Summary
Här presenterar vi ett protokoll för en in vitro-Scratch analys med hjälp av primära fibroblaster och för en in vivo hud sårläkning analys i möss. Båda analyserna är enkla metoder för att bedöma in vitro-och in vivo sårläkning.
Abstract
Försämrad kutan sårläkning är ett stort bekymmer för patienter som lider av diabetes och för äldre människor, och det finns ett behov av en effektiv behandling. Lämpliga in vitro-och in vivo-metoder är viktiga för att identifiera nya målmolekyler för läkemedelsbehandlingar för att förbättra hudens sårläkningsprocess. Vi identifierade β3 subenhet av spännings-gated kalciumkanaler (cavβ3) som en potentiell målmolekyl för att påverka sårläkning i två oberoende analyser, dvs in vitro Scratch migration assay och in vivo dorsala skinfold kammar modell. Primär mus embryonala fibroblaster (MEFs) akut isolerade från Wild-Type (WT) och CAVβ3-bristfällig möss (CAVβ3 Ko) eller FIBROBLASTER akut isolerade från WT möss som behandlats med siRNA att besegra-reglera uttrycket av Cacnb3 genen , kodning av CAVβ3, användes. En repa applicerades på en enskiktslager i konfluenta-cellen och gapet stängdes av med mikroskopiska bilder vid definierade tidpunkter tills fullständig återinsättning av gapet av de migrerande cellerna. Dessa avbildningar analyserades och cell flyttnings hastigheten bestämdes för varje villkor. I en in vivo-analys, implanterade vi en dorsala skinfold kammare på WT och Cavβ3 KO möss, tillämpat ett definierat cirkulär sår på 2 mm diameter, täckte såret med ett glas täckglasburk för att skydda den mot infektioner och uttorkning, och övervakade makroskopiskt sår stängning med tiden. Såret stängning var betydligt snabbare i Cacnb3-gen-brist möss. Eftersom resultaten av in vivo-och in vitro-analyserna korrelerar väl, kan in vitro-analysen vara användbar för den högpresterande screeningen innan validerar in vitro-träffar av in vivo-sårläknings modellen. Vad vi har visat här för Wild-Type och CAVβ3-brist möss eller celler kan också vara tillämpliga för specifika molekyler än Cavβ3.
Introduction
Hud sårläkning börjar omedelbart efter hud skadan för att återställa hudens integritet och för att skydda organismen från infektioner. Sårläkningsprocessen går igenom fyra överlappande faser; koagulation, inflammation, ny vävnadsbildning, och vävnad remodeling1. Cell migration är avgörande under dessa faser. Inflammatoriska celler, immunceller, keratinocyter, endotelceller, och fibroblaster aktiveras vid olika tidpunkter och invadera såret område2. Metoder för att undersöka sårläkning in vitro och in vivo är av stort intresse inte bara för att förstå de bakomliggande mekanismerna utan också för att testa nya läkemedel och utveckla nya strategier som syftar till att lindra och påskynda hudens sårläkning.
För att övervaka och analysera cellmigrering kan Scratch migration-analysen användas. Det benämns ofta som in vitro sårläkning assay. Denna metod kräver en cellkultur anläggning3. Det är ett enkelt förfarande, det finns inget behov av hög-end utrustning och analysen kan utföras i de flesta cellbiologi laboratorier. I denna analys, ett cellfritt område skapas genom den mekaniska störningar i en konfluenta cell monolayer, företrädesvis epitelial-eller endothelial-liknande celler eller fibroblaster. Celler på kanten av Scratch kommer att migrera för att återbefolka den skapade klyftan. Kvantifiering av det minskande cell fria området över tiden liknar migreringshastigheten och anger den tid som cellerna behöver för att stänga gapet. För detta ändamål kan utredarna använda antingen akut isolerade celler från WT möss eller möss som saknar en gen av intresse4, eller förevigade celler tillgängliga från pålitliga cell förråd. Scratch-analysen gör det möjligt att studera påverkan av farmakologiskt aktiva föreningar eller effekten av transfekterade cdnas eller sirnas på cell migration.
