Isolamento e quantificação do vírus Zika de múltiplos órgãos em um mouse

Summary

O objetivo do protocolo é demonstrar as técnicas utilizadas para investigar a doença viral, isolando e quantificando o vírus Zika, de múltiplos órgãos em um camundongo após a infecção.

Abstract

Os métodos apresentados demonstram procedimentos laboratoriais para o isolamento de órgãos de animais infectados pelo vírus Zika e a quantificação da carga viral. O objetivo do procedimento é quantificar os títulos virais em áreas periféricas e do SNC do camundongo em diferentes pontos temporais pós-infecção ou diferentes condições experimentais para identificar fatores virológicos e imunológicos que regulam a infecção pelo vírus Zika. Os procedimentos da isolação do órgão demonstraram permitem a quantificação do ensaio da formação do foco e a avaliação quantitativa do PCR de Titers virais. As técnicas rápidas da isolação do órgão são projetadas para a preservação do Titer do vírus. A quantificação do Titer viral pelo ensaio de conformação de foco permite a avaliação rápida da taxa de transferência do vírus Zika. O benefício do ensaio de formação de foco é a avaliação do vírus infeccioso, a limitação deste ensaio é o potencial para toxicidade de órgãos reduzindo o limite de detecção. A avaliação do Titer viral é combinada com o PCR quantitativo, e usar um número de cópia do genoma viral do controle da cópia do RNA recombinante dentro do órgão é avaliado com baixo limite de deteção. No geral, essas técnicas fornecem um método de alta taxa de transferência rápida e precisa para a análise dos títulos virais da Zika na periferia e no SNC dos animais infectados pelo vírus Zika e podem ser aplicados à avaliação de títulos virais nos órgãos de animais infectados com a maioria dos patogénicos, incluindo o vírus da dengue.

Introduction

O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus pertencente à família Flaviviridae, que inclui importantes patógenos humanos neuroinvasivos, como o vírus Powassan (POWV), o vírus da encefalite japonesa (JEV) e o vírus do Nilo Ocidental (WNV)¹. Após seu isolamento e identificação, houve relatos periódicos de infecções humanas de zikv na África e na Ásia^2,3,4,5e epidemias dentro da América Central e do Sul (revisada em referência⁶). Entretanto, não era até recentemente que o ZIKV estêve pensado para causar a doença severa⁷. Agora há milhares de casos de doença neurológica e defeitos congênitos ligados a infecções por ZIKV. A rápida emergência do ZIKV tem alertado para muitas questões relacionadas com: por que há um aumento na severidade da doença, qual é a resposta imunológica à infecção por ZIKV e existem patologias virais e/ou imunes mediadas ligadas ao aumento da manifestações e defeitos congênitos. Há agora uma pressa para compreender a doença relacionada do sistema nervoso central (CNS) associada com o ZIKV assim como a necessidade de testar ràpida a eficácia dos antivirais e das vacinas de encontro a ZIKV. É contra este pano de fundo que desenvolvemos métodos para a rápida análise dos títulos de ZIKV tanto na periferia como no SNC, utilizando um foco específico de ZIKV formando ensaios (FFA).

Os modelos animais pequenos são importantes para compreender a progressão da doença e para a avaliação adiantada das vacinas, da terapêutica, e dos anti-Virals. Nós estabelecemos modelos animais pequenos para o estudo da doença do arbovírus usando várias tensões do rato para modelar a infecção humana e a proteção de encontro aos micróbios patogénicos virais^{8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22}. Usando essa experiência prévia, começamos a modificar as técnicas utilizadas para a avaliação do vírus da WNV e da dengue, um Flavivirus relacionado para a avaliação do titer de zikv em ambos os órgãos periféricos, bem como o SNC^21,23, as vantagens ²⁴. The destes métodos sobre outros ensaios são: 1) que combinam a habilidade de colher órgãos periféricos e do CNS para a análise; 2) os métodos são adaptáveis para a citometria de fluxo, para medições de respostas imunes inatas e adaptativas, juntamente com títulos virais no mesmo animal no mesmo órgão; 3) a técnica de colheita é adaptável para análise histológica; 4) o ZIKV FFA é um método rápido da taxa de transferência elevada para a análise viral do Titer; e 5) esses métodos podem ser aplicados à avaliação de títulos virais nos órgãos de animais infectados com a maioria dos patógenos²⁵.

