-pcaHG PCD expressão plasmid (20 ng/μL, Figura 1A)e 20 μL de E.coli BL21 (20 μL células comercialmente disponíveis, > 2 x 106 cfu/μg plasmid) em um tubo. Agite o tubo para misturar. Coloque o tubo no gelo 5 min.
  2. Coloque a transformação em 42 °C para 30 s. Em seguida, gelo 2 min.
  3. Adicionar 80 μL SOC media (super caldo ideal com repressão catabolite: 2,5 mM KCl, 10 mM NaCl, 2% tryptone, extrato de levedura de 0,5%, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2, 20 mM glicose). Agite a 225 revoluções por min (rpm) 37 °C por 1 h.
  4. Placa a reação de transformação em LB Amp Agar (1L Luria Caldo ágar: 10 g NaCl, 10 g bacto-tripptone, 5 g de extrato de levedura, 15 g de ágar, 50 μg/mL ampicilina; 25 mL por 10 cm de diâmetro placa de Petri).
  5. Incubar a placa, tampa virada para baixo, em 37 °C para 16-18 h.
  6. Inoculate 50 mL LB Amp (1L LB: 10 g bacto-tripptone, 10 g NaCl, extrato de fermento 5g, 50 μg/mL ampicilina) em um frasco de 250 mL Erlenmeyer com uma colônia. Incubar a 37 °C para 16-18 h tremendo em 225 rpm.
  7. Transfira a cultura de 20 mL para um frasco 4 L com 1 L LB Amp. Agite a 225 rpm a 37 °C.
  8. Cada h mede a cultura OD600 (densidade óptica em 600 nm). À medida que a cultura OD600 se aproxima de 0,5, aumentar a freqüência de medições para cada 15 min. A densidade desejada da cultura é de 0,5 OD600.
  9. Transfira o frasco 4L para uma caixa de gelo. Agite o frasco no banho de gelo para reduzir a temperatura da cultura.
    Nota: O tempo no gelo deve ser mantido a um mínimo de modo que as pilhas permaneçam metabolicamente ativas. Idealmente, as células estarão no gelo menos de 10 min.
  10. A indução bem-sucedida da PCD pode ser observada desnatando a análise do sulacril de poliacrilde gel de poliacrilúfo (SDS-PAGE) de sódio. Colheita 1 mL da cultura não induzida em um tubo. Gire a amostra 1 min a 14.000 x g em uma microfúgio a temperatura ambiente. Decantar o supernatant.
    1. Solubilize as células pelleted em 150 μL PBS (soro lógico tampão de fosfato).
    2. Adicione um volume igual de tine de carregamento 2X (1,2% SDS, 30% glicerol, 150 mM Tris-HCl, pH 6.8, 0.0018% bromehenol azul, 15% β-mercaptoethanol). Vortex a amostra para misturar completamente.
    3. Ferva a amostra por 3 min e transfira para o gelo. A amostra pode ser armazenada em um freezer -20 °C para análise futura.
      Nota: PBS está disponível comercialmente com ou sem CaCl2 e MgCl2. Muitos laboratórios terão PBS sem CaCl2 e MgCl2 para métodos de cultura celular. Nós não encontramos nenhuma diferença com PBS com ou sem CaCl2 e MgCl2.
  11. Transfira o frasco 4 L para uma incubadora a 17 °C com 180 rpm tremendo. Continue monitorando o OD600 a cada 20 min.
  12. Em 0,7 OD600 adicionar isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) para 0,5 mM concentração final (0,25 M solução de estoque) e 10 mg / L ferro amônio (II) hexahidrato de sulfato (Fe (NH4)2(SO4)2, 10 mg / mL solução de ações). Os genes PCD pcaH e pcaG são induzidos pelo promotor T5 pela adição do IPTG (Figura 1A). O sulfato de ferro é encadernado pela PCD e necessário para a atividade catalítica coordenando o oxigênio durante a abertura do catechol.
