Protocolo in vitro para avaliação de níveis de MicroRNA, funções e genes alvo associados em células tumorais

Resumo

Este protocolo utiliza uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR), um ensaio de sulforhodamina B (SRB), 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) clonagem e um ensaio de luciferase para verificar os genes alvo de um miRNA de interesse e para compreender as funções de miRNAs.

Resumo

MicroRNAs (miRNAs) são pequenas RNAs regulatórias que são reconhecidas para modular inúmeras vias de sinalização intracelular em várias doenças, incluindo cânceres. Esses pequenos RNAs regulatórios interagem principalmente com as 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) de seus RNAs de mensageiro alvo (mRNAs), resultando na inibição dos processos de decodificação de mRNAs e no aumento das degradações de mRNA alvo. Com base nos níveis de expressão e nas funções intracelulares, os miRNAs são capazes de servir como fatores regulatórios de mRNAs oncogênicas e supressoras de tumores. A identificação de genes-alvo de boa-fé de um miRNA entre centenas ou mesmo milhares de alvos computacionalmente previstos é um passo crucial para discernir os papéis e os mecanismos moleculares básicos de um miRNA de interesse. Vários programas de predição de alvo de miRNA estão disponíveis para pesquisar possíveis interações de miRNA-mRNA. No entanto, a questão mais desafiadora é como validar genes alvo diretos de um miRNA de interesse. Este protocolo descreve uma estratégia reprodutível de métodos chaves em como identificar alvos de miRNA relativos à função de um miRNA. Este protocolo apresenta um guia prático em procedimentos passo a passo para descobrir níveis de miRNA, funções e mRNAs alvo relacionados usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real baseada em sonda (PCR), o ensaio de sulforhodamina B (SRB) após uma transfecção mímica de miRNA , geração da curva da dose-resposta, e ensaio do luciferase junto com a clonagem de 3 ' UTR de um gene, que seja necessário para a compreensão apropriada dos papéis de miRNAs individuais.

Introdução

MicroRNAs (miRNAs) são os pequenos RNAs regulatórios que modulam principalmente o processo de tradução e degradação de RNAs mensageiro (mRNAs), reagindo às 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) em genes alvo de boa-fé¹. A expressão de miRNAs pode ser regulada por mecanismos transcricional e pós-transcricional. O desequilíbrio desses mecanismos reguladores traz níveis de expressão miRNAs descontrolados e distintos em inúmeras doenças, incluindo os cânceres². Um único miRNA pode ter interações múltiplas com mRNAs diversos. Correspondentemente, um mRNA individual pode ser controlado por vários miRNAs. Portanto, as redes de sinalização intracelular são intrinsecamente influenciadas por miRNAs distintivamente expressas pelas quais distúrbios fisiológicos e doenças podem ser iniciados e deteriorados^2,3,4 , ^{5. º , 6}. embora a expressão alterada de miRNAs tenha sido observada em vários tipos de cânceres, os mecanismos moleculares que modulam os modos de células cancerosas em conjunto com miRNAs ainda são largamente desconhecidos.