Protocol

Todos os procedimentos do presente estudo estão de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de cuidados e uso de animais da Universidade de St. Louis. A SLU é totalmente credenciada pela Associação de avaliação e credenciamento do laboratório de cuidados com animais internacionais (AAALAC).

1. isolamento de órgãos

Nota: O vírus não é estável à temperatura ambiente (RT), de modo que o número de animais colhidos ao mesmo tempo deve ser planejado cuidadosamente para preservar os títulos virais.

1. Infectar camundongos usando a dose escolhida e rota, com base no fenótipo necessário. Para este protocolo, infectar 8-10 semanas de idade masculino e feminino tipo I receptor de interferon deficiente (Ifnar1^-/-) C57Bl/6 camundongos.
   1. Anestesie Ifnar1^-/- camundongos com um coquetel de cetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Teste o reflexo do pedal por uma pitada firme do dedo do pé para confirmar a anestesia. Administrar 1 x 10⁵ unidades de conformação de foco (FFU) de zikv em 50 μL por via SUBCUTÂNEA (SC) através do footpad.
2. Prepare todos os materiais necessários para a colheita no dia anterior: 2 tesouras, fórceps e 20 mL de etanol a 70% (EtOH) em um 50 mL cônico para desinfecção de ferramentas.
   1. Prepare seringas e agulhas: uma seringa de 20 mL para perfusão, 23 G agulhas (aproximadamente 1 por gaiola) e 1 mL seringa com 25 G agulha (1 por 3-5 mouse). Antes de pesar os tubos, adicione grânulos de aço (na capa) a 1,5 mL de tubos de rosca de parafuso de anel-O (um para cada órgão). Os tubos precisam ser apropriados para homogeneização.
3. Prepare o dia da colheita os materiais necessários para a perfusão e congelamento de órgãos.
   1. Encha um balde de gelo com gelo seco e 70% EtOH para fazer um banho de gelo. Prepare solução salina tampão fosfato estéril (PBS) assumindo que 25-30 mL por rato de PBS para cada perfusão é necessário 5-10 mL para a medula espinhal). Obter anestesia, um coquetel de cetamina e xilazina, e assumir 300 μL por mouse. Coloc todos os materiais e todos os tubos adicionais exigidos para a citometria do fluxo, etc., em um recipiente secundário para transportar à facilidade animal.
4. Siga todos os procedimentos necessários para a entrada, incluindo a colocação e Doffing equipamento de protecção pessoal durante a entrada e saída para a instalação animal.
   Atenção: Todos os procedimentos devem ser realizados em um gabinete de biossegurança certificado dentro de uma instalação de laboratório de nível 2 de biossegurança (BSL-2).
5. Administrar anestesia, 200-500 μL, intraperitonealmente dependendo do tamanho e peso do animal. Se trabalhar sozinho, administrar anestesia para um animal de cada vez para evitar matar os animais antes da colheita de órgãos.
   1. Confirme a dose de anestesia apertando o dedo do pé com fórceps para avaliar o reflexo do pedal. Não continue a menos que completamente não responsivo. Use pinos para fixar o mouse a uma placa de cera. Neste ponto, apagar o mouse em 70% etanol para evitar a contaminação do cabelo no procedimento de colheita de órgãos
6. Hemorragia terminal por punção cardíaca.
   1. Usando a tesoura e fórceps, abra o animal através da cavidade torácica para expor o coração. Colete sangue através de punção cardíaca (~ 800 μL), isso pode ser usado para ensaios múltiplos, incluindo química clínica, Hematologia, citometria de fluxo para detectar respostas específicas do antígeno, e PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) para a análise do número de cópias virais.
   2. Para a análise viral do RNA pelo qRT-PCR, colete o sangue em um tubo do EDTA se extraindo do sangue inteiro ou em um tubo do microcentrifugador se extraindo do soro. (Para o soro, o tubo da rotação na velocidade máxima no centrifugador, Temp do quarto, por 20 minutos e remove o soro a um tubo separado). Adicione um poliacrilamida linear como um portador à amostra do soro após o revestimento. O RNA pode então ser analisado ou armazenado em-80 ° c ao processo mais adicional em uma data mais atrasada.
