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Análise de marcha cinemática 3D para estudos pré-clínicos em roedores

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DOI:

10.3791/59612

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3 de agosto de 2019

 , 
1Department of Neurobiology and Behavior, Stony Brook University, 2Department of Physical Therapy, Stony Brook University

Neste artigo

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para coleta e análise da cinemática tridimensional da locomoção quadrupedal em roedores para estudos pré-clínicos.

Resumo

A utilidade dos sistemas de análise de movimento cinemática tridimensional (3D) é limitada em roedores. Parte da razão para essa inadequação é o uso de algoritmos complexos e modelagem matemática que acompanham os procedimentos de coleta e análise de dados em 3D. Este trabalho fornece uma metodologia detalhada simples, fácil de usar, passo a passo para a análise cinemática da marcha em 3D durante a locomoção em esteira em ratos saudáveis e neurotraumáticos usando um sistema de captura de movimento de seis câmeras. Também são fornecidos detalhes sobre 1) calibração do sistema em um set-up experimental personalizado para a locomoção quadrupedal, 2) coleta de dados para locomoção em esteira em ratos adultos usando marcadores posicionados em todos os quatro membros, 3) opções disponíveis para rastreamento de vídeo e processamento, e 4) base de geração de dados 3D cinemáticos e visualização e quantificação de dados usando o built-in software de coleta de dados. Finalmente, sugere-se que a utilidade deste sistema de captação de movimento seja expandida para estudar uma variedade de comportamentos motores antes e depois do NEUROTRAUMA.

Introdução

Em roedores, os déficits de locomotor de membros anteriores e posteriores após distúrbios neurológicos são comumente avaliados por meio de sistemas de Pontuação subjetiva1. Sistemas automatizados2,3,4,5 foram adotados para a análise da marcha, mas sofrem de desvantagens, porque os resultados primários são baseados em análise de pegada e não conseguem capturar crucial variáveis cinemáticas segmentares e articulares que, de outra forma, podem revelar cinemática verdadeira dos movimentos dos membros2. Como a maioria dos parâmetros da marcha está correlacionada, é necessário um conjunto de parâmetros de marcha para compreender as compensações adotadas pelos ratos para avaliar completamente os déficits motores.

Na última década, vários sistemas de análise de movimento 3D6 foram desenvolvidos para pesquisa biomédica em humanos. Estes sistemas foram bem sucedidos e provados ser eficazes em capturar deficits na locomoção em adultos humanos saudáveis assim como a cinemática alterada da caminhada6,7. Em roedores, os sistemas de movimento cinemático 3D atualmente disponíveis adotam algoritmos complexos e modelagem para o comportamento do movimento e utilizam técnicas deanálise de dados sofisticadas8,9,10,11 , que eventualmente limitam a sua versatilidade. Além disso, os métodos utilizados para a coleta de dados com a maioria dos sistemas de captura de movimento 3D não são adequadamente explicados na literatura. Faltam detalhes sobre os procedimentos de coleta e análise de dados, limitações e técnicas envolvidas na utilização efetiva do sistema.

Consequentemente, uma das noções comuns entre os pesquisadores é que as avaliações cinemáticas de rastreamento de movimento 3D são procedimentos bastante trabalhosa e demorados que necessitam de expertise técnica e análise de dados elaborada. A intenção deste trabalho é dividir os protocolos de coleta e análise de dados e descrever a metodologia por meio de um processo passo a passo para que seja objetivo, fácil de aprender e possa ser sistematicamente abordado. Hoje, há uma ênfase emergente na avaliação do comportamento motor funcional de forma mais abrangente e sistemática após lesões neurológicas e intervenções em estudos pré-clínicos.

No Reino da locomoção quadrupedal, apresentado aqui é o uso de um sistema de seguimento do movimento 3D que possa fornecer a informação adicional tal como a postura do corpo, a rotação da pata com respeito aos machados do corpo, inter-relações das junções, e informação mais exata em relação à coordenação, enquanto visualiza simultaneamente todo o animal de todos os aviões. Isso, por sua vez, pode revelar diferenças críticas no comportamento motor dentro e entre ratos saudáveis e feridos através de múltiplos desfechos. Com uma análise cinemática mais refinada que é exata e objetiva, o risco de inferir erradamente efeitos de uma intervenção é minimizado. Os dados gerados deste software de captura de movimento são visualizados quadro a quadro para a qualidade do movimento e podem ser rastreados automaticamente, e a coleta ou Quantificação de dados não requer nenhum algoritmo ou modelagem adicional. O objetivo deste trabalho é fornecer detalhes metodológicos e considerações envolvidas na coleta de dados e na análise da cinemática da marcha 3D durante a locomoção em esteira rolante em ratos saudáveis e com lesão medular. Este protocolo é pretendido para o uso por investigadores pré-clínicos que utilizam modelos neurológicos do rato nos experimentos.

Protocolo

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do guia nacional de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de pesquisa animal do Chanceler da Universidade de Stony Brook.