A acumulação de evidências tem sido evidenciando que os papéis oncogênicos ou supressores de tumores de miRNAs dependem dos tipos de cânceres. Por exemplo, ao segmentar a caixa de os O3 (FOXO3), o miR-155 promove a proliferação celular, metástase e quimiorresistência do câncer colorretal^7,8. Ao contrário, a limitação da invasão da pilha do glioma é induzida por miR-107 através da regulação da expressão⁹da proteína 2 do homólogo do entalhe do locus neurogênica (NOTCH2). A avaliação das interações de miRNA-Target em conexão com as funções de miRNA é uma parte indispensável para entender melhor como os miRNAs regulam vários processos biológicos em Estados saudáveis e doentes¹⁰. Além disso, a descoberta de alvo (s) de bona fide de miRNAs pode ainda fornecer uma estratégia aperfeiçoada para uma terapia baseada em miRNA com vários medicamentos anticancerígenos. No entanto, o principal desafio no campo dos miRNAs é a identificação de alvos diretos de miRNAs. Aqui, métodos detalhados são apresentados como abordagens experimentais reprodutíveis para a determinação do gene alvo de miRNA. O projeto experimental bem-sucedido para a identificação do alvo de miRNA envolve várias etapas e considerações (Figura 1). A comparação dos níveis de miRNA maduros nas células tumorais e nas células normais pode ser um dos procedimentos comuns para selecionar um miRNA de interesse (Figura 1a). O estudo funcional de um miRNA selecionado para detectar os efeitos de um miRNA na proliferação celular é importante para estreitar a lista dos melhores alvos potenciais candidatos de um miRNA de interesse (Figura 1b). Com base nas funções experimentalmente validadas de miRNAs, é necessária uma revisão sistemática da literatura e da base de dados em empresa com um programa de predição de alvo de miRNA para pesquisar as informações mais relevantes sobre as funções genéticas (Figura 1C). A identificação de genes alvo reais de um miRNA do interesse pode ser conseguida implementando experiências tais como o ensaio do luciferase junto com a clonagem de 3 ' UTR de um gene, PCR do tempo real, e mancha ocidental (Figura 1D). O objetivo do protocolo atual é fornecer métodos abrangentes de experimentos principais, a reação em cadeia da polimerase em tempo real baseada em sonda (PCR), o ensaio de sulforhodamina B (SRB) após uma transfecção mímica de miRNA, geração de curva de dose-resposta e o ensaio de luciferase juntamente com a clonagem de 3 ' UTR de um gene. O protocolo atual pode ser útil para uma compreensão melhor das funções de miRNAs individuais e da implicação de um miRNA na terapia de cancro.

Protocolo

1. maduro MicroRNA (miRNA) análise de expressão

1. Síntese de DNA complementar maduro de miRNA (cDNA)
   1. Adicionar 254 ng de RNA total e 4,5 μL de misturas de desoxirribonuclease I (DNase I) e, em seguida, adicionar água ultrapura em tubos de tiras de PCR para fazer até 18 μL (Figura 2a). Prepare a reação para cada amostra de RNA total purificada de várias linhas celulares usando quantidade suficiente de misturas de DNase I com base no número total de reações.
      Nota: As misturas de DNase I são compostas por DNase I (1,8 μL), inibidor da ribonuclease (0,3 μL) e 25 mM MgCl₂ (2,4 μL). Para obter o RNA total de forma revisível, um método de extração baseado em coluna foi aplicado em vez de usar um método de extração com base em fenol-clorofórmio. Foi relatado que o rendimento de extração de alguns miRNAs pode ser variado dependendo do número de células ao usar um método de extração baseado em fenol-clorofórmio^11,12.
   2. Incubar os tubos em um ciclador térmico. Executar os tubos por 10 min a 37 ° c, e calor-inactivate DNase I por 5 min incubação em 90 ° c. Coloque imediatamente os tubos no gelo após a incubação.
   3. Transferência 7,1 μL de DNase eu tratei o RNA total em 2 jogos de tubos novos e adiciono então 1,5 μL de primers antisense para o gene do desidrogenase do glyceraldehyde-3-fosfato (GAPDH) (Figura 2b).
      Nota: A quantidade de RNA total para a síntese do cDNA transforma-se 100 ng nesta etapa. A concentração de estoque de primers antisense GAPDH é de 10 μM. a adição de primers antisense GAPDH é para a geração de cDNAs GAPDH usando um método de primer específico para genes.
   4. Incubar os tubos usando um termociclador. Começar a 80 ° c durante 5 min seguido da reacção a 60 ° c durante 5 min. Coloque imediatamente os tubos no gelo após a incubação.
   5. Adicionar 3,4 μL de misturas de enzimas de transcrição reversa (RT) em cada reação (Figura 2b). As misturas enzimáticas RT são compostas por 100 mM de desoxirribonucleotídeo trifosfatos (0,15 μL), tampão 10x RT (1,5 μL), inibidor de ribonuclease (0,75 μL) e enzima de transcrição reversa (1 μL). Prepare quantidade suficiente de misturas com base no número total de reações.
   6. Adicionar 3 μL de primers de 5x RT para um miRNA específico em cada reação (Figura 2b).
      Nota: O volume total é de 15 μL para cada reação.
   7. Executar os tubos usando um termociclador. Começar a 16 ° c durante 30 min seguido da reacção a 42 ° c durante 30 min e, finalmente, a 85 ° c durante 5 min. Segure a 4 ° c para qualquer tempo restante (Figura 2b). Os cDNAs único-encalhado são gerados nesta etapa para um miRNA específico e um gene de GAPDH no mesmo tubo.
2. Reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) e análise de dados
   1. Diluir cada cDNA com água ultrapura na relação 1:49.
   2. Prepare as misturas de reacção para um miRNA específico e GAPDH (tabela 1). Para a detecção de um determinado miRNA e GAPDH, configurar reações triplicado para cada amostra de cDNA.
   3. Realize a PCR em tempo real e a análise de dados (Figura 2C). Analise os dados utilizando o método comparativo C_T ^13,14.