7. Encha a seringa de 20 mL com PBS, à temperatura ambiente (ou 37 ° c) e perfuse os ratos inserindo a agulha borboleta no ventrículo esquerdo. Perfure o átrio direito para permitir que o sangue e a PBS saiam. Administre lentamente o PBS ao verificar a cor do fígado para confirmar que o animal está completamente perfused. Fígado deve mudar de vermelho profundo para cor de salmão rosa.
   1. Se preparando os órgãos para a histologia, deixe a agulha da borboleta no lugar e perfuse então com 20 mL do paraformaldehyde do frio 4% do gelo. Em caso afirmativo, é conveniente ter a seringa conectada a um torneira de 3 vias com ambas as seringas anexadas a ela, girando a válvula on e off como uma alterna entre PBS e PFA.
8. Colha órgãos em tubos rotulados e pesados. Para os órgãos periféricos, siga uma ordem estabelecida para a colheita: fígado, baço, rim e pulmões.
   1. Tome apenas um lobo do fígado; Não importa qual deles, mas para todos os experimentos sempre tentam tomar o mesmo lobo com a mesma peça de tamanho. Similarmente, para rins e pulmões, tome o mesmo rim e pulmão. Se a citometria de fluxo também deve ser concluída, qualquer órgão pode ser cortado ao meio. Armazene a metade a ser usada para a citometria no meio do Instituto do Memorial de Roswell Park (RPMI) na temperatura ambiente até que a colheita esteja completa.
   2. Imediatamente após a colheita, coloque cada órgão em um tubo rotulado e coloque no banho de gelo seco. O Titer do vírus reduz-se sobre o tempo na temperatura ambiente, assim que a quantidade de tempo que toma para colher órgãos é extremamente importante. Deve haver consistência entre os camundongos, então, após a segurança, a próxima prioridade é a velocidade.
      Nota: Se a colheita de órgãos para títulos virais, é muito útil ter um segundo indivíduo colher o cérebro neste momento, para preservar os títulos virais.
9. Remova os órgãos restantes da cavidade do corpo do rato para obter acesso à coluna vertebral e ao crânio.
   1. Retire o mouse do tabuleiro e retire o Pelt, seguido pela remoção dos braços e pernas.
      Retire a cabeça do mouse com uma tesoura decapitação, Blunt ou cirúrgica para colher o cérebro cortando o crânio com uma tesoura de Lagrange serrilhada através do Magnum forâmen. Em seguida, retire o crânio com fórceps e retire o cérebro com uma espátula.
   2. Usando a tesoura forte, Blunted, remova as costelas e outros ossos que cercam a espinha. Em seguida, corte através do osso pélvico, expondo o forame vertebral no nível lombar. A pequena ponta da medula espinhal deve ser visível neste momento.
   3. Use uma seringa de 10 mL preenchida com PBS e uma agulha de 18 G para expulsar a medula espinhal por "rubor" do cordão lombar para a coluna cervical sobre um prato de Petri.
   4. Com cuidado, coloc a ponta chanfrada da agulha dentro do forâmen vertebral, evitando a pressão excessiva para impedir que a agulha trespassar o corpo vertebral. Segure fortemente para exercer pressão sobre o corpo vertebral e a agulha e pressione o êmbolo da seringa para expelir o cordão. Transfira imediatamente a medula espinhal no tubo rotulado e coloque no banho de gelo seco.
10. Repita o procedimento com todos os animais até que a colheita esteja terminada. Coloque as ferramentas de colheita no etanol 70% entre os animais. Concentre-se na consistência e velocidade. O período de tempo entre cada colheita de órgão deve permanecer consistente de modo a não viés de resultados do título viral.
11. Quando terminar, desinfete o gabinete de biossegurança e todo o material antes de removê-lo da instalação animal.
12. Retire cada tubo do banho de gelo e pesar tubos para determinar o peso dos órgãos. Para determinar o peso dos órgãos, subtrair o peso do tubo vazio do peso do órgão que contém o tubo.
    Nota: Neste ponto os órgãos podem ser congelados em-80 ° c ao processo mais adicional em uma data mais atrasada ou os órgãos podem Homogeneized imediatamente antes de congelar alíquotas individuais. Congelar amostras de descongelamento várias vezes diminui o título viral. Portanto, é importante fazer o mesmo procedimento para todos os experimentos dentro de um único projeto.

