Construção de Plasmids CRISPR e Detecção de Eficiência de Nocaute em Células Mamíferas através de um Sistema de Repórteres Dual Luciferase

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo um método simplificado para a geração eficiente de plasmídeos expressando tanto a enzima CRISPR quanto o RNA guia único associado (sgRNAs). A co-transfecção de células mamíferas com este vetor sgRNA/CRISPR e um vetor de repórter de luciferase dupla que examina o reparo de quebra de dois fios permite avaliação da eficiência do nocaute.

Abstract

Embora altamente eficiente, a modificação de um site genômico pela enzima CRISPR requer a geração de um sgRNA exclusivo do site de destino de antemão. Este trabalho descreve os principais passos que levam à construção de vetores sgRNA eficientes usando uma estratégia que permite a detecção eficiente das colônias positivas por PCR antes do sequenciamento de DNA. Uma vez que a edição eficiente do genoma usando o sistema CRISPR requer um sgRNA altamente eficiente, uma pré-seleção de alvos sgRNA candidatos é necessária para economizar tempo e esforço. Um sistema de repórter de dupla luciferase foi desenvolvido para avaliar a eficiência do nocaute examinando o reparo de quebra de dois fios através de um único ressarcimento de fios. Aqui, usamos este sistema de repórteres para pegar o alvo xCas9/sgRNA preferido dos vetores sgRNA candidatos para edição específica de genes. O protocolo delineado fornecerá um vetor de enzima sgRNA/CRISPR preferido em 10 dias (começando com oligonucleotídeos devidamente projetados).

Introduction

Os sgRNAs CRISPR compreendem uma sequência de 20 nucleotídeos (o protoespaço), que é complementar à sequência genômica de alvo^1,2. Embora altamente eficiente, a capacidade do sistema CRISPR/Cas de modificar um determinado site genômico requer a geração de um vetor que carrega um sgRNA eficiente exclusivo do site de destino². Este artigo descreve os principais passos na geração desse vetor sgRNA.

Para a edição de genoma bem-sucedida usando o sistema CRISPR/Cas, o uso de sgRNAs altamente eficientes é um pré-requisito crucial^3,....

Protocol

1. sgRNA design de oligonucleotídeo

1. Design sgRNAs usando ferramentas on-line, como a ferramenta online Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/). A sequência PAM é importante com base no Cas9 que está sendo usado. Para xCas9, as sequências pam relevantes são NG e a antiga ferramenta on-line Cas-Designer referida pode gerar sgRNAs relevantes xCas9.
   1. Use ferramentas de design sgRNA que englobam algoritmos para previsão on-and-target (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)¹¹. É preferível uma pontuação de 0,2 ou superior.
2. Selecione até 3 alvos de edição de genes para....

Results

Os métodos descritos neste protocolo são para a construção de vetores de expressão sgRNA e xCas9 e, em seguida, para a triagem de otimização de oligos sgRNA com eficiências relativamente mais altas de segmentação genética. Aqui exibimos um exemplo representativo de 3 alvos sgRNA para ovelhas DKK2 exon 1. Os vetores de expressão SgRNA e xCas9 podem ser construídos predigesting a espinha dorsal vetorial (Figura 2), seguido por ligante-lo em uma série de fragmentos curtos de DNA de doi.......

Discussion

Os procedimentos de clonagem de vetores sgRNA que descrevemos aqui facilitam a produção eficiente de sgRNAs, com a maioria dos custos derivados do pedido de oligonucleotídeos e sequenciamento vetorial. Embora o método delineado seja projetado para permitir que os usuários gerem sgRNAs para uso com CRISPR/Cas9, o protocolo pode ser facilmente adaptado para uso com ortomologias Cas9 ou outros endonucleases guiados por RNA, como o Cpf1, introduzindo pequenas modificações na espinha dorsal vetorial e nas sequências de saliên.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Uma nova geração de instrumento de PCR de gradiente de tela sensível ao toque	LongGene	A200	Amplificação do gene alvo
Enzimas de restrição AscI	New England Biolabs	R0558V	Vetores alvo de corte
Enzima de restrição BbsI	New England Biolabs	R0539S	Vetores alvo de corte
Bancada de trabalho limpa	AIRTECH	SW-CJ-2FD/VS-1300L-U	Um dispositivo de purificação parcial na forma de um fluxo laminar vertical, que cria um ambiente local de ar limpo
DH5 & alfa; Sistema	transformação do vetor do plasmídeo	TaKaRa	K613
		Ensaio do repórter do Duplo-luciferas
Banho-maria termostático elétrico	Sanfa Scientific Instruments	DK-S24	Reagente de aquecimento por temperatura constante em banho-maria
Eletroforese	Pequim Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	DYY-6C	Tensão de controle, corrente, etc.
Eppendorf Referência 2	Eppendorf China Ltd.	Referência 2	Desenhe e transfira com precisão traços do analisador de imagem de
gel	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	WD-9413B	Para a análise de imagens de gel de eletroforese
GloMax 20/20 Luminometer	Promega	E5311	Detectar atividade dupla de luciferase
Centrífuga refrigerada de alta velocidade	BMH	sigma 3K15	Extração e purificação de ácido nucleico
Incubadora bioquímica inteligente	Sanfa Scientific Instruments	SHP-160	Forneça um ambiente de temperatura adequado para o experimento de digestão enzimática
LB Broth Agar	Sangon Biotech	A507003-0250	Para o cultivo de E.coli
Lipofectamine 3000 Kit de reagentes de transfecção	Thermo Fisher	L3000015	DNA Transfecção
SalI enzimas de restrição	New England Biolabs	R3138V	Vetores alvo de corte
SanPrep Column DNA Gel Kit de extração	Sangon Biotech	B518131-0050	Reciclagem de fragmentos de DNA
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit	Sangon Biotech	B518191-0100	Extração de DNA de plasmídeo
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202V	Link Fragmento de DNA
TaKaRa MiniBEST Kit de purificação de fragmentos de DNA Ver.4.0	TaKaRa	9761	Purificação
de DNA Vertical esterilizador a vapor de pressão	JIBIMED	LS-50LD	Alta temperatura e autoclave para matar bactérias, fungos e outros microorganismos em equipamentos de laboratório
Termostato de banho-maria	Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.	SHZ-82	Deixe as bactérias continuarem tremendo, o que é bom para o contato com o ar.