  13. Agite a cultura a 180 rpm a 17 °C por 18 h.
  14. Coloque o frasco de cultura no gelo como em 1,2. Colheita 1 mL das células induzidas para SDS-PAGE como em 1,3.
  15. Despeje a cultura bacteriana para garrafas apropriadas para centrífuga. Uma cultura de 1 L pode ser centrífuga em 4 garrafas de fundo cônico sacásmicos mL. Pelota a cultura em 4 °C para 20 min em 3000 x g. Decant os supernatants. Descarte de resíduos líquidos bacterianos adequadamente.
  16. Pipet para resuspender as pelotas em 25 mL FRIO PBS (CaCl2 e MgCl2 são opcionais) por 1 L cultura.
  17. Transfira a resuspensão para tubos cônicos de 50 mL (tubo de 1 50 mL por cultura 1 L). Pelotas as células a 3000 x g por 20 min a 4 °C. Decantar o supernatant e dispor adequadamente.
  18. Resuspender as células em 10 mL de ltampão de lse (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 20 mM imidazole, 10% glicerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin, e 87.1 μg/mL fenilmethylsulfonyl fluoreto (PMSF)) por pipetting. Congele a resuspensão com nitrogênio líquido em um frasco de Dewar. Guarde os tubos de amostra em um freezer de -80 °C. Nós purificamos PCD de pelotas armazenadas a -80 °C por um ano sem aparente perda de atividade.
  19. Compare as células não induzidas e induzidas por SDS-PAGE.
    Nota: Nós não tivemos nenhuma dificuldade com a indução do heterodimer do PCD. No entanto, recomendamos testar a indução antes de continuar com a purificação no caso de qualquer reagente ter expirado inesperadamente.
    1. Monte placas para SDS-PAGE (dimensões: 7,3 cm x 8,3 cm x 0,75 mm de espessura). O gel de empilhamento é de 1,5 mL 6% de poliacrilamida (6% de acrilamida, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% de persulfato de amônio, 0,001% TEMED). O gel de resolução é de 3,5 mL 12% de poliacrilamida (12% de acrilamida, 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% de persulfato de amônio, 0,001% TEMED). Insira um pente de 10 poços na camada de empilhamento.
    2. Carga 10 μL de amostras bacterianas não induzidas e induzidas. Carga 4 μL de marcadores de peso molecular prestaminado para proteínas (Figura 1B).
    3. Eletroforrese o gel em 16,5 V / cm aproximadamente 1 h. O bromehenol azul deve chegar ao fundo do gel.
    4. Coloque o gel em coomassie mancha azul (10% de ácido acético, 40% metanol, 0,1% coomassie corante azul) em uma banheira de plástico. A mancha deve mergulhar completamente o gel. Mancha na temperatura ambiente para 20 min. A rotação delicada durante a coloração é opcional.
    5. Substitua a solução por destain (ácido acético de 10%, 40% metanol). Incubar a temperatura ambiente com rotação suave opcional até que as bandas de proteína são facilmente visíveis.
    6. Substitua o destain por água desionizada. Entre as proteínas bacterianas, as subunidades induzidas por PCD devem ser visíveis nas células induzidas. Hexahistidina marcado PCD subunidade pcaH tem um peso molecular de 28,3 kDa e a subunidade pcag é de 22,4 kDa. Se as subunidades pcd não são aparentes, uma nova indução derivada de uma nova colônia deve ser realizada.