1. set-up do sistema de captura de movimento

  1. Set-up
  2. Monte seis câmeras na parede (ou tripés) usando cabeças orientadas finamente ajustáveis. Posicione três câmeras acima em cada lado da esteira, com cada câmera angular 20 °-45 ° abaixo do horizonte, aproximadamente 2,0 m de distância da esteira e aproximadamente 0,5 m de distância de câmeras adjacentes para cobertura máxima de marcadores (Figura 1).
    1. Equipar cada câmera com um anel de luz para a visualização de marcadores retroreflective.
  3. Inicie o sistema de captura de movimento.
    1. Em projeto | Especificação, defina os marcadores desejados para o experimento.
      Nota: para fins de demonstração, um total de 22 marcadores é usado tanto para os membros dianteiros como para os retropatas (11 marcadores de cada lado) para avaliar a locomoção quadrupedal bilateral. Alternativamente, o marcador de importação definido com a opção de ID de marcador específico permite cálculos predefinidos dentro do software.

2. calibração do sistema de captura de movimento

  1. Capturando o vídeo de calibração
    1. Coloque o quadro de calibração em forma de L (doravante denominado "L-frame") ortogonalmente na esteira rolante, com a perna longa do quadro L apontando na direção de marcha do rato (Figura 2).
    2. Abra o software de captura de movimento e selecione Record para capturar o vídeo de calibração.
    3. Mova o quadro de calibração em forma de tridente (doravante referido como a "varinha") em toda a área da esteira no espaço, de modo a cobrir todas as áreas que o rato vai estar entrando.
      Nota: o L-frame contem quatro marcadores que estabelecem o sistema de coordenadas global e a varinha contem três marcadores que calibrarão o espaço de passeio 3D do rato.
    4. Registre um mínimo de 1 min de filmagem para garantir que os pontos de dados de varinha adequados estejam presentes para a calibração adequada em 120 frames/s.
    5. Salve os vídeos como arquivos de calibração 3D.
  2. L-quadro de rastreamento
    1. Clique com o botão direito no grupo de câmeras e selecione rastreamento 3D. Na janela suspensa, selecione vídeos de calibração 3De, em seguida, todas as câmeras de calibração.
    2. Usando a função de ponto fixo, acompanhe a origem do L-frame, L-frame curto, L-frame meados de, e L-quadro longo em cada um dos seis vídeos da calibração. Defina todos os pontos e selecione o botão Pesquisar automaticamente .
      Observação: a posição do L-frame deve permanecer consistente em relação à esteira durante todo o experimento para evitar o deslocamento do sistema de coordenadas.
  3. Rastreamento de varinha
    1. Clique com o botão direito do mouse no grupo de câmeras e selecione rastreamento automático de varinha 3D.
    2. Selecione todas as câmeras na seleção da câmera. No canto inferior direito da janela, selecione Opções, selecione detectar quadro Le selecione Iniciar rastreamento.
    3. Após o rastreamento automático, selecione atribuir marcadores de varinha curta, varinha média e varinha longa para todas as seis câmeras.
    4. Na janela de rastreamento 3D , selecione exportar para dados brutose, em seguida, selecione a opção substituir dados de varinha existentes para salvar o rastreamento.
    5. Selecione Sim na janela que aparece após a última etapa para salvar os dados mais precisos.
      Nota: este novo controlo será guardado como controlo na guia de controlo automático na barra lateral esquerda. O rastreamento salvo pode ser acessado e editado posteriormente.
  4. Calculando a calibração
    1. Clique com o botão direito em grupos de calibração da câmera e selecione novo grupo de calibração de varinha.
    2. Selecione todas as câmeras e mantenha pressionada a tecla Ctrl (Control) enquanto seleciona OK.
    3. Mude o comprimento da varinha para 100, 0 mm, deslocamento do piso L-frame para 7, 0 mm, iterações para detecção de outlier a 4 e comprimento de varinha permitido-desvio para 0,300.
    4. Mude a câmera que a varinha deve ser visível na opção a 4, e gire sobre o seguinte: fixe a relação de aspecto, corrija o parâmetro do inclinação, e fixe o ponto principal (tabela 1).
      Observação: essas configurações foram determinadas experimentalmente para serem ideais para essa configuração.
    5. Aceitar calibrações com desvio padrão de comprimento da varinha inferior a 3 mm e valor residual inferior a 0, 4.
      Nota: se as câmeras ou equipamentos associados forem movidos para além deste ponto, será necessário recalibrar o sistema.

3. treinar e preparar o animal para locomoção em esteira

  1. Formação de ratos para locomoção em esteira
    1. Aclimatar ratos para a esteira por 5 min antes de uma sessão de treinamento12.
    2. Treinar os ratos a andar com o rolamento de peso total em seus membros a 13 cm/s por 15 min/sessão de manhã para 1 semana. Treinar todos os ratos até que eles são capazes de consistentemente andando (mínimo de 10 passos contínuos) na esteira12.
    3. Termine sessões de treinamento em torno da mesma hora do dia para cada rato.
  2. Antes da coleta de dados, anestesiam o rato colocando o rato em uma câmara de incubação.
    1. Entregar gás isoflurano (1,0%-2,5%) e 0,4 L de oxigênio por aproximadamente 5 min. Aperte o pé do rato para verificar a profundidade da anestesia.
    2. Proceder quando o rato não responde à pinça pata (reflexo de abstinência da pata negativa).
  3. Raspar o rato em regiões onde os marcadores serão colocados para evitar a pele de interferir com o rastreamento do marcador (Figura 1).
    1. Palpate a pele para o Marco ósseo para colocar os marcadores. Use marcadores de caneta para articulações distais ao cotovelo e ao joelho (Figura 3).
      Nota: os marcadores retroreflective são hemisférios plásticos 0,5 cm no diâmetro coberto com a fita retroreflective.
    2. Coloque os marcadores como desejado em Marcos ósseos antes da coleta de dados (Figura 3).
      Nota: em ratos saudáveis, não neurotraumáticos, os marcadores retroreflective colocados sobre junções longe do ponto de origem são removidos frequentemente por ratos. Para fins de demonstração, marcadores retroreflectivos são colocados sobre os pontos de referência ósseos proximal (crista ilíaca, quadril, articulação do joelho para os membros posteriores, articulações do ombro e cotovelo para o forelimb), e marcadores de caneta são usados para os pontos de referência mais distais. Em nossas mãos, isso gerou resultados reprodutíveis entre e dentro de ratos (dados não publicados).