2. homogeneização de órgãos

1. Prepare 3 tubos com o rótulo de 1,5 mL para que cada órgão seja homogeneizado.
2. Se as amostras não estiverem sendo homogeneizadas imediatamente após a colheita, retire os tubos de-80 ° c. As amostras não precisam ser descongelados para homogeneizar.
3. Coloque as amostras no gelo para mantê-los frios para minimizar a perda de Titer viral. Em seguida, adicionar 1 mL de DMEM frio contendo 5% FBS para cada órgão contendo tubo.
4. Bata imediatamente os tubos no batedor do grânulo de acordo com as instruções do fabricante. Homogeneize todos os órgãos com grânulos de aço em um instrumento do grânulo-homogeneizador. Verifique para garantir que cada órgão foi completamente homogeneizado.
5. Gire para baixo os restos do órgão no microcentrífuga em 12.000 x g por 5 minutos em um microcentrífuga que seja refrigerado a 8 ° c. Em seguida, devolva os tubos para o balde de gelo. No gabinete de biossegurança, as amostras de alíquota em tubos para os ensaios necessários. Em seguida, devolva os tubos para o balde de gelo.
6. Para o foco que dá forma ao ensaio, alíquota 500 μL em um tubo etiquetado. Em seguida, coloque os tubos no rack em um balde de gelo. Alíquota 50 μL em um tubo para RNA para RT-PCR quantitativo fluorogénico (qRT-PCR) para medir o número da cópia do genoma viral.
7. Isole o RNA total dos órgãos dos animais infectados usando um kit de isolamento de RNA comercial. Determine o RNA viral do Flavivirus usando os jogos da ponta de prova do primer específicos para ZIKV, que reconhece seqüências originais em cada genoma do Flavivirus. Determine o número da cópia viral usando um plasmídeo do controle da cópia que contem um RNA único-encalhado positivo definido gerado in vitro usando o polymerase T7 que contem as seqüências do alvo de ZIKV.
8. Aliquot a amostra restante, que é aproximadamente 300 μL, no terceiro tubo e armazene em-80 ° c se necessário.
   Nota: Se as amostras não foram congeladas previamente, congele a-80 ° c. Se as amostras tivessem sido previamente congeladas, continue no ensaio de formação de foco e/ou isolamento de RNA antes de parar.

3. ensaio de formação do Zika Virus Focus²⁶

Nota: É importante incluir um controle sem vírus e um controle positivo. O controle positivo é uma série de diluição de um estoque de vírus com uma concentração conhecida. Nem todos os controles precisam estar na mesma placa, mas como o ensaio torna-se maior do que 5 placas, mais controles devem ser adicionados, e espalhar-se entre as placas. Tome cuidado para não arranhar a monocamada com as pontas de Pipet ou por lavagem vigorosa. Vários órgãos podem ser titulados no mesmo dia ou em dias diferentes. Mas um órgão individual não deve ser titulado ao longo de vários dias, porque diferentes condições de ensaio pode impactar o Titer viral. É altamente recomendável executar um órgão individual em um único dia.