In vivo, sårläkning är en komplex fysiologisk process, som kräver olika celltyper inklusive keratinocyter, inflammatoriska celler, fibroblaster, immunceller och endotelceller för att återställa hudens fysiska integritet så snabbt som möjligt1 . Olika metoder för att studera in vivo sårläkning har utvecklats och använts under de senaste5,6,7,8. Den dorsala skinfold kammare som beskrivs i denna artikel har tidigare använts för sårläkning analyser9. Det används som en modifierad dorsala skinfold kammare förberedelse för möss. Den modifierade skinfold kammar modellen har flera fördelar. 1) det minimerar hudens kontraktion, vilket förhindrar observation av sårläkningsprocessen och kan påverka sårreparation hos möss. 2) denna kammare använder sig av att täcka såret med en glastäckslip, minska vävnads infektioner och uttorkning, vilket kan fördröja läkningsprocessen. 3) blodflöde och vaskularisering kan övervakas direkt. 4) det möjliggör repetitiv topikal applicering av farmakologiskt aktiva föreningar och reagenser för att behandla såret och påskynda läkning9,10.
Vi identifierade β3 subenhet av högspännings-gated kalciumkanaler (cavβ3) som en potentiell målmolekyl för att påverka huden sårläkning med hjälp av två oberoende protokoll, dvs in vitro Scratch migration assay och in vivo dorsala skinfold kammar modell. För in vitro-analysen, vi använde primära fibroblaster, dessa celler uttrycker Cacnb3 gen kodning av Cavβ3-proteinet men saknar depolarisering-inducerad ca2 + tillströmning eller spänningsberoende ca2 + strömmar. Vi beskrev en roman funktion av Cavβ3 i dessa fibroblaster: Cavβ3 binder till inositol 1, 4,5-trisphosphate receptor (IP3R) och begränsningar kalcium frisättning från endoplasmatiska Retikulum. Borttagande av Cacnb3 genen hos möss leder till ökad känslighet i IP3R för IP3, förbättrad cell migration och ökad hud sår reparation4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer godkändes och utfördes i enlighet med etik förordningarna och djurskydds kommittéerna vid Saarlands och Saarlands universitet.
1 primär cellkultur och siRNA-transfektion
Anmärkning: i den beskrivna metoden används primära fibroblaster. Dessa celler spelar en avgörande roll i sårläkning och vävnad remodeling11. I detta experiment, den Cacnb3 genen, kodning av cavβ3 subenhet av högspännings-gated kalciumkanaler12 var Down-reglerat, vilket visar dess roll i cell migration in vitro-och hud sår reparation i vivo4.
- Beredning av siRNA: innan du Rekonstituera siRNAs, Centrifugera rören för att se till att innehållet är längst ner. Rekonstituera siRNAs i 100 μL RNase-fri buffert (100 mM kaliumacetat, 30 mM HEPER, pH 7,5) som tillhandahålls av tillverkaren vid en koncentration av 20 μM. Detta är en stamlösning av siRNAs.
- Aliquot denna stamlösning vid 10 μL per tub (koncentration av 20 μM) och förvara vid-20 ° c fram till användning.
- Med en Ultrafine permanent markör, markera en 6-brunn tallrik med en horisontell linje på botten av varje brunn för att alltid kunna identifiera samma repa regionen av intresse och att följa dess stängning.
Obs: 6-well kultur plattor användes i denna analys eftersom de är tillräckligt stora, för att ge tillräckligt med utrymme och flexibilitet att tillämpa en konsekvent, reproducerbar och vertikal repa med hjälp av en 200 μL pipett spets över cellen monolayer. Om ett begränsat antal celler finns tillgängliga, ett alternativ och förmodligen det kostnadseffektiva sättet skulle vara att använda 12-eller 24-well kultur tallrikar. - Plattan primära fibroblaster, isolerade från Wild-typ och β3-brist möss4, i en 6-brunn tallrik med en densitet av 5 x 105 celler/brunn i närvaro av 2 ml Dulbecco är modifierad Eagle ' s medium (DMEM) kompletteras med 10% foster bovin serum (FCS).
Obs: 5 x 105 celler per brunn har fastställts för 6-well kultur plattan och för primär mus fibroblaster. Tester kan behövas om du använder 12-eller 24-väl cellodling plattor eller andra celltyper, som kan vara olika i storlek. Celler ska hanteras i en steril miljö såsom biologiska säkerhetsskåp klass II. - Märk 6-brunnen plattan med celltyp, genotyp, och datum.
- Flytta 6-brunnen plattan i cellkulturen inkubator och underhålla celler vid 37 ° c och 5% CO2 för 24 h.
- Nästa dag, ta plattan ur inkubatorn, aspirera cellkulturen mediet ur brunnen, kassera den och ersätta den med 2,25 mL färsk odlingssubstrat genom att lägga den försiktigt mot väggen i brunnen.