2. MicroRNA (miRNA) MimicTransfection

Nota: o miRNA-107 é seleccionado a partir do passo 1. Desde que miRNA-107 é para baixo-regulado em pilhas do tumor comparado com as pilhas normais, pode-se especficar que miRNA-107 é um miRNA supressor do tumor. No caso de um Mirna que seja regulado em pilhas do tumor comparado com as pilhas normais (por exemplo, Mirna-301), os oligonucleotídeos antisense de encontro a Mirna-301 podem ser aplicados para as etapas 2, 3, e 4.

1. Conte as células com um dispositivo de câmara de contagem e placa as células em uma placa de 96 bem. A densidade celular é de 2 x 10³ células/100 μl para cada poço. Não use meios de cultura celular contendo penicilina-estreptomicina (P/S) porque P/S pode reduzir a eficiência do transfection.
2. Prepare um conjunto de misturas de transfecção para transfecção as células em várias concentrações finais de mímica de controle de Mirna e mímica de Mirna-107 no dia seguinte (Figura 3).
   1. Do estoque (concentração de 25 μM) do mímico do controle de miRNA ou do mímico de miRNA-107, diluir e adicionar a quantidade correspondente de imitações do controle ou de miRNA-107 imitam nos meios de soro reduzidos junto com um reagente do transfection usando os tubos do microcentrifugador (Figura 3a). Misture suavemente o oligo contendo misturas usando uma micropipeta. A quantidade total de oligos (controle mímico de miRNA + mímica de miRNA-107) deve ser mesma em cada poço. Os poços em branco incluem 100 μL de meios de cultura celular e meios séricos reduzidos contendo um reagente de transfecção sem células.
3. Depois de uma incubação de 10 min em uma capa de cultura celular, misture suavemente o oligo contendo misturas novamente e, em seguida, adicione 50 μL das misturas em cada poço. Mantenha as células transfectadas em uma incubadora de cultura celular. Substitua o reagente do transfection que contem meios com os meios de cultura frescos da pilha que contêm o soro fetal bovino (FBS) e o P/S após a incubação de 6-12 h. Incubar ainda mais as células para 72 h. A duração total do tratamento do mímico de miRNA é 96 h.

3. ensaio de sulforhodamina B (SRB)