1. Antes do dia do ensaio, prepare as células e os reagentes necessários para o ensaio de formação de focagem.
   1. Prepare meios de crescimento contendo 500 mL de DMEM com 5 mL de HEPES e 25 mL de FBS. Tenha as pilhas da organização de saúde do vero-mundo (OMS) que crescem em meios do crescimento em 37 ° c, 5% CO₂ antes do começo do ensaio. As células Vero não deve ser uma passagem alta ou nunca cresceu mais de 100% confluência antes do início do ensaio.
   2. Prepare 500 mL de uma solução de metilcelulose a 2%, autoclavando um frasco de vidro de 1 L com 10 g de metilcelulose e uma grande barra de agitação e uma garrafa de meio de vidro de 1 L separada com 500 mL de H₂O. Se a água autoclavada resfriou o reaquecimento no microondas até que a garrafa esteja quente ao toque, mas não fervendo.
   3. Derrame delicadamente a água morna/quente no frasco do metilcelulose quando na capa da cultura do tecido. Parcialmente Tampe a garrafa e mexa na chapa até que a metilcelulose esteja em solução (1-4 h). Aliquot a solução de metilcelulose a 2% em tubo cônico estéril de 50 mL. a metilcelulose a 2% pode ser armazenada a 4 ° c até ser necessária.
   4. Prepare uma solução de paraformaldeído a 5% em PBS para fixar as placas e armazenadas a 4 ° c até serem necessárias. Prepare um foco 1x que dá forma ao amortecedor da lavagem do ensaio adicionando 0, 5% Triton X-100 a PBS e armazenado em RT. Prepare um tampão de coloração de 1x FFA adicionando 1 mg/mL de saponina ao PBS e armazenado a 4 ° c até ser necessário. Estes podem ser preparados com uma ou duas semanas de antecedência.
2. Calcule o número de placas de poço de fundo plano 96 necessárias para o ensaio de tal forma que cada órgão é banhado em triplicado. Inclua poços adicionais suficientes para controles positivos e negativos.
   1. Cresça acima bastante pilhas de vero em meios do crescimento para terminar o ensaio projetado. Trypsinize as células Vero e contá-los ressuscite-los em 1,5 x 10⁵ células por ml em meios de crescimento. Células de chapa vero no 96 placas de fundo plano bem em 3,0 x 10⁴ vero-Who células/bem em meios de crescimento, adicionando 200 μl por poço.
   2. Incubar as placas a 37 ° c a 5% CO₂ durante a noite, certifique-se que as placas estão niveladas na incubadora assim que as pilhas são distribuídas ingualmente dentro do poço.
      Nota: Cada laboratório cresce células Vero ligeiramente diferente; o alvo é uma monocamada confluente de 90-95% em cada poço no dia do ensaio para o vírus Zika.
3. Diluir as amostras de vírus Zika no dia do ensaio. Se as amostras de órgãos tivessem sido previamente homogeneizadas, retire as amostras do congelador-80 ° c e deixe-as descongelar antes de colocar as amostras no gelo para o ensaio.
   1. No gelo, prepare uma placa de fundo redonda 96 bem adicionando 180 μL de mídia de crescimento frio para as linhas B a H deixando a linha A vazia. Adicionar 150 μL de cada amostra de órgão homogeneizado à linha a da placa inferior redonda.
   2. Prepare diluições seriadas de 10 vezes de cada amostra, usando uma pipeta multicanal. Diluir amostras em uma placa de fundo redonda 96 bem adicionando 20 μL de amostra em 180 μL de meios de crescimento, alterando as pontas de pipeta entre cada diluição.
4. Prepare o foco formando placa, removendo a mídia da placa de fundo plano 96 bem cobrindo células Vero. Faça isso imediatamente antes de adicionar as amostras de vírus para evitar que a monocamada seque.
   1. Adicionar 100 μL da diluição do vírus a cada poço na placa vero. Adicione a amostra usando o mesmo conjunto de dicas, indo do mais baixo para a concentração mais alta. Placas de rocha lado a lado 2-4 vezes sendo cuidadoso para não girar.