- För att transfect fibroblaster med siRNAs, Använd en lipidbaserad transfektionsreagens som rekommenderas av tillverkaren.
- För varje transfektion, etikett två microcentrifug rör. I den första, tillsätt 9 μL av transfektionsreagens och späd ut det med 150 μL reducerat serum medium. I det andra röret, tillsätt 1,5 μL siRNA (Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 eller kodade siRNA som en negativ kontroll) och späd den med 150 μl reducerat serum medium.
- Tillsätt den utspädda siRNA i röret som innehåller utspädd transfektionsreagens och Vortex för 2 s. Inkubera blandningen i 5 min vid 21 ° c.
- Märk brunnar med antingen Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 eller kodade siRNA. Tillsätt 250 μL av siRNA-transfektionsreagensblandningen droppvis till cellerna.
- Placera 6-brunnen kultur plattan tillbaka in i inkubatorn och hålla cellerna vid 37 ° c och 5% CO2 för 72 h.
- För att kontrollera effektiviteten av Cacnb3 -genen tystning, samla transfekterade celler och utföra immunoblot analys som beskrivs tidigare4.
2. in vitro-sårläkning assay (scratch migration assay)
- Ta cell odlingsplattan ur inkubatorn och undersök cellerna under mikroskopet med hjälp av 10X-målet. Börja med Scratch assay endast när de har uppnått 100% confluency.
Anmärkning: för noggrannhet och reproducerbarhet, 100% confluency är en obligatorisk faktor för att starta Scratch migration analysen. Därför är det viktigt att utsäde samma antal celler i kulturen brunnar, att undersöka varje brunn för confluency och att tillämpa Scratch vid samma tidpunkt (dag 0 confluency). Väntar längre efter cellerna når 100% confluency kan framkalla olika svar. - När cellen når 100% confluency, aspirera kultur mediet ur brunnen och kassera den.
- Använd pipettspetsen (200 μl) för att manuellt skapa en repa vertikalt till den horisontella linjen som är märkt längst ner i brunnen, över konfluenta-cellens enskiktslager i mitten av brunnen.
- Skölj varje brunn två gånger med 2 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2Po4, 8,1 mm na2HPO4, pH 7,4) för att avlägsna de släppta faktorerna från skadade celler, lösa celler och skräp från repat område. Tillsätt 2 mL PBS noggrant mot väggen i brunnen för att undvika att ta loss celler från cellkulturen väl.
- Tillsätt 2 mL cell odlingssubstrat som innehåller antingen 10% serum eller 1% serum noggrant till varje brunn.
Anmärkning: det rekommenderas att utföra Scratch assay under 10% serum och under 1% serum för att bekräfta att den observerade effekten orsakas av cellproliferation och migration eller genom cell migration endast. - Flytta plattan till mikroskopet scenen och fånga ljusa fält bilder av cellfritt område (två områden per brunn) omedelbart efter repor (t = 0h) vid en 10X förstoring med hjälp av ett ljusmikroskop. För att bilden alltid samma region av scratch, Använd den horisontella linjen, som utarbetades i steg (1,3), och ta en bild ovanför denna linje och en bild under denna linje. Spara bilder som TIFF eller JPEG.
- Eftersom mikroskopet skede inte bibehålla celltillväxt villkoret, flytta plattan tillbaka till cellodling inkubator och hålla cellerna vid 37 ° c och 5% CO2.
- Efter 6, 10 och 30 h, flytta plattan till mikroskopet scenen igen och fånga bilder på samma sätt som beskrivs i steg 2,6.
Obs: dessa tidspunkter har fastställts för den beskrivna proceduren och för primära fibroblaster. Under det första pilotexperimentet, mer tid Poäng testades för att se hur snabbt fibroblaster återbefolka klyftan. Även om 0, 6, 10 och 30 h är rimliga starttid punkter, bör utredarna optimera och fastställa lämpliga tidpunkter för varje ansökan och för varje celltyp. Det mer exakta alternativet, om tillgängligt, skulle vara att använda Time-lapse mikroskopi. - Använda ImageJ13, kvantifiera initial cell-fri areal (100%) och resterande yta efter 6, 10 och 30 h (figur 1). Procentandelen av repytan som fylls på genom att migrera celler beräknas sedan i förhållande till det ursprungliga repområdet.