1. Fixação celular
   1. Retire o meio de cultura celular em cada poço da placa e preencha prontamente 100 μL de ácido tricloroacético a 10% (TCA) em cada poço. Aspirar cuidadosamente os meios de cultura celular de cada poço para evitar qualquer dano celular e descolamento do fundo.
      Nota: Prepare 40% TCA adicionando 20 g de pó de TCA em 50 mL de água destilada. De 40% de TCA, faça 10% TCA diluindo 40% TCA com água destilada em uma relação da diluição 1:3.
   2. Mantenha a placa contendo 10% de TCA num frigorífico (4 ° c) durante 1 h.
   3. Lave a placa várias vezes submergindo na cuba de água e seque-a. Retire o excesso de água do interior dos poços tocando na placa até que não haja água deixada em poços. Deixe a placa em um banco do laboratório para secá-la antes de ir à etapa seguinte.
2. Coloração celular
   1. Pipeta 50 μL de 0,4% de solução de SRB em cada poço, incluindo poços em branco. Agitar suavemente a placa até 0,4% SRB solução consistentemente cobre a parte inferior dos poços.
      Nota: Prepare e use 0,4% de solução de SRB adicionando 0,4 g de pó de SRB em 100 mL de ácido acético a 1%. Agitar a solução cuidadosamente para misturá-lo. Enrole o frasco de 0,4% de solução de SRB em um material protetor claro tal como a folha de alumínio. Armazene 0,4% de solução de SRB em um refrigerador.
   2. Após a incubação para 40 min a 60 min, lave a placa enxaguando-a com 1% de ácido acético. Lave a placa até que o corante não acoplado seja totalmente lavado (Figura 3B).
   3. Deixe a placa em um banco do laboratório para secá-la antes de ir à etapa seguinte.
      Nota: A placa deve ser completamente seca antes de ir para o passo 3,3.
3. Medição de absorvância
   1. Pipete 100 μL de solução base tris (10 mM) para os poços correspondentes, incluindo poços em branco. Mantenha a placa em uma coqueteleira por 10 min. Meça a absorvância em 492 nm.

4. geração de uma curva dose-resposta

1. Analise os dados do ensaio SRB em uma planilha. Subtrair a absorvência em branco dos valores de absorvância de cada grupo e calcular a média (AVE) e o desvio padrão (STD) dos valores de absorvência de cada grupo.
2. Calcular a percentagem de absorvância média (AVE%) e a do desvio padrão (STD%) de cada grupo utilizando valores de absorvância do ensaio SRB.
   Nota: O grupo tratado mímico de controle AVE% de miRNA é de 100%. Calcule o STD% usando a seguinte fórmula: STD% = (STD de cada grupo/AVE absorbância de controle imitado grupo tratado) x 100.
3. Importe os dados brutos, incluindo as concentrações de tratamento, AVE% e STD% para o software, alinhando verticalmente esses dados. Como o log 0 não está definido, defina a primeira concentração do eixo X para um valor que está próximo de 0 (por exemplo, 0, 1).
4. Clique em criar guia de gráfico e escolha barras de erro de dispersão simples. Selecione colunas de planilha como valores de símbolo e clique em Avançar. No painel de formato de dados, selecione pares XY e clique em Avançar. Selecione as colunas de dados correspondentes no painel de dados selecionado. Clique no botão concluir para criar o gráfico.
   Nota: O eixo X representa as concentrações, o eixo Y indica o percentual de absorbância média de cada concentração (AVE%), e as barras de erro apontam a porcentagem de desvio padrão de cada concentração (STD%).
5. Clique duas vezes no eixo X para modificar o tipo de escala e o dimensionamento do eixo. Altere o tipo de escala de linear para log. Modifique o número do intervalo de início e término para 0, 1 e 200, respectivamente.
6. Clique com o botão direito do mouse em qualquer gráfico de dispersão, escolha ajuste de curva e vá para a subcategoria definida pelo usuário. Selecione curva dose-resposta, clique em Avançar botões e, em seguida, clique em Concluir botão. A curva dose-resposta é gerada agora junto com uma aba do relatório (figura 4a).
   1. Para inserir a equação 1 no software para a geração de uma curva de dose-resposta, clique na guia análise e selecione Assistente de regressão. Vá para definido pelo usuário na categoria de equação e, em seguida, clique no botão novo . Insira a equação 1, variáveis, parâmetros iniciais e restrições nas caixas em branco correspondentes (Figura 4B, C). Clique em Adicionar como botão e defina o nome da equação como curva dose-resposta. O nome da equação agora é gerado na subcategoria usuário-definido na categoria de equação. f indica a porcentagem de viabilidade celular (% de viabilidade celular) na equação 1.

