Ensaio de repórter luciferase à base de RNA transcrito in vitro para estudar a regulação da tradução em células infectadas pelo poxvirus

Resumo

Nós apresentamos um protocolo para estudar o Regulamento da tradução de mRNA em pilhas poxvirus-contaminadas usando in vitro o ensaio do repórter da luciferase do RNA-baseado transcrito. O ensaio pode ser usado para estudar a regulação da tradução por cis-elementos de um mRNA, incluindo 5 '-região não traduzida (UTR) e 3 '-UTR. Diferentes modos de iniciação de tradução também podem ser examinados usando este método.

Resumo

Cada mRNA do poxvirus transcrito após a replicação viral do ADN tem um 5 '-Poly (A) evolutivamente conservado, não-modelado do 5 '-UTR. Para dissecar o papel de 5 '-Poly (A) líder na tradução de mRNA durante a infecção do poxvirus nós desenvolvemos in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase. Este ensaio do repórter compreende de quatro etapas do núcleo: (1) PCR para amplificar o molde do ADN para a transcrição in vitro; (2) transcrição in vitro para gerar mRNA usando T7 RNA polimerase; (3) transfecção para introduzir in vitro o mRNA transcrito nas pilhas; (4) detecção da atividade da luciferase como indicador de tradução. O ensaio do repórter do luciferase RNA-baseado descrito aqui contorna edições da replicação do plasmídeo em pilhas poxvirus-contaminadas e na transcrição enigmático do plasmídeo. Este protocolo pode ser usado para determinar o Regulamento da tradução por cis-elementos em um mRNA que inclui 5 '-UTR e 3 '-UTR nos sistemas diferentes das pilhas poxvirus-contaminadas. Além disso, diferentes modos de iniciação de tradução, como o tampão-dependente, Cap-Independent, re-iniciação, e iniciação interna podem ser investigados usando este método.

Introdução

De acordo com o dogma central, a informação genética flui do DNA para o RNA e, finalmente, para a proteína^1,2. Este fluxo de informação genética é altamente regulamentado em vários níveis^,incluindo a tradução mRNA^3,4. O desenvolvimento de ensaios de repórter para medir a regulação da expressão gênica facilitará a compreensão dos mecanismos regulatórios envolvidos nesse processo. Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar a tradução do mRNA usando um in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase em pilhas poxvirus-infected.

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Protocolo

1. preparação do modelo de DNA por PCR para transcrição in vitro

1. Para preparar o modelo de DNA por PCR, iniciadores de design. Ao projetar primers considerar características cruciais como primer comprimento, temperatura de recozimento (T_m), GC conteúdo, 3 ' final com G ou C etc.
   Nota: Discutido em detalhe nesta literatura^25,26,27.
2. Projete primeiras demão para gerar o amplicon do PCR que contem os seguintes elementos em 5 ' a 3 ' sentido: T7-promoter, líder poli (A), luciferase do Firefly ORF e uma cauda de Po....

Resultados

As quatro etapas do ensaio in vitro transcrito do repórter da luciferase baseada em RNA: PCR para gerar o molde do ADN para a transcrição in vitro, in vitro a transcrição para gerar o mRNA, o transfection do mRNA, e a medida do luciferase, podem ser considerados no diagrama esquemático ( Figura 1). A concepção de primers para ambos os modelos de DNA (Fluc e rluc) e o esquema geral de extensão de saliência PCR é ilustrado no esquema (Figur.......

Discussão

Todas as etapas do quatro-núcleo são críticas ao sucesso do in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase. Uma atenção especial deve ser dada ao projeto da primeira demão, especial para a seqüência do promotor T7. T7 RNA polymerase começa a transcrição do sublinhado primeiro G (ggg-5 '-UTR-Aug-) em T7 promotor adicionado antes da seqüência de 5 '-UTR. Embora o local do começo da transcrição (TSS) Comece do primeiro G no 5 ' extremidade, diminuindo o número de G ' s menos de três na região do pr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2X-Q5 Master mix	New England Biolabs	M0492	Polimerase de DNA de alta fidelidade usada em PCR
3&agudo;-O-Me-m7G(5')pp(5')G RNA Cap Structure Analógico	New England Biolabs	S1411L	Anti reverse Cap analógico ou ARCA
Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate	Corning	3693	Placa branca de 96 poços com parede opaca com fundo sólido
Sistema de Ensaio Reporter de Luciferase Dupla	Promega	E1960	Kit de Ensaio de Luciferase Dupla (DLAK)
E.Z.N.A. Kit de Ciclo Puro	OMEGA BIO-TEK	D6492	Kit de Purificação de PCR
GloMax Navigator Microplate Luminometer	Promega	GM2010	Referido como luminômetro leitor de placa multimodo
HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit	New England Biolabs	E2050S	In Kit de transcrição
Vitro Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019	Reagente de transfecção lipídica catiônica
NanoDrop2000	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	Usado para medir a concentração de DNA e RNA
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985070	Mídia de soro reduzida
Purelink RNA Mini Kit	Thermo Fisher Scientific	12183018A	Kit de purificação de RNA
Sistema de nivelamento Vaccinia	New England Biolabs	M2080	Sistema de nivelamento