3. analys av repområdet
- Öppna ImageJ Software13.
- Ladda upp den första bilden som JPEG (t. ex. 24-bitars RGB-bilder 1360x1024) genom att släppa bilden i menyraden ImageJ.
- Välj knappen FreeHand selections och markera det cell fria området
- Klicka på analysera och välj Mät. Ett fönster med resultatet visas som innehåller områdes värde.
- Överför det här värdet till ett analys kalkylblad.
- Upprepa steg 3.2-3.5 för varje bild från tidspunkt 0 h och starta sedan igen för nästa gång punkterna 6, 10 och 30 h.
- Beräkna procentsatsen av Scratch areal återbefolkade genom att migrera celler efter 6, 10 och 30 h för varje repa med hjälp av följande ekvation:
a = cellfritt område av den initiala scratch, b = cellfritt område efter 6 h - Beräkna medelvärdet och standardfelet för medelvärdet (S.E.M.) för den procentandel av repytan som fylls på igen genom att migrera celler efter 6 timmar. Visa data som ett stapeldiagram eller ett spridningsdiagram.
4. in vivo hud sårläkning analys
Anmärkning: C57BL/6 Wild-typ män (8-12 veckor gammal med 22-26 g kroppsvikt) och Cavβ3-brist möss som en kontroll används för denna studie.
- En dag innan experimentet, autoklav alla kirurgiska instrument, skruvar, nötter och titanramar som skall användas för skinfold kammaren beredning.
Anmärkning: titanramen består av två symmetriska kompletterande halvor och den har ett cirkulärt observationsfönster där såret kommer att appliceras och följas av mikroskopi (se figur 2a). - Anesthetize en vild-typ eller β3-bristfällig mus (22-26 g kroppsvikt) genom intraperitoneal (i.p.) injektion av 0,1 mL saltlösning/10 g kroppsvikt som innehåller en blandning av ketamin (75 mg/kg kroppsvikt) och xylazin (25 mg/kg kroppsvikt). Kontrollera djupet av anestesi av bristen på svar på en tå nypa.
Anmärkning: denna injektion ger cirka 30 min kirurgisk anestesi och djupet av anestesi måste kontrolleras genom det kirurgiska ingreppet, genom att kontrollera reflexer av musen. - För att undvika torrhet eller ögonskador, applicera oftalmisk salva i båda ögonen och upprepa appliceringen vid behov.
- Försiktigt raka musen dorsum, med hjälp av en elektrisk rakapparat följt av tillämpningen av en hårborttagning grädde till rakade området för att ta bort eventuella kvarvarande hår. Var noga med att inte skada mus huden. Lämna depilationskräm för ca 10 min att helt ta bort allt hår.
- Förbered Titan kammaren genom att ta en del av den symmetriska Titan kammar ramen och fäst de anslutande skruvarna med muttrar på ena sidan. Dessa nötter kommer att fungera som en spacer för att hålla 400-500 μm mellan de två symmetriska delarna av kammaren för att undvika komprimering av blodkärlen i huden.
- Ta bort krämen från bak på musen och rengör den hårfria regionen med varmt (35-37 ° c) kranvatten.
- Se till att platsen att operera är ren, varm (37 ° c) och Befuktad.
- Desinficera den hårfria delen av musen med huddesinfektionsmedel. Ta ett veck av den bakre huden på musen framför en ljuskälla och placera mittlinjen i det dubbla lagret av huden där Titan kammaren kommer att implanteras. Efter det, fixa skinfold med en polypropen sutur kraniellt och caudally och dra åt andra sidan av suturen på en metall rack för att lyfta musen vikta huden. Justera höjden på racket så att musen kan sitta bekvämt.
- Implantat Titan kammaren i luckan på bakre huden på musen på ett sätt att smörgås den vikta dorsala hudlagret mellan de två symmetriska halvorna av titanramen. Fäst den första halvan av titanramen av polypropen suturer på sin överlägsna kant till baksidan av dorsala skinfold.
Obs: på titanramen, det finns 8 hål på den överlägsna kanten (figur 2a) och den vikta huden bör vara väl fast av polypropen suturer på vart och ett av de åtta hålen. - Innan du går vidare till nästa steg, kontrollera reflexer av musen för att se till att djupet av anestesi bibehålls.
- Vid basen av skinfold, passera de två anslutande skruvarna, fäst vid den första halvan av Titan kammaren, att tränga igenom skinfold från baksidan till fronten. Gör små snitt på huden (med fin sax) för att hjälpa smidig penetration av de anslutande skruvarna.