4. captura de movimento

  1. Selecione o botão vermelho da câmera na barra superior do software de captura de movimento para gravar uma avaliação. Designe o local de salvamento no computador e selecione Iniciar gravação para gravar em 120 frames/s.
  2. Defina uma velocidade de esteira definida pelo usuário e permita que o rato ande por aproximadamente 30 s, ou um mínimo de 10 etapas contínuas.
  3. Pare a gravação e verifique se a filmagem contém pelo menos ~ 10 passos contínuos antes de continuar.
  4. Crie um novo grupo de câmeras para cada teste depois de salvar o vídeo gravado.

5. rastreamento de movimento

  1. Selecione o sinal " +" adjacente ao grupo de câmeras salvas. Isso exibirá uma lista de todas as seis câmeras.
  2. Atribuir calibração 3D ao arquivo da câmera
    1. Vá para o grupo de calibração da câmera e clique com o botão direito na calibração calculada. Selecione atribuir parâmetros da câmera 3D. Atribua o arquivo de calibração aos arquivos de câmera apropriados no grupo de câmeras salvas. Passe o mouse sobre o arquivo da câmera para verificar a calibração (lê como calibração 3D válida).
  3. Rastreamento de câmera 2D individual
    1. Clique com o botão direito no grupo de câmeras para rastreamento de movimento. Selecione rastreamento 2D.
    2. Selecione sete a dez melhores etapas contínuas e consistentes para o rastreamento. Registre o número do quadro no primeiro contato do membro de referência na esteira para cada etapa.
      Nota: para fins de demonstração, o membro posterior esquerdo foi selecionado como membro de referência.
  4. Várias opções de rastreamento estão disponíveis.
    1. Clique com o botão direito do mouse no marcador de interesse e selecione rastreamento automático, que detectará manchas circulares brilhantes criadas por marcadores retroreflectivos (Figura 4).
    2. Alternativamente, rastreie marcadores usando a correspondência de padrões, que usará um algoritmo embutido no software para rastrear marcadores com base no tamanho e na cor (Figura 4).
    3. Rastreie e corrija marcadores ou erros indetectáveis manualmente no rastreamento.
  5. Use marcadores pretos quando os marcadores retroreflective das junções longe do ponto de origem não são possíveis.
    1. Rastreie marcadores pretos usando processamento de imagem avançado invertendo marcadores pretos para pontos brilhantes para rastreamento automático.
      Observação: a opção de processamento de imagem pode ser usada para ajudar a rastrear marcadores que são difíceis de detectar ou ver.
    2. Clique com o botão direito do mouse no vídeo do rato na janela de rastreamento 2D. Selecione processamento de imagem.
    3. Selecione visualização avançada e adicione uma combinação dos quatro filtros (brilho, contraste, gama) para tornar o marcador preto o mais escuro possível em comparação com os arredores. Por fim, adicione invert, e o marcador preto se tornará um marcador brilhante que pode ser rastreado automaticamente (Figura 5).
  6. Correção da colocação do marcador
    1. Rastreie e corrija marcadores ou erros indetectáveis manualmente no rastreamento.
    2. Para rastrear manualmente o vídeo, selecione o marcador desejado na barra lateral direita. Clique com o botão direito do mouse e selecione rastreamento manual. Comece a rastrear o marcador selecionado no vídeo de rato que aparece quadro a quadro.
    3. Para retificar quaisquer erros, vá para o quadro onde ocorreu o erro de rastreamento. Clique com o botão direito do mouse na guia marcador específico na barra lateral direita e clique em excluir ponto. Reacompanhe o ponto manualmente na posição exata.
  7. Usando o método acima, complete o rastreamento 2D para todas as câmeras usadas para todos os marcadores desejados na faixa de quadros de etapas contínuas.
  8. Clique em salvar durante todo o processo de rastreamento.

