Aqui, nós apresentamos um protocolo para processar a medula fresca (BM) isolada do rato ou do ser humano para a análise de massa High-dimensional da citometria (citometria pela tempo--vôo, cytof) de pilhas da neutrófilos-linhagem.
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Artigo de método
Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neste artigo, nós apresentamos um protocolo que seja aperfeiçoado para preservar pilhas da neutrófilos-linhagem no BM fresco para a análise inteira de BM CyTOF. Nós utilizamos um painel Myeloid-tendencioso do CyTOF do 39-anticorpo para avaliar o sistema hematopoietic com um foco nas pilhas da neutrófilos-linhagem usando este protocolo. O resultado do CyTOF foi analisado com um algoritmo de redução dimensional de recurso aberto, o viSNE, e os dados foram apresentados para demonstrar o desfecho deste protocolo. Descobrimos novas populações de células de linhagem de neutrófilos com base neste protocolo. Este protocolo da preparação inteira fresca do BM pode ser usado para 1), análise de CyTOF para descobrir populações não identificadas da pilha do BM inteiro, 2), investigando defeitos inteiros do BM para pacientes com desordens de sangue tais como a leucemia, 3), auxiliando a optimização de protocolos de citometria de fluxo ativados por fluorescência que utilizam BM inteiro fresco.
Introdução
Nas últimas décadas, os métodos de citometria têm sido uma poderosa ferramenta para investigar o sistema hematopoiético na BM. Esses métodos incluem citometria de fluxo ativada por fluorescência e o novo método de CyTOF usando anticorpos com rótulo de metal pesado. Conduziram às descobertas de muitos tipos da pilha em um espécime biológico heterogêneo pela identificação de seus perfis originais da expressão do marcador de superfície. As sobreposições aumentadas do espectro que é associada com mais canaletas conduzem à inexatidão de dados mais elevada em aplicações fluorescência-ativadas da citometria do fluxo. Conseqüentemente, as pilhas indesejadas são removidas rotineiramente a fim enriquecer populações da pilha do interesse para a análise fluorescência-ativada do fluxo citometria. Por exemplo, Ly6G (ou GR-1) e CD11b são considerados marcadores de células mielóides maduros e Ly6G+ (ou GR-1+) e células CD11b+ são ROTINEIRAMENTE removidas das amostras de BM usando kits de enriquecimento magnético antes da análise de citometria de fluxo de tronco hematopoiético e células progenitoras (hspcs) ou combinando esses marcadores em um canal de coquetel de despejo1,2,3. Um outro exemplo é que os neutrófilos são removidos rotineiramente do espécime humano do sangue para enriquecer pilhas mononucleares do sangue periférico (PBMC) para estudos imunológicos. A medula óssea inteira isolada do rato ou do ser humano, entretanto, é investigada raramente intact para a análise da citometria.
Recentemente, cytof tornou-se uma ferramenta revolucionária para investigar o sistema hematopoiético4,5,6. Com CyTOF, os anticorpos etiquetados fluorophore são substituídos por anticorpos repórter-etiquetados do elemento pesado. Este método permite a medição de mais de 40 marcadores simultaneamente sem a preocupação de sobreposição de espectro. Permitiu a análise do espécime biológico intacto sem etapas da pre-depleção ou de uma canaleta da descarga. Portanto, podemos ver o sistema hematopoiético de forma abrangente com dimensionalidade de alto conteúdo a partir de parcelas convencionais de citometria de fluxo 2-D. As populações de células omitidas no passado durante o processo de depleção ou gating agora podem ser trazidas à luz com os dados de alta dimensão gerados pelo cytof4,5. Nós projetamos um painel do anticorpo que mede simultaneamente 39 parâmetros no sistema hematopoietic com um foco no linage Myeloid7. Em comparação com os dados convencionais de citometria de fluxo, a interpretação e visualização dos dados de células unidimensionais sem precedentes gerados pela CyTOF é um desafio. Os cientistas computacionais desenvolveram técnicas de redução de dimensionalidade para a visualização de conjuntos de dados de alta dimensão. Neste artigo, utilizamos o algoritmo viSNE, que utiliza a técnica t-Distributed Stochastic Neighbor incorporação (t-SNE) para analisar os dados CyTOF e apresentar o resultado de alta dimensão em um mapa de 2 dimensões, conservando a estrutura de alta dimensão dos dados8,9,10. No gráfico tSNE, células semelhantes são agrupadas em subconjuntos e a cor é usada para realçar o recurso das células. Por exemplo, na Figura 1 as células mielóides são distribuídas em vários subconjuntos de células com base nas semelhanças de seus padrões de expressão de 33 marcadores de superfície resultantes de cytof (Figura 1)4. Aqui nós investigamos a medula do osso do rato com nosso painel previamente relatado do CyTOF do 39-Marker pela análise7de visne. a análise de visne de nossos dados de cytof revelou uma população não identificada da pilha que mostrasse características de hspc (CD117+) e de neutrófilos (Ly6G+) (Figura 2)7.