   2. Incubar a 37 ° c, 5% CO₂ para 1-2 h. Certifique-se que as placas estão nivelados dentro da incubadora. Durante a incubação aquecer 2% metilcelulose para RT.
   3. Diluir 2% solução de metilcelulose em meios de crescimento. A diluição deve estar em uma proporção de aproximadamente 2:1 de metilcelulose a 2% para meios de crescimento. Manter em temperatura ambiente até que seja hora de usá-lo. Adicione 1-2 gotas/poço (ajuste o Pipet a 125 μL) do methylcellulose: meios do crescimento a cada poço da placa do poço 96.
   4. Incubar 32-40 h a 37 ° c, 5% CO₂. Como as células Vero de todos crescem de forma ligeiramente diferente e fatores, incluindo confluência celular e tensão do vírus Zika pode mudar o tempo de incubação.
5. Corrija as células Vero usando a solução de paraformaldeído 5% preparada.
   1. Adicionar 50 μL de paraformaldeído a 5% a cada poço na parte superior da camada de metilcelulose no armário de biossegurança. Incubar por 60 min em RT. A fixação pode ir durante a noite a 4 ° c, mas cubra a placa com parafilm para reduzir a evaporação.
   2. Despejar sobreposição e mídia fora das células em um recipiente de descarte dentro do gabinete de biossegurança. Lave suavemente com PBS, 150 μL/poço. Retire a PBS das placas e retire a placa do BSL-2.
   3. Repita a lavagem de PBS 2x que adiciona 150 μL/poço. Em seguida, retire o PBS. Adicionar 150 μL/poço 1x FFA tampão de lavagem e deixe sentar-se por 5-10 min em RT para permeabilizar as células fixas.
6. Detecte a infecção usando o anticorpo principal de Zika. Prepare o anticorpo primário 4G2 (D1-4G2-4-15) em uma concentração de 1 mg/mL em FFA mancha tampão. Prepare anticorpos suficientes para todo o ensaio.
   Nota: Fique longe de fraldas de laboratório ou outro material absorvente de alto-Lint, pois as fibras irão impactar negativamente a imagem dos focos.
   1. Remover FFA tampão de lavagem das placas. Adicionar 50 μL/poço do anticorpo primário no tampão de coloração FFA. Selar as placas com parafilm e incubar durante a noite a 4 ° c em uma plataforma de balanço. O ensaio pode ser feito com uma incubação para 2 h em RT.
7. Visualize a infecção pela adição de um anticorpo conjugado HRP secundário. Prepare o secundário de cabra anti-rato HRP-rotulado anticorpo em uma concentração de 1:5000 em FFA mancha tampão. Prepare anticorpos suficientes para todo o ensaio.
   1. Lave as células 3x com buffer de lavagem FFA, removendo o tampão de lavagem por flicking no dissipador de cada vez. Manchar as células com o anticorpo secundário em FFA mancha tampão em 50 μL/bem. Incubar 1-2 h em RT.
   2. Lave as células 3x com buffer de lavagem FFA, removendo o tampão de lavagem por flicking no dissipador de cada vez. Adicionar 50 μL/poço do substrato Trueblue.
   3. Assista as placas com cuidado, esperando 2-15 min até manchas são totalmente definidos e fundo mínimo. Depois que os pontos são visíveis, lave delicadamente com água, usando uma mão para proteger o monocamada da força da água que funciona. Toque em secar em toalhas de papel (não fraldas) e imagem o mais rapidamente possível.
   4. Os pontos podem ser contados manualmente ou usando um contador de spot automatizado. Se contado manualmente, um escopo de dissecação pode ser usado para auxiliar na visualização.
   5. Para cada amostra, selecione uma diluição com focos facilmente distintos (por exemplo, 20 a 200 por poço) e calcule o título em unidades formadoras de foco por mL (FFU/ml), usando a média de poços duplicados: FFU/mL = (média de focos/poço) × (fator de diluição) ÷ (mL de inóculos).

