Nós apresentamos um protocolo para funcionalizar cantialavancas do microscópio de força atômica (AFM) com uma única pilha de T e partícula do grânulo para estudos imunológicos. Os procedimentos para sondar a ligação Cell-dendritic do único-par célula T por AFM e monitorar a resposta celular em tempo real dos macrófagos a uma única partícula contínua pelo AFM com imagem latente da fluorescência são mostrados.
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Artigo de método
Functionalization dos Cantialavancos do microscópio da força atômica com únicas-células de T ou único-partícula para a espectroscopia imunológica da força da único-pilha
Neste artigo
Resumo
Resumo
A microscopia de força atômica baseou a espectroscopia da força da única pilha (AFM-SCFS) é uma ferramenta poderosa para estudar Propriedades biofísicas de pilhas vivas. Esta técnica permite a sondagem de pontos fortes e dinâmicas de interação em uma membrana celular viva, incluindo aquelas entre células, receptores e ligantes, e ao lado de muitas outras variações. Igualmente trabalha como um mecanismo para entregar um estímulo físico ou bioquímico em únicas pilhas em uma maneira spatiotemporally controlada, assim permitindo a ativação específica da pilha e os eventos celulares subseqüentes a ser monitorados no tempo real quando combinados com a viver-pilha imagem latente da fluorescência. O passo chave nessas medições AFM-SCFS é a funcionalização do AFM-cantilever, ou seja, anexar um assunto de interesse ao cantilever. Aqui, nós apresentamos métodos para modificar cantialavancas de AFM com uma única pilha de T e um único grânulo do poliestireno respectivamente para estudos imunológicos. O primeiro envolve uma colagem biocompatível que acopla únicas pilhas de T à ponta de um cantilever liso em uma solução, quando o último depender em uma colagem da cola Epoxy para a única aderência do grânulo no ambiente do ar. Duas aplicações imunológicas associadas a cada modificação do cantilever são fornecidas também. Os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptados a diferentes tipos de células e partículas sólidas.
Introdução
A microscopia da força atômica (AFM), uma ferramenta versátil, encontrou muitas aplicações na pesquisa da biologia da pilha1,2,3,4,5. Aparte de sua capacidade de imagem latente de alta resolução, a característica da força-sondagem nativa permite que as propriedades biofísicas de pilhas vivas sejam investigadas diretamente in situ no nível da único-pilha6,7. Estes incluem a rigidez de estruturas subcelulares ou mesmo células inteiras
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Protocolo
O protocolo da experimentação do rato segue as directrizes do cuidado animal da Universidade de Tsinghua
1. funcionalização do cantilever com únicas pilhas de T
- Preparação das pilhas do spleen do rato
- Sacrifique o rato (8-16 semanas de idade (ou sexo); por exemplo, C57BL/6 estirpe) utilizando dióxido de carbono, seguido de luxação cervical.
- Limpe o rato com 75% de etanol e faça uma incisão cutânea de linha média seguida de esplenectomia.
- Homogeneizar o baço em 4 mL de PBS contendo 2% de soro bovino fetal (FBS) usando lâminas de vidro e remover agregados e detritos, passando a suspensão celular através....
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Resultados
A figura 4a mostra curvas de força-distância típicas da interação de ligação entre a célula single-T e o single-DC em um ciclo de retração de abordagem. A curva vermelha clara é a curva da extensão e o vermelho escuro um é a curva da retração. Desde que a curva da extensão é usada tipicamente para o recuo ou a rigidez-análise, aqui somente a curva da retração é concernida para a adesão da pilha. O valor mínimo (o círculo verde) na curva dá uma medida da força.......
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Discussão
A espectroscopia da força da único-pilha baseada em AFM evoluiu para ser uma ferramenta poderosa para endereçar as propriedades biofísicas de pilhas vivas. Para essas aplicações, o cantilever precisa ser funcionalizada corretamente, a fim de sondar interações específicas ou propriedades sobre as células de interesse. Aqui, os métodos para acoplando a única pilha de T e a única grânulo Micron-feitos medida ao modilhão Tip-less são descritos respectivamente. Para prender uma única pilha de T ao cantilever, uma colagem bioc.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais do programa geral da China (31370878), programa de chave estatal (31630023) e programa de grupo de pesquisa inovadora (81621002).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| 10 μ l ponta de pipeta | Thermo Fisher | 104-Q | |
| tubo de 15 ml | Corning | 430791 | |
| placa de cultura de 6 cm de diâmetro | NALGENE nunc | 150462 | |
| placa de cultura de 6 poços | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld Arrow-TL1-50 | cantilever sem ponta | |
| β-Mercaptoetanol | Sigma | 7604 | |
| Cola biocompatível | BD Cell-Tak | 354240 | |
| Isolamento de células T CD4 + Coquetel | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 linha celular | Um presente de K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Partículas magnéticas revestidas com dextrana | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epóxi | ERGO | 7100 | |
| Etanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| Bloqueador FcR | STEMCELL | 18731 | |
| Lamínula de vidro | vendedor local (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm de diâmetro, 0,17mm thinckness |
| Lâminas | de vidroDepartamento de gerenciamento de laboratórios e equipamentos da JinTong, Haimen | N / A | personalizado |
| H2< / sub>O2 < / sub> (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2< / sub>SO4< / sub> | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Ímã | STEMCELL | 18000 | |
| Malha filtro de nylon | BD | Falcon REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N / A | clonado em laboratório | |
| Kit de isolamento positivo de células Treg CD25 de camundongo | STEMCELL | 18782 | Componente: Bloqueador FcR, Coquetel de Seleção Positiva de Células T Reguladoras, Coquetel de Seleção PE, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Kit de isolamento de células T | STEMCELL | 19852 | Componente: Isolamento de células T CD4 + Coquetel, Streptavidin RapidSpheres, produtos |
| NaOH | Lanyi do soro do rato., LTD? Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE seleção cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Microesferas de poliestireno 6.0μ m | Polysciences | 07312-5 | |
| tubo de fundo redondo de poliestireno | BD Falcon | 352054 | |
| Soro de rato | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Interleucina-2 Humana Recombinante | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Tampão de lise de glóbulos vermelhos | Beyotime | C3702 | |
| Coquetel de seleção positiva de células T reguladoras | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | de amostra de C11875500BT | de vida | |
| Caseiro | |||
| Partículas magnéticas revestidas com estreptavidina | STEMCELL | 50001 | |
| Kit de transfecção | Clontech | 631318 | |
| tripsina 0,25% EDTA | Vida útil | 25200114 | |
| pinças | JD | N / A | |
| < forte > nome< / forte > | < forte > empresa < / forte > | < forte > número de catálogo< / forte > | < strong>Comentários |
| Equipamento | |||
| 20x objetiva NA 0,8 | Zeiss | 420650-9901 | Microscópio de força atômica apocromático plana |
| JPK cellHesion200 | |||
| Centrífuga | Beckman relha | Allegra X-12R | |
| Imagem de fluorescência | microscop de fluorescência de reflexão interna total do tipo objetivo caseiro baseado em um suporte | ||
| Incubadora de CO2 umidificado | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Microscópio de luz invertida | Zeiss | Observer A1 manual |
Referências
- Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
- Chen, J., et al.
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Reimpressões e permissões