Em conclusão, nós apresentamos um protocolo para processar a medula inteira fresca do osso para a análise de CyTOF. Neste artigo, nós usamos a medula óssea do rato como um exemplo, quando este protocolo puder igualmente ser usado para processar amostras humanas da medula. Os detalhes específicos para amostras de medula óssea humana também são observados no protocolo. A vantagem deste protocolo é que contem detalhes tais como o tempo e a temperatura da incubação que foram aperfeiçoados para preservar pilhas da neutrófilos-linhagem na medula inteira para permitir a investigação na medula inteira intacta do osso. Este protocolo também pode ser facilmente modificado para aplicações de citometria de fluxo ativada por fluorescência.
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Protocolo
Todos os experimentos seguiram as diretrizes aprovadas do Instituto La Jolla para o Comitê de cuidados e uso de animais de alergia e Imunologia, e a aprovação para o uso de roedores foi obtida do Instituto La Jolla para alergia e Imunologia, de acordo com critérios descritos em o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório dos institutos nacionais de saúde.
1. colheita da medula óssea do rato (BM)
- Compre camundongos C57BL/6J de um vendedor comercial. Alimente a dieta e a casa padrão do Chow do roedor em gaiolas do microisolador em uma facilidade patogénico-livre.
- Use camundongos machos, 6-10 semanas de idade, para fins experimentais. Eutanizar por inalação de CO2 seguida pela luxação cervical.
- Coloque o mouse sobre uma almofada cirúrgica estéril com o lado do abdômen para cima. Esterilizar a pele da área do abdômen e dos membros posteriores pulverizando 70% de etanol. Use um par de dissecando tesouras cirúrgicas para cortar a cavidade abdominal aberta.
- Retire a pele para expor os membros posteriores. Use um par de fórceps curativo de ponta sem corte para segurar a tíbia do mouse logo abaixo do tornozelo. Use um outro par de fórceps curvado do curativo para estabilizar a tíbia abaixo do fórceps de limpeza da ponta sem corte. Quebre a tíbia e exponha o osso arrancando o músculo com o fórceps curativo de ponta sem corte.
Nota: A tíbia é frouxamente unida à articulação do joelho e pode facilmente ser escolhida usando o fórceps do curativo da Blunt-ponta. - Coloque a tíbia no frio 1X PBS.
- Em seguida, mova a pinça de curativo curva estabilizadora para baixo para o fêmur. Deslize o fórceps de limpeza de ponta sem corte abaixo da articulação do joelho e segure a rótula. Deslocar a rótula puxando-a suavemente para cima. Expor o fêmur, arrancando o músculo anexado à rótula. Segure o fêmur exposto pelo curativo curvo fórceps e corte o fêmur fora da parte inferior do osso usando dissecando tesoura cirúrgica.
- Coloc o fémur no frio 1X PBS.
- Perfure um furo no tubo do microcentrifugador de 0,5 mL com uma agulha de 18 G.
- Coloc a tíbia e o fémur no mesmo tubo do microcentrifugador de 0,5 mL com a extremidade aberta dos ossos que enfrentam para baixo ao furo.
- Coloque o tubo de 0,5 mL contendo tanto a tíbia como o fêmur em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
- Gire os tubos de duas camadas contendo tíbia e fêmur a 5.510 x g por 30 s na microcentrífuga.
- Certifique-se de que o BM é extraído dos ossos e peletizada na parte inferior do tubo. Atire o tubo de 0,5 mL contendo os ossos santificado. O mouse BM está pronto para os próximos passos.
Nota: a BM humana é colhida em recursos clínicos como descrito anteriormente11.
2. mancha células BM para CyTOF
- Ressuscitem o BM em 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) 1x. Para a BM humana, Ressuspender todo o BM em um volume de 10x de 1x glóbulos vermelhos (RBC) tampão de Lise. Incubar durante 10 min à temperatura ambiente (RT).
- Gire o tubo a 350 x g por 5 min a 4 ° c. Para BM humano, repita a etapa 2,1 e 2,2 antes de prosseguir para a etapa 2,3.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e deixar a pelota sem interrupções. Ressuscita a pelota com 1 mL de PBS 1x frio. Filtre o pellet em um tubo cônico de 15 mL através de um filtro de células de 70 μm. As pilhas do BM são isoladas agora completamente no tubo dos restos do músculo e do osso. Lave as células adicionando 9 mL de PBS 1x frio no tubo.
- Gire o tubo de 15 mL em 350 x g para 5min a 4 ° c.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuscita as células BM com 10 mL de PBS frio. Tome uma alíquota de células para a contagem. Contagem de células usando um Hemocytometer.
- Alíquota 5 x 106 células BM em um novo tubo de 15 ml para coloração de cytof.
- Girar a alíquota do tubo de 15 mL a 350 x g durante 5 min a 4 ° c.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e suspender as células BM com 125 nM de cisplatina em 1 mL de CyTOF mancha tampão como um indicador de viabilidade para a amostra. Incubar por 5 min em RT.