Results

Para avaliar títulos de zikv usando o protocolo descrito acima Ifnar1^-/- os ratos foram contaminados com o zikv (PRVABC59) através da injeção subcutaneous (SC) ao footpad. Aqui, a administração de 1 x 10⁵ FFU de zikv para 8-12 semana de idade Ifnar1^-/- MICE SC não é letal, mas o vírus pode replicar na periferia e CNS. Esta dose e rota são usadas para estudar as respostas imunes do patógeno hospedeiro e a patogenicidade. Administração de ...

Discussion

A infecção por ZIKV pode causar uma doença neurológica, portanto, os modelos animais atuais para estudar a patogênese, respostas imunes e eficácia protetora de vacinas e antivirais precisam se concentrar no controle viral dentro do SNC. Um dos desafios em focar na doença do SNC é que muitas vezes vem à custa de estudar a infecção periférica. Os métodos de isolamento de órgãos propostos aqui se centram na necessidade de avaliar rapidamente a infecção pelo ZIKV tanto na periferia quanto no SNC, a fim de avaliar a doença as...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-bromo-3-cloropropano (BCP)	MRC gene	BP151
seringa de 10 cc	Thermo Fisher Scientific	BD 309642
agulha de 18 G	Thermo Fisher Scientific	22-557-145
Seringa TB de 1 cc	Thermo Fisher Scientific	14-823-16H
Seringa de 20 cc	Thermo Fisher Scientific	05-561-66
24 tubo beadmill	Thermo Fisher Scientific	15 340 163
3.2 mm contas de aço inoxidável	Thermo Fisher Scientific	NC9084634
37 ° C Incubadora de cultura de tecidos	Nuair	5800
4G2 anticorpo	em casa
96 placas de fundo plano de poço	Midsci	TP92696
96 placas de fundo redondo de 96 poços	Midsci	TP92697
Basix tubos eppendorf	Thermo Fisher Scientific	02-682-002
Grampos de alvejante germicida concentrado		30966CT
CTL S6 Analisador	CTL	CTL S6 Universal Analisador
Tesoura de corte curvo	Fine Science Tools	14061-11
Dulbecco ' s Águia Modificada' s Glicose média - alta Com 4.500 mg/L de glicose	MilliporeSigma	D5671
Etanol (grau de biologia molecular)	MilliporeSigma	e7023
Soro Bovino Fetal	MilliporeSigma	F0926-500ML
Fórceps	Fine Science Tools	11036-20
Ácido acético glacial	MilliporeSigma	537020
Cabra anticorpo anti-camundongo marcado com HRP	MilliporeSigma	8924
HEPES 1 M	MilliporeSigma	H3537-100ML
Isopropanol (grau de biologia molecular)	MilliporeSigma	I9516
Coquetel de cetamina/xilazina	Medicina Comparativa
L-glutamina	MilliporeSigma	g7513
Magmax RNA kit de purificação	Thermo Fisher Scientific	AM1830
Metilcelulose	MilliporeSigma	M0512
Microcentrífuga	Ependorf	5424R
MiniCollect 0,5 mL Tubos EDTA	Bio-one	450480
Tubos O-ring	Thermo Fisher Scientific	21-403-195
One step q RT-PCR mix	Thermo Fisher Scientific	4392938
Paraformaldeído	Thermo Fisher Scientific	EMS- 15713-S
Fosfato Tampolado Salino	MilliporeSigma	d8537-500ml
Pipetas multicanal Proline	Sartorius	72230/72240
Pipetas de canal único Proline	Sartorius	728230
Água livre de RNAse	Thermo Plataforma
	11-676-333
RPMI 1640	Fisher	MT10040CV
Saponina	MilliporeSigma	s7900
Fine	Science Tools	10090-17
tesoura de corte	Fine Science Tools	14060-11
Triton X-100	MilliporeSigma	t8787
True Blue Substrate	VWR	95059-168
Trypsin	MilliporeSigma	T3924-100ML