6. análise cinemática

  1. Atribuições de fase
    1. Clique com o botão direito do mouse em fases e selecione Editar modelo de fase.
    2. Personalize as fases do ciclo da marcha para cada membro de acordo com os déficits que um escolhe estudar (por exemplo, adição de fases de arrasto, fases da onda do dedo do pé, etc.) dentro das fases tradicionais da postura e do balanço de um ciclo de etapa. Defina as fases para o experimento (Figura 6).
      Nota: para fins de demonstração, três fases são mostradas aqui, e o membro posterior esquerdo é usado como o membro de referência para os sete a dez ciclos de marcha.
    3. Clique com o botão direito do mouse na câmera no grupo de câmeras e selecione Mostrar vídeo.
    4. Atribua fases do ciclo de marcha para cada membro dentro do software usando o botão Adicionar fase ou tecla de atalho F11.
    5. Selecione o membro apropriado em análise e designe o primeiro quadro de rastreamento como o início da fase de postura.
    6. Avance o vídeo para o quadro onde a fase de postura termina e a fase de oscilação começa. Designe este quadro como o início da fase de oscilação.
    7. Progrida o vídeo para o primeiro quadro onde o pé começa a descer. Designe este quadro como o início da fase de oscilação média.
      Nota: nisto, a fase de postura de um ciclo de passo para cada membro é definida como o primeiro quadro em que o membro contata a superfície da esteira. A fase de oscilação é definida como o primeiro quadro no qual o membro sai da superfície da esteira. A fase média do balanço é o quadro onde o membro alcançou a folga máxima e começa a descer. Um ciclo completo da marcha é definido desde o início da postura inicial até a atribuição da fase de postura do próximo ciclo da marcha.
    8. Repita essas etapas até que as atribuições de fases do membro sejam concluídas para cada etapa. Repita para os outros três membros.
  2. cálculos de coordenadas 3D
    1. Realize cálculos 3D após rastrear todas as seis câmeras.
    2. Clique com o botão direito do mouse no grupo de câmeras e selecione novo cálculo 3D, clique em tudo para seleção da câmera e selecione OK.
      Observação: uma nova pasta aparecerá. Esta pasta contém todos os dados de coordenadas 3D para todos os marcadores rastreados. Para visualizar e/ou editar fases, clique com o botão direito do mouse nas coordenadas 3D na barra lateral esquerda e selecione Editar fases (Figura 7).
    3. Gere dados de interesse, como diagramas de altura ou velocidade conjunta com pontos de dados, arrastando o marcador de interesse para ver lado a lado com as fases de marcha atribuídas. (por exemplo, cinemática articular na Figura 8).
  3. diagrama 3D
    1. Clique em diagrama 3D para gerar uma figura 3D do teste.
  4. Exporte dados brutos clicando com o botão direito em coordenadas 3D/exportação.
    1. Clique com o botão direito do mouse no arquivo de coordenadas 3D e selecione Exportar.
    2. Abra o arquivo em um software de planilha e importe os dados para o MATLAB.
    3. Crie um programa para criar plotagens de coordenação de altura de etapa do membro.
      Nota: os dados de coordenadas 3D podem ser exportados para softwares de análise ou scripts de macro definidos personalizados para gerar mais dados, além do que os recursos de software oferecem.

Resultados

Este protocolo demonstra uma metodologia para a coleta e análise de dados 3D cinemáticos quantitativos para locomoção em esteira em roedores utilizando um software simples e embutido. Os resultados mostram que o protocolo é viável na coleta e análise da cinemática da locomoção quadrupedal em ratos saudáveis e com lesão medular. Pesquisadores com experiência de manuseio de ratos devem colocar marcadores em ratos e, em seguida, calibrar e usar o sistema de captura de movimento sem problemas críticos. Os dados são facilmente gerados sem o uso de algoritmos complexos.

Aqui, o protocolo foi implementado em ratos saudáveis e medulares feridos (C5 direito hemisection). Para a finalidade deste manuscrito, somente os resultados representativos são mostrados. Globalmente, várias cinemática do movimento do segmento articular e dos membros foram facilmente obtidas a partir das coordenadas 3D de cada marcador. Diferenças críticas entre marcha anormal e ciclos de marcha saudáveis foram facilmente detectadas com múltiplos desfechos, incluindo (mas não se limitando a) medidas de altura da etapa, velocidade articular, ângulo articular (Figura 9), durações de fase do ciclo de etapa para todos os quatro membros, e coordenação dos Membros (Figura 10). A análise de dados qualitativos na forma de parcelas e diagramas de vara pode orientar a determinação das ferramentas quantitativas utilizadas para implementar para os resultados finais dessa abordagem de análise (Figura 11).

Em um rato saudável representativo, o perfil angular do cotovelo demonstrou picos suaves e únicos com ciclos de marcha adjacentes consistentes que apresentaram uma amplitude de movimento completa (Figura 9). A fase alternada da postura e as durações da fase do balanço dos traços sugeriram a coordenação consistente do intralimb. No contraste, o perfil do ângulo do cotovelo de um rato ferido da medula espinal representativa demonstrou os picos distorcidos múltiplos, que eram menos consistentes e de escalas menores do movimento. Além do que as alterações na fase alongada da postura e encurtaram durações da fase do balanço, havia uma deficiência na coordenação do intralimb para o RFL.