Equação 1

7. Vá para a guia relatório e, em seguida, verifique os valores n, k e R.
   Nota: y0 indica 100% de viabilidade celular do grupo tratado mímico de controle de Mirna, n indica o coeficiente do tipo colina (a inclinação de um gráfico), k indica a concentração de mímica de mirna-107 que produz um 50% do efeito máximo do mímico de mirna-107 (a metade concentração inibitória máxima, IC₅₀), e R indica a fração residual não afetada (a fração de resistência)¹⁵. A equação utilizada para gerar uma curva dose-resposta reconhece o intervalo de y0 a R (se houver) como 100% (figura 4a). Portanto, é necessário adquirir o valor k (IC₅₀) ajustado que é calculado com base no intervalo de y0 para um valor de zero (figura 4a). K ajustado (IC₅₀) juntamente com outros valores de icx (por exemplo, IC₁₀ através de IC₉₀) pode ser obtido usando a equação 2, que é derivada da equação 1. A derivação da equação 2 da equação 1 é indicada na Figura 1 suplementar.

Equação 2

8. Clique duas vezes no botão esquerdo do mouse na célula na qual a equação 2 é aplicada. Usando a equação 2 e os parâmetros da curva dose-resposta gerada, está disponível para calcular os valores ajustados de ICx, variando de IC₁₀ a IC₉₀ (Figura 4D).
9. Insira o sinal de igual seguido pela fórmula começando com um colchete na célula. Ao inserir a fórmula, corrija o valor de n, k e R como as referências de célula absoluta adicionando o sinal de cifrão à coluna e linha correspondentes, para que esses valores fixos não sejam alterados ao preencher automaticamente a fórmula até as linhas (Figura 4D). Alternativamente, os valores ajustados podem ser calculados manualmente usando a equação 2.
   Nota: IC₉₀ valor não é determinado porque o valor de R é maior que 10. Além disso, se o valor R for superior a 20, o valor de IC₈₀ também não é determinado (Figura 4D).

5. verificação do gene alvo direto de um MicroRNA de interesse

Nota: Após a realização do experimento funcional, como o ensaio SRB, o miRNA-107 é confirmado como um tumor supressor de miRNA e é altamente viável que o miRNA-107 atinge diretamente os oncogenes. Verifique a lista de todos os genes-alvo previstos usando um programa de previsão de destino miRNA, como o TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_71/), e, em seguida, restrinja-se a potenciais alvos candidatos com base na função de um gene em bancos de dados, incluindo PubMed e Para.

