Artigo de método

Estudo funcional in vivo de variantes humanas raras associadas à doença usando Drosophila

DOI:

10.3791/59658

⸱

20 de agosto de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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O objetivo deste protocolo é delinear o desenho e o desempenho de experimentos in vivo em Drosophila melanogaster para avaliar as conseqüências funcionais de variantes genéticas raras associadas a doenças humanas.

Resumo

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Os avanços na tecnologia de sequenciamento tornaram os conjuntos de dados de todo o genoma e todo-exome mais acessíveis tanto para o diagnóstico clínico quanto para a pesquisa genética humana de ponta. Embora vários algoritmos de silico tenham sido desenvolvidos para prever a patogenicidade das variantes identificadas nesses conjuntos de dados, os estudos funcionais são fundamentais para determinar como as variantes genômica específicas afetam a função protéica, especialmente para o missense Variantes. Na rede de doenças não diagnosticadas (UDN) e outros consórcios de pesquisa de doenças raras, os organismos modelo (MO), incluindo a Drosophila, C. elegans, zebrafish e camundongos, são usados ativamente para avaliar a função da doença putativa humana-causando Variantes. Este protocolo descreve um método para a avaliação funcional de variações humanas raras usadas no núcleo da Drosophila do centro de seleção dos organismos modelo do UDN. O fluxo de trabalho começa com a coleta de informações humanas e de MO de vários bancos de dados públicos, usando o recurso da Web MARRVEL para avaliar se a variante é susceptível de contribuir para a condição de um paciente, bem como projetar experimentos eficazes com base em disponíveis conhecimento e recursos. Em seguida, são geradas ferramentas genéticas (por exemplo, linhas T2A-GAL4 e UAS-Human cDNA) para avaliar as funções de variantes de interesse na Drosophila. Em cima do desenvolvimento destes reagentes, os ensaios funcionais Two-pronged baseados em experimentos do salvamento e da superexpressão podem ser executados para avaliar a função variante. No ramo de resgate, os genes de mosca endógena são "humanizados" substituindo o gene da Drosophila ortologosa por transgenes humanos de referência ou variante. No ramo de superexpressão, as proteínas humanas de referência e variante são conduzidas exogenamente em uma variedade de tecidos. Em ambos os casos, todo o phenotype pontuáveis (por exemplo, letalidade, morfologia do olho, electrophysiology) pode ser usado como uma leitura-para fora, independentemente da doença do interesse. As diferenças observadas entre os alelos de referência e variantes sugerem um efeito variante-específico e, portanto, provável patogenicidade. Este protocolo permite avaliações rápidas, in vivo, de variantes de genes causadores de doenças humanas putativas com funções conhecidas e desconhecidas.

Introdução

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Pacientes com doenças raras muitas vezes passam por uma árdua jornada referida como a "Odisseia diagnóstica" para obter um diagnóstico preciso1. A maioria de doenças raras são pensados para ter uma origem genética forte, fazendo análises genéticas/genomic elementos críticos do workup clínico. Além do que o seqüenciamento do painel do gene do candidato e a análise da variação do número da cópia baseadas em Microarrays cromossomáticos, as tecnologias Whole-exome (WES) e do inteiro-genoma que sequenciam (WGS) tornaram-se ferramentas cada vez mais valiosas sobre a década passada2, a 3. Atualmente, a taxa diagnóstica para identificar uma variante patogênica conhecida em Wes e WGS é de ~ 25% (maior em casos pediátricos)4,5. Para a maioria de casos que permanecem undiagnosed após WES/WGS clínico, uma edição comum é que há muitos genes e variants do candidato. O sequenciamento da próxima geração geralmente identifica variantes novas ou ultramodernas em muitos genes, e interpretar se essas variantes contribuem para fenótipos de doença é desafiador. Por exemplo, embora a maioria de mutações do absurdo ou do Frameshift nos genes sejam pensadas para ser perda--função (LOF) alelos devido à deterioração absurdo-negociada da transcrição codificada, as mutações truncando encontradas nos últimos exons escapam este processo e podem funcionar como alelos benignos ou de ganho de função (GOF)6.