Nos dados representativos apresentados plotados para coordenação, verificou-se que as parcelas de coordenação (Figura 10) geradas a partir de ratos sadios representativos mostraram uma coordenação rítmica bem definida e alternada em Membros ipsilaterais durante a marcha ciclos (padrão em forma de L) e em-fase D-em forma de padrão com membros contralaterais. Em comparação, um rato representativo da medula espinal-ferido (hemisection direito C5) mostrou a coordenação não-alterna e não-rítmica deficiente em Membros ipsilateral e uma coordenação rítmica alterna incomun (teste padrão em forma de L) em um do contralateral emparelhamentos de Membros (Figura 10). Dado o déficit observável no botão direito no vídeo de movimento gravado, isso sugere que o RFL e LHL foram incapazes de suportar o peso total sem o apoio de LFL ou RHL em um determinado momento. Esta tendência sugere um mecanismo compensatório para lidar com a velocidade de marcha forçada em uma esteira.

Dados quantificáveis foram facilmente gerados a partir do uso do sistema 3D, mas isso envolveu o acesso a abas separadas e selecionando a partir de uma infinidade de opções disponíveis dentro do software. Há trabalho atual sobre o desenvolvimento de um modelo automatizado que irá gerar dados quantitativos e qualitativos em um único relatório para os resultados mais óbvios de interesse (sem a necessidade de gerar individualmente diferentes resultados), como é feito rotineiramente com sistema de cinemática utilizado para estudos clínicos. Assim, vários pontos de extremidade podem ser compilados e exportados em um formato de relatório que pode ser facilmente visualizado imediatamente após uma avaliação.

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Figura 1 : Set-up experimental. (A) esquema de uma set-up de coleta de dados cinemático de seis câmeras para uma tarefa de caminhada em esteira rolante. Um conjunto de três câmeras é colocado em ambos os lados da esteira para capturar (frame-by-frame) esquerda e direita marcador movimentos durante a locomoção. (B) diagrama que descreve a colocação do marcador sobre pontos de referência ósseos nos membros anteriores e posteriores do roedor para capturar cinemática da locomoção quadrupedal. Um total de 11 marcadores é colocado em cada lado do rato. As regiões sombreadas mostram a área onde o rato é raspado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2 : Marcadores para calibração. (A) atribuições de conjunto de marcadores para o sistema de calibração de varinha, usando dois quadros de calibração: l-frame e Wand (B) o sistema de coordenadas é definido pelo l-frame, onde a origem do l-frame (interseção de duas pernas do quadro) é definida como (0,0). Os dois membros do L-frame, L-frame short, e L-frame longo definem os x-e y-eixos, respectivamente, e o z-axis é definido como perpendicular ao plano XY. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3 : Tipos de marcadores. (A) fotografia do tronco inferior do rato mostrando os dois tipos de marcadores utilizados. B A fotografia demonstra um marcador retroreflective coloc na crista ilíaca com a fita frente e verso que é projetada aderir à pele (CIRCLED o vermelho). C A fotografia demonstra a colocação de um marcador da pena sobre a junção junção Metatarsophalangeal direita (vermelho CIRCLED). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4 : Rastreamento de movimento. (A) a imagem mostra a relação de seguimento do movimento onde os marcadores múltiplos podem ser seguidos simultaneamente usando as funções da "trilha automaticamente" e da "trilha usando a harmonização padrão". (B) a vista ampliada de um marcador retroreflective é detectada como um ponto circular branco brilhante na função da "trilha automaticamente" durante a atribuição do marcador. O software reconhece este ponto como um ponto circular azul brilhante. O ponto vermelho é eventualmente reconhecido como o centro do marcador prescrito. Um ponto vermelho centralizado dentro do marcador circular diminui as chances de erros experimentais durante o rastreamento de dados. O desvio do centro sugere que as medições e análises subsequentes são susceptíveis de ser imprecisas. C Vista ampliada de um marcador retroreflective selecionado para a harmonização do teste padrão. Com base no tamanho, na forma e na cor do marcador selecionado, o software identifica automaticamente os marcadores que correspondem à descrição nos quadros de vídeo subsequentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5 : Opções básicas e avançadas de rastreamento. (A) os vídeos podem ser processados dentro do software clicando com o botão direito do mouse no vídeo durante a análise para que os marcadores obscuros ou obscuros sejam visualizados claramente para permitir o rastreamento automático. Para fins de demonstração, dois tipos de configurações de processamento de imagem são mostrados que são ajustados para acomodar diferentes condições de iluminação ambiente durante a coleta de dados para facilitar o rastreamento. (B) um quadro de vídeo representativo antes do processamento de imagens. (C) para o processamento de imagem básico (tipo de processamento I), as configurações de brilho e contraste são ajustadas para uma visão mais clara. (D) usando as configurações avançadas de processamento de imagem (tipo de processamento II), o marcador da articulação metatarsophalângica direita (marcador preto) é invertido e pode ser rastreado automaticamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6 : Atribuições de fase. O ciclo de marcha para cada membro pode ser dividido em fases discretas de acordo com o delineamento experimental. Para fins de demonstração, são mostradas três fases do ciclo da marcha. (A) a fase de postura é definida como o primeiro quadro em que o membro contata a superfície da esteira. (B) a fase de oscilação é definida como o primeiro quadro em que o membro sai da superfície da esteira (C) a fase média do balanço é o primeiro quadro após o afastamento do membro onde a pata começa a descer. Em (D), um ciclo completo da marcha é definido desde o início da postura inicial até a atribuição da fase de postura do próximo ciclo da marcha. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7 : Opções avançadas para análise de fase de etapas. Esta opção permite uma visão aprofundada das atribuições de acompanhamento e fase, bem como a capacidade de alterar as atribuições de fase. (A) caixa de seleção do marcador para visualizar e selecionar o marcador desejado. (B) janela de seleção de coordenadas: destacando a coordenada de interesse (neste caso, as coordenadas z) aparecerá como vermelho na janela do diagrama principal. (C) janela de seleção de fase: as fases atribuídas para um membro podem ser visualizadas em relação aos marcadores e coordenadas selecionadas em (a) e (B). As fases também podem ser editadas através desta janela. (D) janela do diagrama: as coordenadas para um marcador específico podem ser comparadas simultaneamente durante as fases individuais do ciclo da marcha. O verde e o amarelo representam as fases da postura e do balanço respectivamente para o hindmembro direito durante a locomoção quadrupedal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8 : Amostra de dados cinemáticos 3D. (A) os vários resultados de cada marcador de articulação podem ser visualizados pictorialmente a partir do conjunto de dados de coordenadas 3D após o rastreamento de vídeo (B), dado representativo para os ciclos de postura e de fase de oscilação para cada membro torácico e membro posterior durante quadrupedal andando em um rato. As cores representam as fases de postura e swing de ciclos consecutivos de passos. O vermelho e o verde correspondem às fases direita da postura do membro esquerdo e posterior, respectivamente. O azul e a cerceta correspondem às fases esquerdas da posição do membro esquerdo e posterior, respectivamente. O amarelo corresponde à fase de oscilação de cada membro. (C) vários grupos de dados (marcadores ou resultados discretos) podem ser comparados simultaneamente com facilidade. Os dados de velocidade de coordenadas z dos marcadores da articulação do joelho esquerdo e direito são selecionados arbitrariamente para demonstrar a velocidade vertical do marcador da articulação do joelho da superfície da esteira. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9 : Dados cinemáticos angulares articulares representativos de ratos com lesão medular da medula espinhal saudáveis e cervicais durante a locomoção da esteira. (A) o perfil do ângulo da articulação do cotovelo em um rato representativo saudável demonstra os picos lisos, únicos de traços do ângulo comum com os ciclos adjacentes consistentes da marcha que exibem a escala completa do movimento. As barras vermelhas e amarelas denotam as fases da postura e do balanço respectivamente do ciclo de etapa do membro torácico. (B) ao contrário, os traços em um rato representativo da medula espinal ferido são relativamente mais distorcidos e mostram picos múltiplos inconsistentes com uma escala menor total do movimento comum. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 10 : Dados representativos da coordenação do membro de um rato ferido da medula espinal saudável e cervical durante a locomoção da escada rolante. (A) os valores da coordenada z dos marcadores metacarpofalângeo (MCP) e metatarsophalângica (MTP) que descrevem medidas de altura da etapa são plotados em seis combinações diferentes entre membros de aproximadamente 10 etapas durante a caminhada quadrupedal. São mostrados a demonstração representativa de todos os seis pares possíveis da coordenação do membro. (B) um rato saudável apresenta uma coordenação rítmica clara e alternada (padrão em forma de L) para todos os pares (i, II, III, IV). Quando os membros estão em fase (v, vi), os pares de coordenação seguem um padrão em forma de D. (C) em um rato ferido da medula espinal cervical, anote (i) a coordenação pobre entre os dois membros dianteiros, (III) emparelhamento ipsilateral direito e (IV) a coordenação incomun para um dos pares contralaterais do membro. Observe que as plotagens de coordenação (B, C) não compartilham a mesma escala. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 11 : Figura Animated da vara 3D. Exemplo de uma figura de vara 3D gerada a partir de dados rastreados. Por favor clique aqui para baixar esta figura.   