1. Primer design para a clonagem de 3 ' região não traduzida (UTR)
   1. Coloque o nome de um gene em GeneCards (https://www.genecards.org/) e clique no símbolo de um gene. Avalie o navegador do genoma do Ensemble, clicando em Ensemble ID de um gene e, em seguida, clique em transcripts ID na tabela de transcrição. Depois disso, clique em exons existia na lista de exibições baseadas em transcrição à esquerda.
   2. Copie as sequências de nucleotídeo do 3 ' UTR e cole-o no programa de design da cartilha. Copie as sequências novamente deste programa e cole-a em um processador de texto. Verificar a presença de seqüências de ligação de miRNA, bem como a presença de enzimas de restrição locais utilizados para a clonagem.
      Nota: Se não existirem sítios de reconhecimento enzimático de restrição dentro do 3 ' UTR, as enzimas de restrição seleccionadas para a clonagem podem ser utilizadas para a próxima etapa.
   3. No programa do projeto da primeira demão, aceite as 3 ' seqüências de UTR e comece projetar os primers para diante e reverso com a seguinte circunstância. Comprimento: 20-30 nucleotides, TM: 45-58 ° c, GC%: 40-60%. A diferença entre os valores de TM dos dois primers deve ser inferior a 5 ° c. As sequências de primer utilizadas neste estudo são fornecidas na Figura 2 suplementar. Adicionar seqüências de reconhecimento de enzima de restrição, bem como 4 nucleotídeos aleatórios para os primers projetados.
2. PCR do inclinação
   1. Prepare 25 μL de misturas de reação de PCR, incluindo primers projetados por uma temperatura de recozimento (tabela 2). Prepare quantidade suficiente de misturas com base no número total de reações. Misture a solução introduzindo pipetagem e adicione 25 μL de misturas de reacção em cada tubo. Centrifugue os tubos por alguns segundos.
   2. Execute 35-40 ciclos do PCR da etapa da desnaturação à etapa da extensão. Configurar o ciclo de PCR como as seguintes etapas: 98 ° c para 1 minuto (1 ciclo, etapa da ativação do polymerase), 95 ° c para 10 s (etapa da desnaturação), 45 ° c-68 ° c para 30 s (etapa do recozimento), 68 ° c (etapa da extensão, 10 s-1 minuto por 1000 BP), 68 e, finalmente, arrefecer até 4 ° c.
   3. Execute os produtos do PCR e verifique as faixas em um gel do agarose de 1% com escadas do ADN. Encontre a melhor temperatura de recozimento (Figura 5a). Amplificar 3 ' UTR de um gene novamente usando a melhor temperatura de recozimento para a próxima etapa.
3. Digestão dobro
   1. Faça as misturas de reação, incluindo duas enzimas de restrição, XhoI (ou AsiSI) e NotI, em um tubo (tabela 3). Incubar as misturas para 3-4 h usando um banho de água (37 ° c).
   2. Execute os produtos digeridos duplos em um gel de agarose de 1% e, em seguida, corte as bandas luz UV. No caso de vectores de luciferase, antes de funcionar em gel, reaja vetores digeridos duplos com 10 U de fosfatases alcalinas por mais 1 h para evitar a reconstituição durante a etapa de ligadura.
   3. Purify os produtos digeridos dobro do PCR e os vetores do luciferase das bandas extirpada.
4. Ligadura de produtos do PCR nos vetores do luciferase
   1. Fazer 20 μL de misturas de reacção de ligadura, incluindo a ligase de ADN (tabela 4).
      Nota: A relação molar do produto do PCR (inserção) ao vetor do luciferase pode ser 3:1. 1:1 ou 2:1.
   2. Centrifugue momentaneamente o tubo para 10-15 s e incubar em 16 ° c durante a noite usando um Thermal cycler.