Além disso, prever os efeitos de um alelo missense é uma tarefa assustadora, uma vez que pode resultar em um número de diferentes cenários genéticos como descrito pela primeira vez por Herman Muller na década de 1930 (ou seja, amorfo, hipomorfo, hipermorfo, antimorfo, neomorfo, ou isomorph)7 . Numerosos em programas de silico e metodologias foram desenvolvidos para prever a patogenicidade de variantes missense com base na conservação evolutiva, tipo de mudança de aminoácidos, posição dentro de um domínio funcional, alelo freqüência na população geral, e outros parâmetros8. No entanto, esses programas não são uma solução abrangente para resolver o problema complicado de interpretação variante. Curiosamente, um estudo recente demonstrou que cinco algoritmos de predição de patogenicidade variante amplamente utilizados (PolyPhen9, Sift10, CADD11, provean12, provador de mutação) concordam com a patogenicidade ~ 80% do tempo8 . Notavelmente, mesmo quando todos os algoritmos concordam, eles retornam uma predição incorreta de patogenicidade até 11% do tempo. Isto conduz não somente à interpretação clínica defeituada mas igualmente pode dissuadir investigadores de seguir acima em variants novos falsamente alistando os como benignos. Uma forma de complementar a atual limitação da modelagem em silico é fornecer dados experimentais que demonstre o efeito da função variante in vitro, ex vivo (por exemplo, células cultivadas, organóides) ou in vivo.

Estudos funcionais in vivo de variantes associadas a doenças raras em MO têm pontos fortes únicos13 e foram adotados por muitas iniciativas de pesquisa de doenças raras em todo o mundo, incluindo a rede de doenças não diagnosticadas (UDN) nos Estados Unidos e Rare Modelos de doenças & mecanismos (RDMM) redes no Canadá, Japão, Europa e Austrália14. Além desses esforços coordenados para integrar pesquisadores de MO no fluxo de trabalho de diagnóstico de doenças raras e estudos mecanísticos em escala nacional, vários estudos colaborativos individuais entre pesquisadores clínicos e de MO levaram à descoberta e caracterização de muitos novos genes causadores de doenças humanas e variantes82,83,84.

Na UDN, um centro de triagem de organismos modelo centralizado (MOSC) recebe submissões de genes candidatos e variantes com uma descrição da condição do paciente e avalia se a variante é susceptível de ser patogênica usando ferramentas de informática e in vivo Experiências. Na fase I (2015-2018) da UDN, o MOSC é composto por um núcleo de Drosophila [Baylor College of Medicine (BCM)] e zebrafish Core (Universidade do Oregon) que trabalharam colaborativamente para avaliar os casos. Usando a análise informática e um número de estratégias experimentais diferentes na Drosophila e no zebrafish, o Mosc contribuiu até agora ao diagnóstico de 132 pacientes, identificação de 31 síndromes novas55, descoberta de diversos seres humanos novos genes da doença (por exemplo, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) e expansão fenotípica da doença conhecida genes (por exemplo, CACNA1A,21ACOX122).

Além de projetos dentro da UDN, os pesquisadores do núcleo de Drosophila da Mosc contribuíram para novas descobertas genéticas de doenças em colaboração com os centros de genômica mendeliana e outras iniciativas (por exemplo, ANKLE2,23, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, dnmbp29) usando o mesmo conjunto de informática e genética estratégias desenvolvidas para a UDN. Dado o significado de estudos do MO no diagnóstico raro da doença, o MOSC foi expandido para incluir um núcleo de C. elegans e o segundo núcleo de zebrafish (ambos na Universidade de Washington em St. Louis) para a fase II (2018-2022) do UDN.

Este manuscrito descreve um protocolo de estudo funcional in vivo que é usado ativamente no núcleo de Drosophila da UDN Mosc para determinar se as variantes de missense têm conseqüências funcionais sobre a proteína de interesse usando moscas transgênicas que expressam Proteínas. O objetivo deste protocolo é ajudar os pesquisadores de MO a trabalharem colaborativamente com grupos de pesquisa clínica para fornecer evidências experimentais de que uma variante candidata em um gene de interesse tem conseqüências funcionais, facilitando assim o diagnóstico clínico. Este protocolo é o mais útil em um Scenario em que um investigador da Drosophila é aproximado por um investigador clínico que tenha um paciente raro da doença com uma variação específica do candidato em um gene do interesse.