2. Purificação de cromatografia de afinidade de níquel de PCD

  1. Descongele no gelo um tubo de 50 mL de células induzidas. Pode levar 2-3 h para descongelar completamente a amostra.
  2. Mantendo o tubo no gelo, sonicate a amostra em 30% de amplitude para 1 min, ciclismo 1 s dentro e fora. Use um microtip cônico (diâmetro 0.125 polegadas) sonicator. A potência máxima é de 400 W e a frequência é de 20 kHz e por 1 L de pelota cultural.
  3. Após a sonorização, adicione o lysozyme a 0,2 mg/mL concentração final (10 mg/ml de solução de estoque) e mantenha o gelo por 30 min a 4 °C.
  4. Despeje o lisato bacteriano em uma garrafa de policarbonato pré-refrigerada (dimensões: 25 mm x 89 mm). A garrafa deve ser compatível com um rotor de ultracentrífuga de ângulo fixo. Outros tubos e/ou rotores podem ser substituídos, mas a força de gravitação final deve ser mantida.
  5. Centrífuga por 60 min a 120.000 x g a 4 °C. Os detritos celulares formarão uma pelota. O supernatant pode parecer amarelo.
    1. A pelota pode ser incluída na análise sds-PAGE subsequente para determinar a solubilidade do PCD(Figura 1B). Solubilize a pelota vórtice em 10 mL PBS. Transfira 150 μL para um tubo de 1,5 mL. Prepare a amostra para SDS-PAGE como em 1,3.
  6. Despeje o supernatant a um tubo cônico frio de 50 mL. Observe o volume. A contaminação do supernatant com ADN bacteriano pode render uma amostra viscosa. O DNA genômico bacteriano pode bloquear o fluxo da coluna. A etapa ultracentrifugation 2.2 deve ser repetida para pelota o ADN bacteriano. Uma pelota desta segunda rotação não pode ser facilmente visível ou pode ser transparente.
  7. Faça 500 mL Ni Buffer A (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 e 10% glicerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin e 87.1 μg/mL PMSF) e 500 mL Ni Buffer B (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10% glicerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin, e 87.1 μg/mL PMSF, 250 mM imidazole, pH 8.0). Passe ambos os Buffers Ni através de filtros de poros de 0,2 μm.
  8. A amostra, amortecedores e o sistema FPLC (cromatografia líquida de proteína rápida) estão em uma sala refrigerada a 4 °C. Lave a bomba A com O Amortecedor A e a bomba B com o Ni Buffer B. Lave o sistema com 20 mM imidazole (8% Ni Buffer B, 92% Ni Buffer A) até que o UV e a condutividade se estabilizem. Nós rotineiramente fluxo tampões em 5 mL/min com um limite de pressão de 1,0 MPa. A taxa de fluxo e o limite de pressão devem ser determinados pelas especificações do instrumento FPLC utilizado.
  9. Prepare uma coluna com resina de níquel de 1,5 mL (dimensões: 110 mm de comprimento x 5 mm). A capacidade de ligação com resina é de 50 mg/mL e pode tolerar a pressão de 1 MPa. Uma coluna pode ser derramada e armazenada a 4 °C antes da purificação.
    Nota: O tamanho da coluna pode ser proporcionalmente aumentado para acomodar mais de um tubo de 50 mL de células induzidas se for necessária mais proteína. Preferimos uma coluna fresca para cada preparação para garantir que nenhuma proteína residual contaminar a nossa proteína desejada. No entanto, as resinas de níquel podem ser recicladas de acordo com as instruções do fabricante.
  10. Anexe a coluna de resina carregada de níquel ao FPLC. Executar 20 mL de 92% Ni Buffer A e 8% Ni Buffer B (20 mM imidazole) a 0,5 mL/min com um limite de pressão de 0,5 MPa através da coluna para equilibrar. Em tempo real, o FPLC deve medir A280 (280 nm uv absorção), bem como a condutividade. Se esses valores não se estabilizarem após o volume de 20 mL ter passado pela coluna, flua os buffers até que se estabilizem.
  11. Carregue a amostra na coluna (~10 mL) a 0,15 mL/min. Defina o limite de pressão para 0,5 MPa. Colete o fluxo.
  12. Lave a coluna com 20 mL Ni Buffer a 20 mM imidazole (92% Ni Buffer A e 8% Ni Buffer B). Mantenha a lavagem em um tubo de 50 mL para análise. Lave a coluna com 15 mL de 50% Ni Buffer A e 50% Ni Buffer B (125 mM imidazole). Colete a elução em 19 frações de volume de 0,8 mL. Lave a coluna com 15 mL 100% Ni Buffer B. Colete um adicional de 75 frações de 0,2 mL. Algum heterodimer pcd vai elute na lavagem 50% Ni Buffer B, mas a maioria do heterodimer vai elute na lavagem 100% Ni Buffer B.
  13. Analise frações coletadas em géis sds-PAGE de 12% para confirmar a presença de PCD. Adicione volumes iguais de tingelo de carregamento 2X ao fluxo através, lave e pico A280 frações. Ferva por 3 min. Transferência para o gelo. Despeje dois 12% sds-page géis (como no passo 1.7). Repita o método do gel como descrito em 1.7.