Parâmetro de calibraçãoEntradas de calibração
Comprimento da varinha [mm]100
L-frame piso offset [mm]7
Iterações para detecção de outlier4
Comprimento da varinha permitida-desvio0,3
A varinha deve ser visível em pelo menos câmeras do _4
Fixar proporçãoVerificado
Corrigir o parâmetro de inclinaçãoVerificado
Corrigir ponto principalVerificado

Tabela 1: configurações avançadas para calibração. A tabela resume os parâmetros que usamos para calibrar com precisão a set-up de seis câmeras. Essas configurações foram testadas experimentalmente e foram encontradas ideais para a nossa configuração.

Discussão

Este artigo do protocolo demonstra o uso de um sistema de seguimento do movimento para a coleção e a análise de dados cinemática 3D durante a locomoção da escada rolante do quadrupedal nos roedores. Características importantes do sistema de análise de movimento cinemático 3D incluem a quantificação detalhada da cinemática do movimento articular (cinemática fase etapa, ângulos articulares, amplitude de movimento, velocidades de passo) de múltiplas articulações e Membros simultaneamente, detecção de déficits motores inmensuráveis a olho nu, eliminação de viés subjetivo na coleta e análise de dados, e fácil visualização de todo o membro e cinemática postural que podem ser comparados com a justaposição simultânea de todo o rato em movimento. Sem a necessidade de algoritmos e modelagem adicionados, os métodos mostram a capacidade do software de analisar quantitativamente a cinemática da marcha com grande detalhe, eficiência, facilidade, precisão e reprodutibilidade.