Este protocolo pode ser dividido em três elementos: (1) coletar informações para avaliar a probabilidade de a variante de interesse ser responsável pelo fenótipo do paciente e a viabilidade de um estudo funcional em Drosophila, (2) coleta instrumentos genéticos existentes e estabelecer novos, e (3) realizar estudos funcionais in vivo. O terceiro elemento pode ser subdividido em dois subelementos com base em como a função de uma variante de interesse pode ser avaliada (experimento de resgate ou estratégias baseadas em superexpressão). É importante notar que este protocolo pode ser adaptado e otimizado para muitos cenários fora da rara pesquisa de doença monogênica (por exemplo, doenças comuns, interações gene-ambiente e telas farmacológicas/genéticas para identificar alvos terapêuticos). A capacidade de determinar a funcionalidade e a patogenicidade das variantes não só beneficiará o paciente de interesse, fornecendo um diagnóstico molecular preciso, mas também terá impactos mais amplos na pesquisa científica translacional e básica.

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Protocolo

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1. coleta de informações humanas e MO para avaliar: probabilidade de uma variante de interesse ser responsável por fenótipos de doenças e viabilidade de estudos funcionais em Drosophila

  1. Realize pesquisas extensas de banco de dados e literatura para determinar se os genes e variantes de interesse específicos são bons candidatos para explicar o fenótipo do paciente de interesse. Especificamente, reúna as seguintes informações.
    1. Avalie se o gene do interesse estêve implicado previamente em outras desordens genéticas (expansão fenotípica do gene conhecido da doença) ou este é um gene inteiramente novo do candidato da doença [variação do gene do significado incerto (GVUS)].
    2. Avalie a freqüência do alelo da variação do interesse em bases de dados da doença ou da população do controle.
    3. Avalie se há variações do número de cópia (CNVs) que incluem este gene em bases de dados da população da doença ou do controle.
    4. Avalie o que os genes ortológicos estão em diferentes espécies de MO, incluindo mouse, zebrafish, Drosophila, C. elegans e levedura, em seguida, investigar as funções conhecidas e padrões de expressão desses genes ortológicos.
    5. Avaliar se a variante de interesse está presente em um domínio funcional da proteína e se o aminoácido de interesse é evolutivamente conservado.
      Nota: as respostas a estas cinco perguntas (etapas 1.1.1-1.1.5) podem ser obtidas acessando um número de bases de dados humanas e do mo individualmente ou usando o recurso de Web de Marrvel (recursos agregados do organismo modelo para a exploração rara da variação) (veja a tabela 1 para recursos on-line)30, que é descrita em profundidade em um artigo de acompanhamento31. Consulte a seção de resultados representativos para obter exemplos específicos. O site da iniciativa Monarch32 e Gene2Function33 também fornecem informações úteis.
  2. Reúna informações adicionais para avaliar se a variante é um bom candidato a uma doença de uma função de proteína e uma estrutura de ponto de vista.
    1. Avalie se a variante de interesse está prevista para ser prejudicial com base em algoritmos de predição de silico.