3. Ensaio de atividade de nuclease

  1. Com base na análise SDS-PAGE, identifique frações de afinidade de níquel que contenham PCD quase puro. Combine 5 μL chromatography fraction and 500 ng 3 kb supercoiled plasmid pXba+ in reaction buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.1 mM DTT) com um volume final de 50 μL.
    1. Incubar a 37 °C para 1 h.
    2. Inclua um controle negativo (sem proteína adicional) e um controle positivo (PCD disponível comercialmente). Pare a reação com a solução de parada de 10 μL (150 mM EDTA, pH 8.0, 0,6% SDS, 18% glicerol, 0,15% Orange G).
    3. As amostras podem ser mantidas em um congelador -20°C a ser analisado mais tarde. Qualquer plasmídeo supercoiled pode ser usado em um ensaio nuclease, desde que os produtos de reação círculo supercoiled e relaxado pode ser resolvido por eletroforese de gel agarose.
  2. Despeje um 120 mL 1% de agarose gel em 1X TAE ethidium buffer (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA, 0,5 μg/mL ethidium brometo) em um molde de gel (dimensões: 15 x 10 cm). Use um pente de 15 poços (dimensões de poço: 5mm x 1,5 mm). Quando o gel se ajustou, mergulhe-o no tampão do etidium de 1X TAE.
  3. Analise 30 μL das reações por gel agarose. Eletroforrese a 10 V/cm a temperatura ambiente por aproximadamente 1 h. A frente de corantes Orange G deve ser no final do gel.
  4. Use um scanner de fluorescência para imagem imediata do sinal de brometo de etídio do gel. Se um plasmid de 3 kb foi usado, a faixa mais lenta será círculos relaxados em ~ 3,5 kb, DNA linear será executado em 3 kb, e plasmid supercoiled terá a mobilidade mais rápida em ~ 2 kb.
    1. Calcule o volume total de pixels de cada pista com software de análise de imagem.
    2. Determine o volume de pixels das várias espécies de DNA, como círculos supercoiled, lineares e cortados. Use esses valores para determinar a porcentagem de cada espécie de DNA. Por exemplo, o aumento da presença de círculos cortados associados a uma fração em comparação com o controle negativo indica a presença de nuclease. O volume de pixels de círculos cortados em uma pista é dividido pelo valor pixel do DNA total. Determine uma porcentagem multiplicando esse número em 100.
  5. Combine frações do segundo pico de elução que contêm heterodemer PCD quase puro com base na análise SDS-PAGE e têm atividade de nuclease mínima a indetectável. Nosso volume combinado típico é ~2 mL.
  6. Carregue a amostra em uma unidade de filtro centrífuga com um corte de peso molecular de 10 kDa. Centrífuga em uma centrífuga balançando balde em 4000 x g por 40 min em 4 °C. Alternativamente, um rotor de ângulo fixo de 35° pode ser usado a 7500 x g por 20 min a 4 °C.
    1. Repita a centrífugação até que o volume final retentate é 100-200 μL.
    2. Inverta a unidade de filtro e recupere o retentato por centrífuga a 1000 x g por 2 min a 4 °C.