      Nota: Alternativamente, o tubo pode ser incubado a 4 ° c por 2-3 dias para a ligadura. Nesta etapa, o inserto de PCR será clonado na região posicionada a jusante de um gene repórter de renilla (Figura 5b). A ligação de miRNAs para o clonado 3 ' UTR de um gene pode diminuir na atividade de renilla. Firefly luciferase é para a normalização dos níveis de expressão de renilla.
5. Transformação e PCR da colônia
   1. Adicione as misturas de ligadura (3-5 μL) no tubo que contém as células competentes. Bata suavemente no tubo e mantenha-o no gelo (20 min).
      Nota: descongelar as células competentes no gelo antes de adicionar as misturas de ligadura.
   2. Transfira rápida e suavemente o tubo para um bloco de calor. Após um choque térmico (42 ° c por 30 s-1 min), coloque o tubo no gelo por 20 min.
   3. Espalhe as células competentes na placa de agar Luria-Bertani (LB). Cresça pilhas competentes em uma incubadora (° c 37) durante a noite.
      Nota: A ampicilina (50-100 μg/mL) está contida na placa de agar.
   4. Escolha uma colônia individual e ressuscitem e . coli em um dos tubos de 8 tiras contendo água ultrapura. Repita este passo para ressuscidar E. coli de 4-8 colônias selecionadas aleatoriamente (Figura 5C).
   5. Transfira 25 μL de suspensão de E. coli para outro conjunto de tubos de 8 tiras. Agora, existem 2 conjuntos de tubos de E. coli suspensão.
      Nota: Um tubo é para a colônia PCR e outro é para inoculação. A suspensão de E. coli para inoculação pode ser temporariamente armazenada a 4 ° c (Figura 5C).
   6. Realize o PCR da colônia usando a suspensão de E. coli . Esta etapa é determinar se as colônias contêm uma inserção. Selecione as melhores colônias para inocular e isolar vetores de luciferase abrigando 3 ' UTR de um gene (Figura 5C).
      Nota: Repita o passo 5.1-5.5 para cada 3 ' UTR de genes seleccionados. Siga a condição da reação do PCR mostrada na tabela 2 substituindo o ADN genomic com suspensão de E. coli .
6. Ensaio de luciferase
   1. Prepare uma placa de 24 poços. Use 1-2 x 10⁴ células em 500 μL de mídia de cultura de células para cada poço. Não use meios de cultura da pilha que contêm P/S para o transfection porque usar P/S pode reduzir a eficiência do transfection.
   2. Transfect 50 ng de vetores de luciferase nas células com mímica de controle ou um mímico específico de miRNA usando um reagente de transfecção (Figura 5D). Se a triagem dos efeitos de uma mímica específica de miRNA em mais de uma concentração, manter a quantidade total de oligos mesmo em cada poço (ver passo 2).
   3. Lave o interior de poços duas vezes usando fosfato tampão salina (PBS) no dia seguinte.
   4. Aplique 200 μL de reagente de Lise nos poços e realize suficientemente a lise celular antes de medir a atividade da luciferase.
      Nota: Mantenha a placa em uma placa de agitação pelo menos 15 min.
   5. Transferir 5-10 μL de lisado de células para o novo tubo e adicionar 100 μL de reagente I. misture imediatamente a solução introduzindo pipetagem e leia a atividade da luciferase do vagalume utilizando um luminômetro.
      Nota: Leia a atividade luciferase Firefly para 10-15 s.
   6. Adicionar 100 μL de reagente II no mesmo tubo e, em seguida, misturar por pipetagem duas vezes. Leia a atividade de renilla luciferase para 10-15 s usando um luminômetro. Repita a etapa 5.6.5 e 5.6.6 para cada amostra.
   7. Calcule a proporção de renilla para vaga-lume (Figura 5E).
      Nota: A atividade do Firefly representa a eficiência do transfection de construções do luciferase nas pilhas.