- Lossa musen från racket och placera den på en lateral position. Sätt den andra kompletterande halvan av Titan kammaren ovanpå de 3 anslutande skruvarna (se figur 2a) och applicera lätt tryck med fingrarna för att passera dessa skruvar genom den andra halvan av titanramen. Sedan, fixa båda symmetriska delar med rostfrittstål nötter.
- Ägna noggrann uppmärksamhet åt skruvarna i detta steg, eftersom det kan lossna, om det är för löst. Däremot, om det är för hårt, det kommer pressa skinfold, minska blodflödet och kan leda till vävnads försämring och nekros.
Anmärkning: nötter som bereds i steg 4,5 fungerar som en spacer för att hålla ett avstånd på 400-500 μm mellan de två symmetriska halvorna av Titan kammaren. Muttrarna ska dras åt tills ett litet motstånd känns. - Skär den resterande delen av skruvarna med en tång.
Obs: det är nödvändigt i detta steg att använda laboratorie skyddsglasögon för ögonskydd om skruven lossnar på fel sätt. - Markera sårområdet med en standardiserad biopsi Punch (2 mm i diameter), i mitten av huden inom observations fönstret (se figur 2a) i skinfold kammaren för att säkerställa reproducerbara sår storlekar.
- Genom att använda fina tång och sax, skapa ett cirkulärt sår inom det markerade området genom att ta bort hela huden med epidermis och dermis. Det sista sårområdet kommer att vara runt 3.5-4.5 mm2, se figur 2b. Rengör såret med 0,5 mL steril saltlösning (0,9% NaCl, 37 ° c).
- Täck såret med en glastäckslip och fixera denna glastäckslip med en Snap ring med hjälp av Snap ringen tång på Titan kammaren.
- Omedelbart efter avslutad kirurgiska ingrepp, Placera musen på Imaging skede av ett stereomikroskop utrustad med en kamera och ta bilder (dag 0) under belysning. Använd 40X förstoring och spara bilderna för framtida off-line analys.
Anmärkning: utredaren bör undersöka bilderna omedelbart efter fångst för att säkerställa att kvaliteten är tillräcklig för framtida off-line analyser. Beredningen av skinfold kammaren och utförandet av huden såret tar cirka 30 minuter. - Håll musen på en varm plats under återhämtning från anestesi för minst 2 h. Därefter överföra möss i enskilda burar tillbaka till djuranläggningen (12 h ljus/mörker cykel) och se till att möss har tillgång till mat och vatten.
- Tre dagar efter wounding Placera musen i en mus-hämmaren och fixa den som är på toppen av Imaging scenen.
- Placera scenen under ett stereomikroskop som är försett med en kamera. Ta bilder under belysning med 40x förstoring, spela in alla bilder och spara dem för framtida off-line analyser
- Upprepa steg 4,20 och 4,21 igen vid dag 6, 10 och dag 14 efter att du skadade.
- Använd såret bilder, för off-line analys i ImageJ13. Sårområdet vid dag 0 anses vara 100% och sår stängningen över tiden ritas i förhållande till det initiala sårområdet. Representativa resultat visas i figur 2c, d.
- Beräkna procentsatsen (%) av sårområdet vid varje tidpunkt med hjälp av följande ekvation:
x: tidspunkt (dag 0, 3, 10 eller 14), a: sår område vid dag 0, b: sår område vid tidpunkten x
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Scratch-analysen utfördes på en enskiktslager av vildtyp och β3-bristfällig MEFS (figur 1c). Efter att ha utfört "Scratch" med en 200 μL pipett spets, celler från båda genotyper migrera in i repområdet och stänga gapet. Bilderna togs efter 6, 10 och 30 h (figur 1a). Cell migration kvantifierades som procentandel (%) av Scratch område återbefolkade genom att migrera celler 6 timmar efter att ha utfört scratch. Migrera Cavβ3-bristfällig MEFs stängde repområdet betydligt tidigare än MEFs från vildtyp möss (figur 1a, b). För att utesluta någon effekt av cellproliferation, utfördes Scratch migration assay i närvaro av antingen 10% eller 1% FCS. Vid 10% FCS är båda processerna närvarande, cellproliferation och migration, medan 1% FCS cell spridning minimeras. Fibroblaster i 10% (figur 1b, vänster) eller 1% FCS (figur 1b, höger) visade ett liknande migrationsmönster, utesluta möjligheten av cell spridning bidrag till cavβ3 observerade fenotyp. Cavβ3-bristfällig MEFs stängde gapet betydligt tidigare än vildtyp MEFs under båda förhållanden. För att bekräfta den cavβ3-beroende effekten observerades i β3-brist fibroblaster, vildtyp fibroblaster var transfekterade med siRNA att besegra-reglera cavβ3 proteinet (figur 1e). Som en kontroll för Down-regleringen, Immunoblots utfördes för att bekräfta effektiviteten av siRNA behandling. Två oberoende Cacnb3 specifika Sirnas (SiRNA1 och siRNA2), och en kodad siRNA (som kontroll) användes. Fibroblaster som behandlats med Cacnb3-specifika sirnas beter sig som β3-bristfällig fibroblaster (figur 1d), dvs, migrationen ökas i avsaknad av cavβ3-protein (figur 1e).