4. Purificação de cromatografia de exclusão de tamanho da PCD

  1. Faça 250 cromatografia de tamanho mL (SEC) em execução buffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10% glicerol, 0.1 mM EDTA, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin, e 87.1 μg/mL PMSF). Passe o buffer através de um filtro de poros de 0,2 μm e guarde a 4 °C.
    Nota: Executar todas as etapas em uma sala refrigerada em 4 °C. A purificação da SEC é opcional, mas a proteína deve ser armazenada no tampão de execução da SEC. Se a purificação da SEC for omitida, o retentato coletado em 3,6,2. deve ser dilacerada contra 1 L de buffer SEC em 10 kDa MWCO (peso molecular cortado) tubos de diálise em 4 °C durante a noite.
  2. Equilibre uma coluna de agarose SEC (cromatografia de exclusão de tamanho) (dimesions: 10 mm x 300 mm; 24 mL bed volume; 25 - 500 μL sample volume; 1.5 MPa pressure limit; 2 x 106 Da exclusion limit; 1 to 300 kDa separation) with SEC Running Buffer at 0.5 mL/min.
    Nota: Se desejações colunas de tamanho alternativo SEC podem ser usadas.
  3. Carregue as frações concentradas em um ciclo de injeção de volume de 200 μL. Carregue a amostra a 0,5 mL/min na coluna. A resolução da SEC aumenta com menor volume de carga. Elute com 23 mL SEC executando buffer e coletar 94 frações de 250 μL. O cromatograma sec deve resolver um único pico A280 que é o heterodimer PCD. Descobrimos que o PCD elutes 8,9 mL. O tempo de elução mudará com colunas alternativas da SEC.

5. Oxidação pca e nuclease atividade ensaios

  1. As reações ao ensaio tanto da oxidação da PCA quanto da atividade nuclease são realizadas em uma placa de fundo plano de 96 poços. Monte reações em uma placa de 96 poços no gelo em uma sala fria de 4 °C para evitar a catálise prematura. Combine em um volume final de 50 μL: 130 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2,0.1 mM DTT, 5 mM PCA, 10 ng/mL supercoiled plasmid pXba+, e 10 μL de frações individuais pcd SEC.
    Nota: As frações PCD SEC devem ser adicionadas por último e imediatamente antes da análise, pois a proteína começará a catalisada no momento da adição.
  2. A oxidação de PCD da PCA resulta em absorção reduzida de PCA a 290 nm (A290). Transfira a placa de 96 poços para o suporte da placa de um leitor de placa definido para uma temperatura interna de 37 °C. Retraia o suporte da placa no instrumento e mede A290 em intervalos de 20 s para 1 h. Tenha o instrumento agitar a placa 5 s antes de cada leitura.
  3. Após 1 h, encerre as reações adicionando a solução de parada de 10 μL (150 mM EDTA, pH 8.0, 0,6% SDS, 18% glicerol, 0,15% Orange G).
  4. Prepare, carregue e execute um gel agarose como no passo 3.2.
  5. Imagem e analisar o gel agarose como na etapa 3.3.
  6. Selecione frações com maior atividade de oxidação de PcA e nenhuma contaminação por nuclease observada para armazenamento a longo prazo a -80 °C. Medir o A280.
  7. Calcule a concentração total de PCD usando o A280 e o coeficiente de extinção (ε280)de 734.700 M-1cm-1.
  8. Snap congelar frações individuais em nitrogênio líquido. Guarde em um freezer de -80°C. Alternativamente, combinar infrações ativas, livres de nuclease, alíquota, e congelar da mesma forma. Nosso rendimento típico é 1-2 mg PCD por cultura L. O uso típico em um experimento sm é de 3 μg PCD. Usamos PCD armazenado a -80 °C por até 1 ano sem diminuição na atividade.