      Nota: os algoritmos Variant da patogenicidade foram desenvolvidos por muitos grupos de pesquisa sobre os anos passados de ~ 15, e alguns são indicados igualmente nos resultados da busca de marrvel. Programas mais recentes, incluindo os dois listados abaixo, combinam múltiplos algoritmos de redição de patogenicidade variante e abordagens de aprendizado de máquina para gerar um escore de patogenicidade. Para obter mais informações sobre os algoritmos de predição de variantes e seu desempenho, consulte Ghosh, et al.8. (i) CADD (depleção combinada de anotação-dependente): ferramenta de anotação Integrativa construída a partir de mais de 60 características genómicas, que fornece escores para SNVs humanos, bem como inserções curtas e deleções11. (II) revel (raro aprendiz de Ensemble variante exoma): combina múltiplos algoritmos de patogenicidade variante (mutpred, fathmm, Vest, PolyPhen, Sift, provean, mutationassessor, mutationtaster, LRT, gerp, siphy, phylop e phastcons) para fornecer uma pontuação integrada para todas as variantes missense humanas possíveis34.
    2. Determine se o gene humano/proteína de interesse ou seus ortologs de MO foram mostrados para interagir geneticamente ou fisicamente com genes/proteínas previamente ligadas a doenças genéticas. Em caso afirmativo, avalie se o paciente do interesse exibe os fenótipos de sobreposição com estas desordens.
      Nota: várias ferramentas foram desenvolvidas para analisar as interações genética e proteína-proteína baseadas em publicações de mo, bem como proteômica em grande escala de múltiplas espécies de telas. STRING (ferramenta de busca para ocorrências recorrentes de genes vizinhos)35: um banco de dados para interações proteína-proteína conhecidas e previstas. Ele integra conjuntos de dados de interação genética e coexpressão, bem como ferramentas de mineração de texto para identificar genes e proteínas que podem funcionar juntos em uma variedade de organismos. MIST (ferramenta de pesquisa de interação molecular)36: um banco de dados que integra dados de interação genética e proteína-proteína de núcleo genética mos (levedura, C. elegans, Drosophila, zebrafish, sapo, rato, rato) e os seres humanos. A predição de interações inferidas de genes/proteínas ortológicas (intertoras) também é exibida.
    3. Determine se a estrutura 3-D da proteína de interesse foi resolvida ou modelada. Em caso afirmativo, determine onde a variação do mapa de interesse relativo aos domínios funcionais chaves.
      Nota: as estruturas proteicas resolvidas por cristalografia de raios X, ressonância magnética nuclear (RMN) e microscopia crioeletrônica podem ser encontradas em bases de dados públicas, incluindo o APO (banco de dados proteico) e o EMDatabank37. Embora não exista um banco de dados único para estruturas proteicas previstas/modeladas, um número de algoritmos (ou seja, suíço-modelo38, modeller39e phyre240) estão disponíveis para os usuários realizarem a modelagem de proteínas.
  3. Comunicar-se com colaboradores clínicos para discutir informações recolhidas a partir das análises informáticas nas secções 1.1-1.2. Se os colaboradores clínicos também sentirem que a variante e o gene de interesse são bons candidatos para explicar os fenótipos observados no paciente, proceder à seção 2. Se houver perguntas específicas sobre o genótipo e o fenótipo do paciente, discuta-as com os colaboradores clínicos antes de avançar.
    Nota: se se sentir que a variante de interesse é improvável para explicar o fenótipo de interesse (por exemplo, variante idêntica encontrada em alta freqüência na população de controle), discutir isso com os colaboradores clínicos para determinar se a variante é uma boa candidato, pois pode não haver o conhecimento adequado para interpretar os fenótipos clínicos.