Resultados

A confirmação bem-sucedida e precisa dos níveis de miRNA é importante para a interpretação dos dados pelos quais a classificação de miRNAs é possível com base nos papéis esperados de miRNAs no desenvolvimento e progressão de uma doença. Os níveis de miRNA-107 e miRNA-301 foram medidos em três linhagens de células pancreáticas utilizando a PCR quantitativa baseada em sonda. A síntese de cDNAs de ambos um miRNA específico e um gene de referência na mesma reação pode aumentar a reprodutibilidade dos dados. Panc-1 e capan-1 ...

Discussão

Estratégias para a determinação de alvos de miRNA de bona fide com as funções de um miRNA de interesse são indispensáveis para a compreensão de múltiplos papéis de miRNAs. A identificação de genes alvo de miRNA pode ser uma diretriz para interpretar os eventos de sinalização celular modulados por miRNAs em uma célula. Um desvelamento de genes-alvo funcionalmente importantes de miRNAs pode fornecer o conhecimento fundamental para desenvolver uma terapia baseada em miRNA no câncer.

Diversos méto...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo cônico de 15 mL	SPL Life Sciences	50015
Placa de 24 poços	Thermo Scientific	142475
Tubo cônico de 50 mL	SPL Life Sciences	50050
Placa de 6 poços	Falcon	353046
6x Corante de carregamento de DNA	Real Biotech Corporation	RD006	1 mL
Tira de 8 tampas	Aplicado Biosystems	N8010535	Para síntese de cDNA
Tira de 8 tubos	Applied Biosystems	N8010580	Para síntese de cDNA
Placa de 96 poços	Falcon	353072
Ácido acético	Sigma	A6283-1L	1 L
Agarose A	Bio Basic	D0012	500 g
Fosfatase alcalina	New England Biolabs	M0290S	10.000 U/mL
de ampicilina	Bio basic Canada Inc	AB0028	25 g
AriaMx 96 tiras de tubos	Agilent Technologies	401493	Para PCR em tempo real
Sistema de PCR em tempo real AriaMx	Agilent Technologies	G8830A	qPCR amplificação, detecção e análise de dados
AsiSI	New England Biolabs	R0630	10.000 unidades/mL
de células CAPAN-1	ATCC	HTB-79
Capuz de cultura de células	Labtech		Modelo: LCB-1203B-A2
Câmaras de contagem com V-slash	Paul Marienfeld	650010	Contador de células
CutSmart buffer	New England Biolabs	B7204S	10X concentração
DMEM	Gibco	11965-092	500 mL
	Bionics	DN30200	200 escada de DNA de preparação
	NIPPON Genetics EUROPE	MWD1	1 Kb escada
DNase I	Invitrogen	18068015	100 unidades
Sistema de ensaio repórter de luciferase dupla	Promega	E1910	100 ensaios
Soro bovino fetal	Gibco	26140-079	500 mL
de células competentes para HIT	Real Biotech Corporation (RBC)	RH617	Células competentes
Células HPNE	ATCC	CRL-4023
LB caldo de ágar	Bio Basic	SD7003	250 g
Lipofectamina 2000	Invitrogen	11668-027	0,75 mL
Lipofectamina RNAiMax	Invitrogen	13778-075	0,75 mL
Luminômetro	Promega		Modelo: E5311
Tubo de microcentrífuga	Eppendorf	22431021
Leitor de microplacas	TECAN		Infinite F50
miRNA control imita	Ambion	4464058	5 nmole
miRNA-107 imita	Ambion	4464066	5 nmole
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	50 prep
Mupid-2plus (sistema de eletroforese)	TaKaRa		Modelo: AD110
NotI	New England Biolabs	R3189	20.000 unidades/mL
Programa Oligo explorer	GeneLink		Para design de primer
Tampas de tiras de tubos ópticos (8x Strip)	Agilent Technologies	401425	Para PCR em tempo real
Opti-MEM	Gibco	31985-070	500 Ml
PANC-1 células	ATCC	CRL-1469
Penicilina/estreptomicina	Gibco	15140-122	100 mL
Tampão fosfato solução salina	Gibco	14040117	1000 mL
Miniprep de DNA plasmídeo S& V kit	Bionics	DN10200	200 prep
PrimeSTAR GXL DNA polimerase	TaKaRa	R050A	250 unidades
Shaker	TECAN		Plataforma de agitação
Incubadora	de agitação Labtech		Modelo: LSI-3016A
Sigmaplot 14 software	Systat Software Inc		Para geração de curva de dose-resposta
Sulforrodamina B em pó	Sigma	S1402-5G	5 g
SYBR green master mix	Smobio	TQ12001805401-3	Corante fluorescente de ligação para dsDNA
T4 DNA ligase	TaKaRa	2011A	25.000 U
TaqMan master mix	Applied Biosystems	4324018	200 reações, sem AmpErase UNG
TaqMan microRNA assay (has-miR-107)	Applied Biosystems	4427975	ID do ensaio: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)
Ensaio de microRNA TaqMan (has-miR-301)	Applied Biosystems	4427975	ID do ensaio: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)
Kit TaqMan miR RT	Applied Biosystems	4366597	1.000 reações
Incubadora Thermo CO2 (BB15)	ThermoFisher Scientific		37 ° C e 5% CO2 incubação Ácido
tricloroacético	Sigma	91228-100G	100 g
Base Trizma	Sigma	T4661-100G	100 g
Água ultrapura	Invitrogen	10977-015	500 mL
Veriti Termociclador de 96 poços	Applied Biosystems		Para amplificação de DNA (ou cDNA)
XhoI	New England Biolabs	R0146	20.000 unidades/mL