Aqui, nós apresentamos um protocolo para processar a medula fresca (BM) isolada do rato ou do ser humano para a análise de massa High-dimensional da citometria (citometria pela tempo--vôo, cytof) de pilhas da neutrófilos-linhagem.
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Artigo de método
Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neste artigo, nós apresentamos um protocolo que seja aperfeiçoado para preservar pilhas da neutrófilos-linhagem no BM fresco para a análise inteira de BM CyTOF. Nós utilizamos um painel Myeloid-tendencioso do CyTOF do 39-anticorpo para avaliar o sistema hematopoietic com um foco nas pilhas da neutrófilos-linhagem usando este protocolo. O resultado do CyTOF foi analisado com um algoritmo de redução dimensional de recurso aberto, o viSNE, e os dados foram apresentados para demonstrar o desfecho deste protocolo. Descobrimos novas populações de células de linhagem de neutrófilos com base neste protocolo. Este protocolo da preparação inteira fresca do BM pode ser usado para 1), análise de CyTOF para descobrir populações não identificadas da pilha do BM inteiro, 2), investigando defeitos inteiros do BM para pacientes com desordens de sangue tais como a leucemia, 3), auxiliando a optimização de protocolos de citometria de fluxo ativados por fluorescência que utilizam BM inteiro fresco.
Introdução
Nas últimas décadas, os métodos de citometria têm sido uma poderosa ferramenta para investigar o sistema hematopoiético na BM. Esses métodos incluem citometria de fluxo ativada por fluorescência e o novo método de CyTOF usando anticorpos com rótulo de metal pesado. Conduziram às descobertas de muitos tipos da pilha em um espécime biológico heterogêneo pela identificação de seus perfis originais da expressão do marcador de superfície. As sobreposições aumentadas do espectro que é associada com mais canaletas conduzem à inexatidão de dados mais elevada em aplicações fluorescência-ativadas da citometria do fluxo. Conseqüentemente, as pilhas indesejadas são removidas roti....
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Protocolo
Todos os experimentos seguiram as diretrizes aprovadas do Instituto La Jolla para o Comitê de cuidados e uso de animais de alergia e Imunologia, e a aprovação para o uso de roedores foi obtida do Instituto La Jolla para alergia e Imunologia, de acordo com critérios descritos em o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório dos institutos nacionais de saúde.
1. colheita da medula óssea do rato (BM)
- Compre camundongos C57BL/6J de um vendedor comercial. Alimente a dieta e a casa padrão do Chow do roedor em gaiolas do microisolador em uma facilidade patogénico-livre.
- Use camundongos machos, 6-10 semanas de idade, par....
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Resultados
A Figura 1 é apresentada como um resultado de exemplo de experimentos cytof. Neste gráfico de tSNE as células em vários tecidos de mouse foram agrupadas em subconjuntos com base na semelhança de seus perfis de expressão de marcador de superfície medidos por um painel CyTOF 33-Parameter. As células com propriedades mais semelhantes foram agrupadas automaticamente, como os neutrófilos, macrófagos ou os DCs com base na expressão dos marcadores 33 em cada célula.
A
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Discussão
Nas últimas décadas, a citometria de fluxo à base de fluorescência foi utilizada como método principal para estudar linhagens celulares e heterogeneidade1,2,3. Embora a citometria de fluxo tenha fornecido dados multidimensionais, este método é limitado por opções de parâmetros e sobreposição espectral. Para superar a fraqueza do fluxo citometria nós aproveitamos de cytof, que usa isótopos do metal pesado em vez dos fluoróforos p.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao núcleo de citometria de fluxo LJI para assistência com procedimento de citometria de massas. Este trabalho foi apoiado por NIH Grants R01HL134236, P01HL136275, e R01CA202987 (all to C. C. H) e ADA7-12-MN-31 (04) (para C.C.H. e Y. P. Z).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| CyTOF Anticorpos (camundongo) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Humano/Camundongo CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purificado | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98) - Purificado | Biolegend | Cat# 135502; RRID: AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117 / c-kit (Clone 2B8) -166Er | Fluidigm | Cat # 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17 / 4) - Purificado | Biolegend | Cat # 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (Fcγ RIV) (Clone 9E9) - Gato | Biolegend | # 149502; RRID: AB_2565302 | |
| CD162 anti-rato (clone 4RA10 (RUO)) - Purificado | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-rato CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purificado | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4) - Purificado | Biolegend | Cat# 149302; RRID: AB_2565277 | |
| Anti-rato CD183 (Clone CXCR3-173) - Purificado | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purificado | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID: AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217) - Gato | Biolegend | # 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purificado | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse Fcε RI&alfa; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-rato GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purificado | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purificado | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purificado | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID: AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136) -165Ho | Fluidigm | Cat # 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO)) - Purificado | BD Biosciences | Cat # 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-camundongo TER-119/Células Eritróides (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID: AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptídeos e Proteínas Recombinantes | |||
| anticorpos | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatina-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x tampão | de lise de hemáciasThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Conjunto de tampão de coloração de fator de transcrição | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Quatro elementos grânulos de calibração | Fluidigm | Cat# 201078 Ácido | |
| etilenodiaminotetracético (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Soro bovino fetal | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| Solução salina tamponada com fosfato HyClone | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Kits de rotulagem de anticorpos | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Azida sódica | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Tripsina EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Modelo: Organismo/Cepas | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Normalizador baseado em contas | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten e Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
Referências
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26....
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Reimpressões e permissões