Em roedores, os déficits de locomotor de membros anteriores e posteriores após uma lesão medular (SCI) são comumente avaliados por meio de sistemas de Pontuação de locomotores subjetivos e padronizados, como o sistema de Pontuação BBB1. Os sistemas de Pontuação subjetiva geralmente introduzem viés de testador, pois diferentes pesquisadores podem atribuir diferentes escores para o mesmo déficit motor ou mesmo escore para diferentes déficits motores, resultando em menor reprodutibilidade e sensibilidade do teste13 . Além disso, a incapacidade de detectar deficits sutis desgasta o risco de inferir errada em efeitos de uma intervenção.

Para combater esses problemas, os sistemas automatizados2,3,4,5 e sistemas com ou sem o uso de algoritmos complexos14,15 foram adotados por alguns investigadores. Estes testes executam a análise do ciclo da etapa que revelam perfis do rolamento de peso e testes padrões da seqüência da etapa derivados dos movimentos da colocação da pata dos ratos que andam através de uma pista. No entanto, uma grande desvantagem da análise de marcha do plano ventral é que o próprio corpo do sujeito não é diretamente visível2,3. Esses dados se limitam a informações obtidas a partir de impressões de pés e movimentos de pata, questionando a seleção e interpretação dos parâmetros da marcha na avaliação de déficits (ver Chen et al.16). Os detalhes do movimento que revelam a cinemática segmentar dinâmica do movimento e do posicionamento dos membros não são obtidos com precisão para a análise da locomoção3,5. Desvios críticos de dados de ângulo articular (i.e., amplitude de movimentos, velocidade de movimentos, etc.), relação de articulações com relação entre si dentro de um membro e entre membros, e a mecânica corporal subjacente que alteram os padrões de marcha são impossíveis de obter. Como tal, se quaisquer prejuízos observáveis da marcha são conseqüentes a alterações em movimentos articulares segmentares únicos e/ou múltiplos (i.e., coordenação intralimb proximal-distal, relações posturais do tronco com relação à posição e ciclo de marcha de Membros, etc.) permanecem mascarados.

Poucos sistemas atualmente disponíveis capturam a cinemática da marcha e avaliam a disfunção motora qualitativamente e quantitativamente, mas são menos amplamente utilizadas. Um sistema de análise de marcha de rastreamento de vídeo de alta velocidade de corpo inteiro filma ciclos de marcha espontâneos de três lados (um ventral e dois planos laterais) e rastreie os pontos de referência ósseos para gerar uma série de resultados da marcha17,18. A análise da marcha cinemática do plano sagital é empregada por alguns pesquisadores para obter dados de movimento 2D do membro posterior interessado19,20. Entretanto, uma terceira dimensão de movimento que ocorre ortogonal ao plano de visão (lateral ou sagital) é indetectável nas análises11,18,19.

Outros mais sofisticados, 3D, três corpo-segmento roedor corpo sistemas de coleta de dados postural utilizam modelagem matemática 3D de coleta de dados, bem como sistema de análise para rastrear e quantificar o movimento 3D do corpo do roedor-segmentos, incluindo a cabeça padrões de movimento8. Madete et al.9 desenvolveram um sistema de captura de movimento optoeletrônico baseado em marcadores para quantificar a cinemática postural do corpo 3D durante a locomoção de overground em vigas de caminhada usando um sistema de sete câmeras. Os principais desfechos estudados nos dois últimos trabalhos concentram-se principalmente na postura geral do roedor em vez da análise da marcha. os sistemas de captura de movimento 3D fornecem dados de marcha cinemática 3D de alta taxa de transferência usando várias câmeras e sistemas de software elaborados, conforme revisado por Bhimani et al.21. Versões mais antigas do sistema de análise de movimento 3D apresentado também têm sido utilizadas em trabalhos prévios em ratos com e sem NEUROTRAUMA12,22,23.

Apesar da disponibilidade de sistemas de coleta e análise de movimento 3D para pesquisa, o uso pré-clínico dessa técnica em roedores permanece relativamente limitado. Parte da razão para esse problema é que os protocolos de coleta e análise de dados dependem muito do uso de modelos cinemáticos de construção e algoritmos complicados que se encaixam em um modelo cinemático do membro posterior do rato durante a caminhada para gerar multa, alta resolução cinemática da marcha8,9,11,22. A metodologia detalhada aqui apresentada fornece detalhes do procedimento envolvido ao longo do processo experimental, incluindo manipulação de animais, treinamento, set-up experimental, coleta de dados e etapas de análise.

Também são fornecidos detalhes sobre a calibração do sistema, que é a parte fundamental do protocolo, que assegurará a reprodutibilidade entre os ensaios adjacentes dentro e entre os sujeitos. As técnicas passo a passo descritas introduzem a objetividade no procedimento de coleta de dados e a tornam altamente reprodutível. Os dados gerados a partir deste software de captura de movimento podem ser visualizados frame-by-frame para a qualidade do movimento e rastreados automaticamente. Mais descrito é como essa coleta de dados ou Quantificação não requer nenhum algoritmo adicional ou modelagem. Estudantes, funcionários e pesquisadores podem utilizar um software estatístico simples para gerar uma saída cinemática básica sem depender de conhecimentos técnicos específicos.