- Após a incubação, adicione 4 mL de tampão de coloração CyTOF ao tubo. Gire o tubo a 350 x g por 5 min a 4 ° c. Para o BM humano, adicione o soro humano do AB de 10% no tampão de mancha do CyTOF.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e suspender as células BM com 50 μL de solução de bloqueio do receptor FC. Incubar por 10 min a 4 ° c. Pule este passo para o BM humano.
- Adicionar 50 μL do cocktail de anticorpo CyTOF caseiro5 à amostra para que o volume total de coloração seja de 100 μl. Gentilmente pipeta para misturar. Incubar durante 30 min a 4 ° c. O volume final do cocktail do anticorpo é 100 μL para o rato BM e amostras humanas do BM.
- Adicione 2 mL de tampão de coloração de CyTOF a cada tubo que segue a incubação para lavar as pilhas, gire o tubo em 350 x g por 5 minutos em 4 ° c.
- Repita o passo 2,12 para um total de duas laves.
- Prepare uma solução fresca de formaldeído a 1,6% da ampola de 16%. Diluir 1 parte do formaldeído de ações com 9 partes de 1X PBS.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e suspender a pelota com 1 mL de solução fresca de 1,6% de FA. Incubar por 15 min em RT.
- Gire o tubo a 800 x g por 5 min a 4 ° c.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e suspender a pelota celular com solução de intercalação de 125 nM em 1 mL de tampão de correção/Perm.
- Incubar a amostra em solução de intercalação durante a noite a 4 ° c.
3. Prepare células para aquisição de CyTOF
- Suavemente vórtice e girar células em 800 x g por 5 min a 4 ° c.
- Lave as células adicionando 2 mL de tampão de coloração CyTOF, gire as células a 800 x g durante 5 min a 4 ° c e retire o sobrenadante por aspiração.
- Reressuscitem as células em 1 mL de diH2O. Reserve um pequeno volume (aproximadamente 10 μL) de cada tubo para contar as células.
- Gire as pilhas em 800 x g por 5 minutos em 4 ° c.
- Repita o passo 3,3 e 3,4.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e deixar as células no pellet. As células BM estão agora prontas para reressuscitar a concentração de 1 x 106 células/ml para aquisição de cytof.
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Resultados
A Figura 1 é apresentada como um resultado de exemplo de experimentos cytof. Neste gráfico de tSNE as células em vários tecidos de mouse foram agrupadas em subconjuntos com base na semelhança de seus perfis de expressão de marcador de superfície medidos por um painel CyTOF 33-Parameter. As células com propriedades mais semelhantes foram agrupadas automaticamente, como os neutrófilos, macrófagos ou os DCs com base na expressão dos marcadores 33 em cada célula.
A
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Discussão
Nas últimas décadas, a citometria de fluxo à base de fluorescência foi utilizada como método principal para estudar linhagens celulares e heterogeneidade1,2,3. Embora a citometria de fluxo tenha fornecido dados multidimensionais, este método é limitado por opções de parâmetros e sobreposição espectral. Para superar a fraqueza do fluxo citometria nós aproveitamos de cytof, que usa isótopos do metal pesado em vez dos fluoróforos p...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao núcleo de citometria de fluxo LJI para assistência com procedimento de citometria de massas. Este trabalho foi apoiado por NIH Grants R01HL134236, P01HL136275, e R01CA202987 (all to C. C. H) e ADA7-12-MN-31 (04) (para C.C.H. e Y. P. Z).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| CyTOF Anticorpos (camundongo) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Humano/Camundongo CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purificado | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98) - Purificado | Biolegend | Cat# 135502; RRID: AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117 / c-kit (Clone 2B8) -166Er | Fluidigm | Cat # 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17 / 4) - Purificado | Biolegend | Cat # 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (Fcγ RIV) (Clone 9E9) - Gato | Biolegend | # 149502; RRID: AB_2565302 | |
| CD162 anti-rato (clone 4RA10 (RUO)) - Purificado | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-rato CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purificado | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4) - Purificado | Biolegend | Cat# 149302; RRID: AB_2565277 | |
| Anti-rato CD183 (Clone CXCR3-173) - Purificado | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purificado | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID: AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217) - Gato | Biolegend | # 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purificado | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse Fcε RI&alfa; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-rato GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purificado | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purificado | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purificado | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID: AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136) -165Ho | Fluidigm | Cat # 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO)) - Purificado | BD Biosciences | Cat # 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-camundongo TER-119/Células Eritróides (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID: AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptídeos e Proteínas Recombinantes | |||
| anticorpos | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatina-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x tampão | de lise de hemáciasThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Conjunto de tampão de coloração de fator de transcrição | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Quatro elementos grânulos de calibração | Fluidigm | Cat# 201078 Ácido | |
| etilenodiaminotetracético (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Soro bovino fetal | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| Solução salina tamponada com fosfato HyClone | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Kits de rotulagem de anticorpos | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Azida sódica | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Tripsina EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Modelo: Organismo/Cepas | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Normalizador baseado em contas | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten e Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
Referências
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
- Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
- Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).
- Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386(2018).
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579(2018).
- Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nature Reviews in Immunology. , (2019).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