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Resultados

Pcd de scavenger de oxigênio comercialmente disponível é freqüentemente contaminado com uma nuclease de DNA. Contaminar a atividade da nuclease pode levar a resultados espúrios em estudos fluorescentes, particularmente estudos que analisam proteínas interagindo com DNA ou DNA. Descobrimos que pcd recombinante, um heterodimer de hexahistidina marcado pcaH e pcaG, pode ser expressa em E. coli (Figura 1). O heterodimero é primeiro purificado pela cromatografia d...

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Discussão

Sistemas de limpeza de oxigênio são comumente incluídos na microscopia de fluorescência de molécula única para reduzir o fotobranqueamento3,7,8. Essas técnicas de microscopia são freqüentemente usadas para observar ácidos nucleicos ou interações proteicas com ácidos nucleicos1,13,14. A contaminação dos SEs com nucleases pode levar a res...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo NIH GM121284 e AI126742 para key.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-MercaptoetanolSigma-AldrichM3148β ME
Solução de acrilamida e bis-acrilamida a 30%, 29:1Bio-Rad161-0156
Ácido acético, Ágar ACSFisherl ChemicalA38C-212
, GranuladoBD BiosciencesDF0145-17-0
Sistema AKTA FPLCGE Healthcare Life SciencesAKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900 e Frac-920
Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-2EMD MilliporeUFC20102410 kDa MWCO
Sulfato de ferro amônio (II) hexahidratadoSigmaF-2262
Persulfato de amônio (APS) ComprimidosAmrescoK833-100TABS
AmpicilinaAmresco0339-25G
Bacto TriptonaBD BiosciencesDF0123173
Aditivo de Mídia de Cultura Desidratada BD Bacto: Extrato de Levedura de GarrafaVWR90004-092
BIS-TRIS propano,>=99.0% (titulação)Sigma-AldrichB6755-500G
Azul de BromofenolSigma-AldrichB0126-25G
Coomassie Azul BrilhanteAmresco0472-50G
Costar 96– Bem Plano– Placa inferior EIABio-Rad2240096EDU
DTTP212121SV-DTT Dulbecco's
Phosphate Buffered Saline 500MLSigma-AldrichD8537-500MLPBS
Brometo de etídioThermo Fisher ScientificBP1302
GlicerolFisher ScientificG37-20
Caldo LB granulado MillerEMD Biosciences1.10285.0500
Agirose padrão de alta resoluçãoAGTCBioproducts AG500D1
ImidazolSigma-AldrichI0250-250G
IPTGGoldbioI2481C25
LeupeptinaRoche11017128001
Lisozima de clara de ovo de galinhaSigma-AldrichL6876-1G
Cloreto de Magnésio HexahidratadoAmresco0288-1KG
Microvolume Espectrofotômetro, com capacidade de cuvetThermo FisherND-2000C
NaClP212121RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml)Qiagen30430
Novagen BL21 Células CompetentesEMD Millipore69-449-3SOC mídia incluída
Laranja GFisher Scientific0-267
PestatinaOuro BiotecnologiaP-020-25
PMSFAmresco0754-25G
Ácido protocatecuicoFisher ScientificICN15642110PCA
Dodecil sulfato de sódioP212121CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate ReaderMolecular Devises
Unidades de filtro descartáveis estéreis com membrana PES > 250mLThermo Fisher Scientific09-741-04
Unidades de filtro descartáveis estéreis com membrana PES > 500mLThermo Fisher Scientific09-741-02
Superose 12 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences17517301
TEMEDAmresco0761-25ML
Tris Ultra PureGojira Fine ChemicalsUTS1003
Typhoon 9410 gerador de imagens fluorescentes de modo variávelGE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTAInvitrogen/Gibco15575
ZnCl2Sigma-Aldrich208086
com certificação glacial

Referências

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