Um ensaio de estabilidade de alvo responsivo de afinidade de drogas semiquantitativa (DARTS) para o estudo da interação Rapamycin/mTOR

Resumo

Neste estudo, aprimoramos as capacidades de análise de dados do experimento DARTS, monitorando as mudanças na estabilidade protéica e Estimando a afinidade das interações proteína-ligand. As interações podem ser plotadas em duas curvas: uma curva proteolítica e uma curva de dependência de dose. Nós usamos a interação de mTOR-Rapamycin como um caso exemplar.

Resumo

A estabilidade do alvo responsivo da afinidade da droga (dardos) é um método robusto para a deteção de alvos pequenos novos da proteína da molécula. Pode ser usado para verificar interações pequenas conhecidas da molécula-proteína e encontrar alvos potenciais da proteína para produtos naturais. Comparado com outros métodos, DARTS usa moléculas nativas, não modificadas, pequenas e é simples e fácil de operar. Neste estudo, aprimoramos ainda mais as capacidades de análise de dados do experimento DARTS, monitorando as mudanças na estabilidade protéica e Estimando a afinidade das interações proteína-ligand. As interações proteína-ligantes podem ser plotadas em duas curvas: uma curva proteolítica e uma curva de dependência de dose. Nós usamos a interação de mTOR-Rapamycin como um exemplo exemplar para o estabelecimento de nosso protocolo. A partir da curva proteolítica, vimos que a proteólise do mTOR por soros foi inibida pela presença de rapamicina. A curva dose-dependência nos permitiu estimar a afinidade de ligação da rapamicina e do mTOR. Este método é susceptível de ser um método poderoso e simples para identificar com precisão novas proteínas-alvo e para a otimização do engajamento alvo de drogas.

Introdução

Identificar proteínas-alvo de pequenas moléculas é essencial para a compreensão mecanicista e o desenvolvimento de potenciais fármacos terapêuticos^1,2,3. A cromatografia de afinidade, como método clássico para identificar as proteínas-alvo de pequenas moléculas, produziu bons resultados^4,5. No entanto, este método tem limitações, em que a modificação química de pequenas moléculas geralmente resulta em especificidade ou afinidade de ligação reduzida ou alterada. Para superar essas limitações, várias novas estratégias f....

Protocolo

1. coletar e lyse células

1. Cresça as células 293T usando o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro bovino fetal, 2 mM de glutamina e 1% de antibióticos. Incubar culturas a 37 ° c 5% CO₂.
   Nota: o estado de crescimento das células pode afectar a estabilidade dos experimentos subsequentes.
2. Expandir células na cultura até atingir 80 \ u201290% confluência.
3. Misturar 345 μL de reagente de lise celular (ver a tabela de materiais) com 25 μL de cocktail inibidor da protease 20x, 25 μL de fluoreto de sódio a 1 M, 50 μl de 100 mm β-glicerofosfato, 50 μL de pirofosfato de sódio a 50 mm e 5 μL de ortov....

Resultados

O fluxograma do experimento é delineado na Figura 1. O resultado da coloração azul de Coomassie é mostrado na Figura 2. A incubação com a pequena molécula confere proteção contra proteólise. Três bandas que parecem ser protegidas por incubação com rapamicina sobre o controle do veículo são encontradas. Os resultados esperados do experimento de curva proteolítica são mostrados na Figura 3. Como prova de princípio, examinamos a proteí.......

Discussão

O DARTS permite a identificação de alvos pequenos da molécula explorando o efeito protetor da ligação da proteína de encontro à degradação. DARDOS não requer qualquer modificação química ou imobilização da pequena molécula²⁶. Isto permite que as moléculas pequenas sejam usadas para determinar seus alvos de ligação direta da proteína. Os critérios de avaliação padrão para o método clássico dos dardos incluem a mancha do gel, a espectrometria maciça e o western blotting^12,13<.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coquetel de inibidor de protease 100X	Sigma-Aldrich	P8340	Diluir para 20X com água ultrapura
Linha celular 293T	ATCC	CRL-3216	Meio DMEM com 10% de ácido
acético	Sigma-Aldrich	A6283
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23225
Cloreto	de cálcio Sigma-Aldrich	C1016
Raspador de células	Thermo Fisher	179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Solução de coloração	Bio-Rad	1610436
Dimetilsulfóxido(DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
GraphPad Prism	GraphPad Software	Versão 6.0	software de análise estatística e desenho
Ácido clorídrico	Sigma-Aldrich	H1758
ImageJ	National Institutes of Health	Versão 1.52	software de processamento e análise de imagem
M-PER Reagente de lise celular	Thermo Fisher	78501
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Corning	R21-040-CV
Pronase	Roche	PRON-RO	10 mg/ml
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S7653
Fluoreto de sódio	Sigma-Aldrich	S7920
Ortovanadato de sódio	Sigma-Aldrich	450243
Pirofosfato de sódio	Sigma-Aldrich	221368
Base Trizma	Sigma-Aldrich	T1503	ajusta para pH 8,0
β-glicerofosfato	Sigma-Aldrich	G9422

FBS