2. reunindo ferramentas genéticas existentes e estabelecendo novos reagentes para estudar uma variante específica de interesse

Nota: uma vez que a variante de interesse tem sido determinado um bom candidato a perseguir experimentalmente, recolher ou gerar reagentes para realizar in vivo estudos funcionais. Para os estudos funcionais descritos neste protocolo, alguns reagentes chave da Drosophila melanogaster são necessários: 1) estirpes transgênicas de cDNA de ativação a montante, que carregam a sequência de referência ou variante, 2) uma perda de função alelo de um gene da mosca do interesse, e 3) uma linha GAL4 que possa ser usada para experiências do salvamento.

  1. Geração de construções de cDNA UAS-humanas e moscas transgênicas
    1. Identifique e obtenha as construções humanas apropriadas do cDNA. Muitos clones estão disponíveis a partir do MGC (coleção genética de mamíferos)43 e podem ser comprados a partir de Venders selecionados. Para genes que são alternados Alternativamente, verifique qual cDNA isoforma corresponde ao uso de conjuntos ou RefSeq.
      Nota: muitos cDNAs estão disponíveis em reagentes compatíveis com o sistema de clonagem recombinase-negociados44, o que simplifica a etapa de subclonagem. cDNAs pode vir em um "aberto (sem parar Codon)" ou "fechado (com endógena ou artificial Stop Codon)" formato. Enquanto os clones abertos permitem a C' de proteínas que são úteis para ensaios bioquímicos (por exemplo, Western blot) e células biológicas (por exemplo, imunocoloração) para monitorar a expressão da proteína de interesse, ela pode interferir com a função protéica em alguns casos.
    2. Subclone o cDNA da referência e da variante no vetor transgênicas de Drosophila . Use o sistema de transgênese mediada por φC31, pois isso permite que os cDNAs de referência e variantes sejam integrados no mesmo local no genoma45. Para este projeto, o núcleo de Drosophila de Mosc usa rotineiramente o vetor de PGW-ha. attb46.
      Nota: se o cDNA humano estiver em vetores compatíveis com sistema de clonagem com mediação recombinase (por exemplo, PDONR221, pENTR221), pule para a seção 2.1.4, que explica as reações de LR para subclonar os cDNAs em PGW-ha. ATTB.
      1. Se o cDNA humano não está em um plasmídeo compatível com sistema de clonagem recombinase-negociado, leykemidov os cDNAs humanos em um vetor de entrada de gateway usando técnicas biológicas moleculares padrão (um exemplo de tal protocolo é documentado abaixo).
        1. Realize um PCR do saliência para introduzir attB1 e attB2 braços. O primer dianteiro deve ter a seqüência attB1 5 '-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACC-3 ' seguido pelos primeiros 22 nucleotídeos do cDNA alvo. O primer reverso deve ter a seqüência attB2 5 '-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA-3 ' seguido pelo complemento reverso dos últimos 25 nucleotídeos do cDNA de interesse. Exclua o Codon de parada do cDNA, em seguida, adicione um C ' tag se ele é desejado para "abrir" um clone, ou adicionar um Codon parar para "fechar" um clone.
        2. Prepare um 100 μL de mistura de PCR de alta fidelidade consistindo de 50 μL de mistura mestre de PCR de alta fidelidade, 36 μL de água destilada, 5 μL de cada primers para frente e verso listados na etapa 2.1.2.1.1 diluído para 10 μM e 4 μL de cDNA alvo (150 ng/μL).
        3. Execute o PCR usando o protocolo padrão da mutagenese para adicionar attB1 e AttB2 braços no cDNA do interesse. As condições variam de acordo com a construção e variantes de interesse.
        4. Isole o cDNA alvo com os braços adicionados da homologia através da electroforese do gel e da extração do gel. Criar 1% gel de agarose e realizar eletroforese usando métodos padrão. Extirpar a faixa que corresponde ao tamanho do cDNA mais o comprimento adicional dos braços da homologia. Extraia o DNA do gel através dos métodos padrão95. Kits de extração de gel comercial estão disponíveis em várias empresas.
        5. Realize uma reação de recombinase in vitro com base no protocolo de clonagem mediada por recombinase de acordo com o sistema que é usado.
        6. Transforme o mix de reação de BP em células de E. coli quimicamente competentes. As células competentes podem ser feitas em casa ou compradas de vendedores comerciais. Cultura as células transformadas durante a noite em uma placa LB contendo antibióticos apropriados para a seleção de colônia. No dia seguinte, selecione várias colônias e cresça-as em culturas líquidas independentes durante a noite.
        7. Isole o DNA das culturas durante a noite através da miniprep. Seqüência de Sanger os clones positivos para garantir que o cDNA tem a seqüência correta96. Manter as células das culturas que são positivas para a seqüência desejada em 25% glicerol armazenado em-80 ° c.