Este sistema pode igualmente ser usado para a locomoção overground, alcangando e agarrando, e outros set-ups experimentais para serir o objetivo experimental. O número e o tipo de marcadores podem igualmente ser ajustados para a cauda, a parte traseira, o tronco, ou as orelhas, como necessário. Uma vantagem maior do software apresentado em comparação com os sistemas é a sua capacidade de recolher dados de vídeo de alta resolução do assunto. Como tal, conjuntos complexos de cálculos (ou seja, movimentos angulares, linhas de vara Conectando várias articulações, etc.) podem ser sobrepostos no vídeo gravado. A colocação do marcador e os dados 3D gerados podem ser verificados com movimentos reais de um rato no movimento. Em contraste, com o outro sistema de captura de movimento 3D, apenas os marcadores são capturados, e qualquer reanálise deve ser feita nos diagramas de vara (estrutura esquelética) em vez do vídeo do assunto real. Conseqüentemente, a verificação da colocação do marcador no movimento sujeito real está faltando.

Com base na experiência com este sistema, a calibração desempenha um papel crucial no sucesso da coleta de dados. A calibração do sistema é altamente sensível à mudança. e um ligeiro movimento de qualquer uma das câmaras pode comprometer todo o processo de recolha e análise de dados de coordenadas 3D. Apenas duas câmeras de cada lado de um plano de visualização são necessárias para a coleta de dados, mas a terceira câmera é altamente recomendável para fornecer mais precisão através da referência cruzada dos locais de cada marcador com outras câmeras. À medida que o número de câmeras de rastreamento aumenta, a precisão da coordenada 3D para um marcador específico também aumentará. Durante ocasiões em que os marcadores tornam-se obscurecidos devido aos deficits do porte (tais como o curling do dedo do pé ou o arrasto no caso do porte após o NEUROTRAUMA), estas circunstâncias podem exijir o seguimento manual extensivo. No entanto, a quantidade de dados eventualmente gerados a partir do rastreamento é digno do tempo investido no rastreamento manual dos marcadores, tornando-se uma ferramenta inestimável na detecção de déficits motores sutis.

Em nossa experiência, todo o tédio associado com o uso do sistema encontra-se além do uso do equipamento e da tecnologia própria. Semelhante a outros protocolos para avaliação de comportamentos motores, o método com o qual os ratos são manipulados e treinados para a tarefa afeta grandemente os resultados. Por exemplo, isolar ratos de sua coorte é crítico durante o teste; caso contrário, os ratos que não são testados, mas ainda estão presentes durante os testes mostram eventual deterioração do desempenho da tarefa. Temperatura ambiente ideal, iluminação e níveis de ruído são outros determinantes. Fouad et al. publicaram outros desafios que acompanham o teste motor funcional em ratos24. De fato, usuários cegos deste laboratório que seguiram a metodologia corretamente não experimentaram grandes obstáculos com coleta de dados, rastreamento de movimento e análise de dados.

Neste artigo, um sistema de captura de movimento 3D para coletar e analisar dados locomotores efetivamente é descrito para que os pesquisadores possam coletar enormes quantidades de dados locomotores em profundidade rapidamente de vários ratos. Estamos atualmente trabalhando na criação de um modelo automatizado de análise de dados que pode ser incorporado ao software e tornar-se capaz de gerar um relatório de resultados pré-determinados dentro de poucos segundos para a locomoção em esteira em roedores, semelhante ao que é feito em humanos estudos utilizando sistemas de captura e análise de movimento6,25. O desenvolvimento deste modelo permitirá que os investigadores pré-clínicos obtenham dados detalhados do locomotor do roedor na conveniência de poucos cliques de um botão de rato. Espera-se que os métodos previstos neste trabalho provem ser úteis para que os pesquisadores pré-clínicos avaliem o comportamento motor dos roedores de forma mais objetiva. Estamos agora a finalizar o uso deste sistema para coletar dados cinemáticos 3D de alta taxa de transferência durante comportamentos comuns, qualificados de membros anteriores, como alcançar e agarrar. É importante ressaltar que a utilidade deste método pode ser expandida para ratos com uma variedade de lesões neurotraumáticas e não neurotraumáticas.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Nosso agradecimento especial a Pawan Sharma por sua assistência com a set-up experimental para o vídeo e contribuição intelectual para este projeto. Agradecemos também a Christopher Palacio por sua contribuição na assistência com a demonstração do protocolo de vídeo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sistema de captura de movimento Basler de 6 câmeras (Scout scA640-120gu).Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, AlemanhaN/ADispositivo de gravação para análise de movimento.
Quadro e varinha de calibraçãoSimi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, AlemanhaN/ACalibração em forma de L que define o sistema de coordenadas globais e a varinha em forma de tridente (100 mm)
MarcadoresShah LabN/ADispositivo de gravação para análise de movimento. Os marcadores são feitos sob medida em nosso laboratório a partir de olhos arregalados de 0,5 cm cobertos com fita reflexiva.
MatlabMathworks, Inc, Natic, CaN/ASoftware de análise de dados
Gaiola de roedoresfeita sob medida em Stony Brook.N/AGaiola de plexiglass transparente usada para manter o roedor na esteira.
Simi Reality MotionSystems Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, AlemanhaN/ASoftware de rastreamento 3D.
EsteiraMk Automation Inc., Bloomfield, CT 06002N/AEsteira usada para locomoção de roedores.

Referências

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