In vivo var den dorsala skinfold kammaren implanterad (figur 2a, b) och en definierad cirkulär sår på 2 mm diameter genererades på rakat tillbaka (figur 2b) av Wild-Type och cavβ3-brist möss (8 djur per genotyp, 8-12 veckor gamla och 22-26 g vikt). Såret utfördes genom att ta bort hela huden med epidermis och dermis. För att jämföra hud sårläkning mellan båda genotyper, sårområdet i huden vika kammaren fotograferades direkt efter sårande (dag 0) och sedan bilder togs 3, 6, 10, och 14 dagar efter sårande (figur 2c). Sårens storlek mättes på dessa digitala bilder och sårområdet vid en given dag uttrycktes som procentandel (%) av det initiala sårområdet (figur 2d). Sår stängning ökas i β3-brist möss jämfört med Wild-Type kontroller. I motsats till Wild-Type, var såret i β3-brist möss nästan helt stängd redan efter 10 dagar. Vid dag 14 efter sårande var såren helt stängda i båda genotyperna (figur 2c, d).
Figur 1 : In vitro-repa migration assay. (a) representativa bilder av kulturer från VILDTYP (WT, vänster) och Cavβ3 Ko (β3 ko, höger) primära mus embryonala fibroblaster (MEFS) omedelbart, 6, 10 och 30 h efter att ha utfört en repa. Bilderna konverterades till 8-bitars gråskala, och kontrasten, liksom ljusstyrkan, anpassades för att maximalt visualisera cellens fria område. Analys av det cell fria området (% av det repområde som återbefolkades genom att migrera celler) utfördes på de ursprungliga 24-bitars RGB-bilderna. (b) stapeldiagram som visar procentsatser (%) av Scratch område återbefolkade genom att migrera celler efter 6 timmar antingen i närvaro av hög (10%, vänster) eller låg (1%, höger) foster bovint serum (FCS) i vildtyp (svart) och Cavβ3 KO (röd) experiment (c) immunoblot: protein extrakt från vildtyp hjärna (50 mikrog per körfält) och fibroblaster (MEFs, 100 μg per körfält) med en Cavβ3-specifik antikropp. Den β3 protein (55 kDa) är närvarande i vildtyp hjärna (används som en kontroll), och fibroblaster, men är frånvarande i proteinextrakt av Cavβ3-bristfällig hjärna och fibroblaster utarbetats från Cavβ3-brist möss. (d) Sammanfattning av den procentuella delen av Scratch areal återbefolkade genom att migrera celler efter 6 timmar i vildtyp celler som behandlats med antingen kodade siRNA (kontroll, svart) eller två oberoende Cacnb3 sirnas (siRNA1 och siRNA2, röda öppna staplar). e) motsvarande immunoblot från experimentet i (d). Data visas som medelvärde ± SEM, p-värden beräknades med hjälp av icke-parat tvåsidiga Students t-test. Panelerna a och b har modifierats från [belkacemi et al., 2018]4. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : In vivo hud sårläkning hos möss. (a) invändig sidovy i titan ram som visar ena halvan av Titan kammaren och framsidan visar den sammansatta Titan kammaren med två symmetriska halvor fästa med skruvar och muttrar. (b) musen efter rakning av rygg huden och montering av dorsala skinfold kammare består av två symmetriska titanramar (vikten av titanramen är runt 2 g) och tillämpa ett cirkulärt sår (2 mm diameter). c) bilder av såret direkt efter sårande (dag 0) och 3, 6, 10 och 14 dagar efter att ha sårat. Den kontinuerliga processen av sår stängning, med fullständig epitelisering, visas under 14 dagar i vildtyp (WT, Top) och Cavβ3 KO (β3 KO, bottom) möss. dvid de tidpunkter som angivits fastställdes sårytan med hjälp av ett datorstödd bildanalysprogram och plottas i procent av sårområdet omedelbart efter skadan dag 0 (medelvärde ± SEM av n = 8, Β3 Ko-möss och motsvarande vildtyp kontrollera möss). P-värden beräknades med hjälp av tvåvägsanova och Bonferronis multipla jämförelser test. Panelerna c och d har modifierats från [belkacemi et al., 2018]4. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta manuskript beskriver vi en in vitro-och in vivo sårläknings analys och korrelerar de erhållna resultaten. För in vitro-analysen använde vi primära mus fibroblaster4,14,15 som spelar en viktig roll i sårläkning och vävnad remodeling11. Andra anhängare celltyper växer som enskiktslager (t. ex., epitelceller, endotelceller, keratinocyter) kan användas också. Plätering samma antal livskraftiga och friska celler och tillämpa Scratch vid samma grad av sammanlänkning är av största vikt för att få korrekta och reproducerbara resultat. Det rekommenderas starkt att utföra biologiska och tekniska replikat. I den nuvarande metoden, 6-well plattor användes, men 12-eller 24-bra plattor kan också användas särskilt när celler är tillgängliga endast på begränsat antal. När det gäller siRNA-behandling är immunoblot-analys efter varje uppsättning experiment obligatoriskt för att säkerställa att målproteinet effektivt regleras. Transfektionsreagens och tidsfönster ska testas och väljas för varje celltyp innan du börjar med migreringsanalysen. När det gäller fibroblaster och Cacnb3 genen, det tog 3 till 4 dagar för att nå önskad nivå av Down-förordning. I motsats, Scratch migration analysen behöver kortare tider (6 h till 24 h). För att undvika hög variation i repstorleken är det obligatoriskt att samma utredare applicerar Scratch för varje uppsättning experiment, att lika tryck administreras av pipettspetsen och att såret så mycket som möjligt är vertikalt mot den markerade linjen vid botten av plattan över cellen monolayer. Tillämpning av en mekanisk repa över cellen enskiktslager leder till frisläppandet av olika cellulära faktorer (t. ex., ATP) från skadade celler i extracellulära rymden. Dessa faktorer skulle inducera parakrin signalering inklusive ca2 +-signalering i angränsande celler, vilket i sin tur skulle påverka cellulära svar16. För att undvika dessa effekter, kan kulturinsatser användas för plating celler och efter avlägsnande av dessa skär ett cellfritt gap skapas utan att skada angränsande celler17. För screening med högt dataflöde kan utredarna överväga att använda instrument som finns på marknaden för att skapa reproducerbara och konsekventa repor i 96-well-plattor. För att följa cell migration kinetik kontinuerligt över tid, kan användarna också överväga att använda High-End kommersiella system för automatisk Bildinsamling. Automatiserade system för scratch Application och Image Capture är dock inte alltid tillgängliga på grund av höga kostnader. En mer tillgänglig och kostnadseffektiv lösning för tidsförlopp avbildning skulle vara till exempel att använda systemet (ATLIS: en prisvärd tid-lapse Imaging och inkubering system) som beskrivs av Hernandez Vera och kollegor18.
I avsaknad av någon cell proliferation hämmare, återinsättning av klyftan i Scratch migration analysen är en kombination av cell migration och cell spridning. För att endast övervaka cell migration kan cellproliferation dämpas till exempel genom behandling med antingen Actinomycin C19 eller mitomycin c20. Tillräckliga koncentrationer av dessa föreningar måste bestämmas noggrant och testas för att undvika de toxiska effekterna av dessa föreningar, vilket kan påverka livskraften hos cellerna och deras förmåga att migrera. Som beskrivits i denna artikel, serum svält eller minskning av serumkoncentrationen i odlingsmediet är ett annat sätt att minska effekterna av cellproliferation. Serum svält används i flera andra cellbaserade analyser. Det kan inducera ett stort antal cellulära svar, som kan störa de erhållna resultaten och tolkningar21. Serum svält måste appliceras noggrant och dess effekt på cellernas lönsamhet bör bedömas innan försöket påbörjas. I denna artikel visas migration av primära fibroblaster i närvaro av antingen 10% eller 1% serum (se figur 1b). Migration klassar, som förväntat, är långsammare vid låga koncentrationer av serum. Emellertid, β3-bristfällig fibroblaster migrerar snabbare än vilda-typ celler på båda villkor; låg och hög serumkoncentration.
Huden sårläkning analys med hjälp av dorsala skinfold kammaren är ett relativt enkelt förfarande för att undersöka hud sår stängning över tiden in vivo. Implantation av Titan dorsala skinfold kammare beskrevs för första gången på råttor22. Sorg et al. använde denna teknik i SKH1-HR hårlösa möss att följa sårläkning och bildandet av nya blodkärl9. Den skinfold kammar modell som beskrivs i denna artikel har många fördelar jämfört med den klassiska sårläkning analyser utförs på dorsala huden, på örat23 eller bakben7 av möss. Täcker sårområdet med en glastäckslip förhindrar infektioner och vävnads trauma och gränser uttorkning av såret. Observations kammaren täckt med glas täckglasappliceringen kan öppnas när som helst under läkningsprocessen, vilket möjliggör topikal applicering av olika farmakologiskt aktiva föreningar (t. ex. siRNA för Cavβ3 som lösningar eller salvor) och kammaren kan stängas igen. Murin hud sår läkningsprocessen består av både kontraktion och epitelialization24. Genom att använda dorsala skinfold-kammaren på möss minimeras hudens kontraktion och ger möjlighet att studera främst epiteliseringsprocessen. Det ger också ett tydligt fönster för att observera och övervaka såret stängning processen. En nackdel med Titan kammaren är att musen måste bära Titan kammaren, som har en vikt på ca 2 g (7,7% av vikten av en 26 g mus), för 14 dagar. Detta kan orsaka ett visst obehag för musen, även om det verkar som möss tål väl denna kammare och de är bekväma och kan lätt nå mat och vatten. Huden sårläkning modell som presenteras i denna artikel kan studera endast ett sår per mus. Andra publicerade metoder25,26 föreslår att man applicerar två sår per mus vilket skulle minska antalet djur som behövs för en studie. Det är av stor vikt att skapa ett cirkulärt sår av liknande storlek för alla möss för att få objektiv information samt pålitliga och reproducerbara resultat. För att ta bilder av såren över tid, var möss fast på en mus som är fixerad, placerad på en scen, och skinfold kammaren är placerad under ett stereomikroskop. Med hjälp av den som hjälper till att undvika anestesi och minimera stress för möss. Möss kan offras och vävnader från sårade området kan explanterad och samlas i olika stadier av läkningsprocessen (antingen efter fullständig läkning eller vid tidigare tidpunkter) för histologisk analys, RNA-samling eller protein biokemi.
Sammanfattnings, vi har visat två tekniker, en in vitro-repa analys med hjälp av primära fibroblaster och en in vivo hud sårläkning analys i möss. I både analyser, sårläkning/gap stängning ökas i avsaknad av cavβ3 subenhet av spännings-gated kalciumkanaler. Som med Wild-Type och Cavβ3-bristfällig möss eller celler, båda analyserna kan mycket väl korrelera i avsaknad eller förekomst av andra specifika molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Petra Weissgerber och Transgene enheten av SPF djuranläggningen (Project P2 av SFB 894) av den medicinska fakulteten och djuret anläggningen vid Institutet för klinisk och experimentell kirurgi vid den medicinska fakulteten vid Saarland University, Homburg. Vi tackar Dr. Andreas Beck för kritisk läsning av manuskriptet. Denna studie finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, projekt a3 till A.B. och V.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T.
- Martin, P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro. Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).
- Belkacemi, A., et al. IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3. Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).
- Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment. Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).
- Vagesjo, E., et al. Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria. Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).
- Eming, S. A., et al. Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10. American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K.
- Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels. Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Chen, L., et al. Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway. Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).
- Dewor, M., et al. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro. FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).
- Handly, L. N., Wollman, R. Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism. Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).
- Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration. Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).
- Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics. PLoS One. 11, 0167583 (2016).
- Reinhart-King, C. A. Endothelial cell adhesion and migration. Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).
- Treloar, K. K., Simpson, M. J. Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays. PLoS One. 8, 67389 (2013).
- Pirkmajer, S., Chibalin, A. V.
- Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold. Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).
- Deoliveira, D., et al. An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing. International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).
- Dunn, L., et al.
- Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway. Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).