    3. Realize o mutagênese local-dirigido para introduzir a variação do interesse no plasmídeo da passagem com o cDNA humano da referência97. Um protocolo detalhado para este método pode ser encontrado no site do fornecedor48,49. Valide a presença da variante no plasmídeo mutado via sequenciação de Sanger de todo o quadro de leitura aberto (ORF) para garantir que não existam variantes adicionais introduzidas através desta etapa de mutagenese.
    4. Subclone os cDNAs humanos da referência e da variante no plasmídeo fornecedor (plasmídeos da passagem com attL1 e attL2 locais) no plasmídeo transgênicas (por exemplo, PGW-ha. ATTB com attR1 e attR2 locais) através de uma reação do clonase de LR.
      Nota: existem UAS φC31 vetores projetados para a restrição convencional baseado em enzima subclonagem (por exemplo, Puast. attb50) se for preferível Subclonar cDNAs humanos através de métodos enzimáticos de restrição.
    5. Selecione φC31 docking sites em que para integrar o UAS-Human cDNA transgenes. Um número de locais de encaixe foi gerado por diversos laboratórios e é publicamente disponível dos centros de estoque50,52,53.
      Nota: desde que é conveniente ter o transgene humano em um cromossoma que não contenha o ortólogo da mosca do gene do interesse, recomenda-se usar um segundo local de encaixe do cromossoma [VK37 (estoque de bdsc #24872] quando o ortólogo da mosca está no X , terceiro, ou quarto cromossomas, e use um terceiro local de encaixe do cromossoma [VK33 (estoque de bdsc #24871] quando o ortólogo da mosca está no segundo cromossoma.
    6. Injete construções de cDNA UAS-humanas em moscas expressando a integrase de φC31 em sua linha germinal (por exemplo, Vas-φC31, nos-φC31).
      Nota: a microinjeção pode ser realizada em casa ou enviada para instalações centrais ou entidades comerciais para a transgênese. O protocolo detalhado para gerar moscas transgênicas pode ser encontrado no capítulo do livro citado51.
    7. Estabeleça cepas transgênicas estáveis dos embriões injetados. Injetar ~ 100-200 embriões por construção94. Um esquema de cruzamento representativo para uma inserção do transgene em um segundo local de encaixe do cromossoma (VK37) é representado na Figura 1a. Refira os livros citados54,55 para a informação básica da genética da Drosophila .
  2. Obter ou gerar uma linha T2A-GAL4 que facilite ensaios funcionais baseados em resgate (ver Figura 2 e secção 3,1).
    Nota: esta linha servirá duas finalidades. Primeiramente, a maioria de linhas T2A-GAL4 testadas comportam-se como alelos fortes de LOF funcionando como um alelo da armadilha do gene. Segundo, as linhas T2A-GAL4 funcionam como um driver de GAL4 que permite a expressão de construções de UAS (por exemplo, UAS-GFP, cDNAs UAS-humanas) os elementos de regulação endógena do gene de juros56,57 (Figura 2a-C).
    1. Pesquise coleções de ações públicas para as linhas T2A-GAL4 disponíveis, incluindo o projeto de ruptura do gene da Drosophila (pib)58 em que as linhas ~ 1.000 T2A-GAL4 foram geradas59. Estas cepas estão atualmente disponíveis a partir do centro de ações de Bloomington Drosophila (bdsc) e são pesquisáveis através do PIB e bdsc websites.
    2. Se uma linha T2A-GAL4 para o gene da mosca do interesse não está disponível, verific se uma linha intronic codificando apropriada da codificação (gavetaMinos-negociada da integração) está disponível para a conversão em uma linha T2A-GAL4 usando a troca recombinase-negociada da gaveta (RMCE )60 (Figura 2A).
      Nota: RMCE permite elementos mímicos intrônicos que estão entre dois exons de codificação a serem convertidos em uma linha T2A-GAL4 através da microinjeção de uma construção de doadores (um exemplo de um esquema de cruzamento é mostrado na Figura 1B) ou série de Cruzes, conforme descrito em detalhe57,59.
    3. Se uma linha T2A-GAL4 não estiver disponível e um imitador intrônico de codificação apropriado não existir, explore a possibilidade de gerar uma linha T2A-GAL4 através do sistema CRIMIC (Cassette de integração mediada por CRISPR)59.
      Nota: esta metodologia usa clivagem de DNA mediada por crispr e reparação dirigida por homologia (HDR) para integrar uma fita imitadora em um intron de codificação em um gene de interesse.
    4. Se o gene do interesse faltar um intron grande (> 150 BP) ou não tem nenhum introns, tentativa de bater-em um transgene GAL4 no gene da mosca com o sistema de crispr/Cas9 usando o HDR como descrito20,61,62.
      Nota: se a geração de um alelo de Knock-in T2A-GAL4 ou GAL4 for difícil, tente realizar experimentos de resgate usando esses alelos pré-existentes ou linhas RNAi e drivers de GAL4 onipresentes ou específicos do tecido, conforme descrito92 (ref).

3. realizando análise funcional da variante humana de interesse in vivo na Drosophila

Nota: realize uma análise baseada em resgate (seção 3,1), bem como estudos de superexpressão (seção 3,2) usando as ferramentas coletadas ou geradas na seção 2 para avaliar as conseqüências da variante de interesse in vivo na Drosophila. Considere a utilização de ambas as abordagens, uma vez que os dois são complementares.

  1. Realizando análises funcionais através de experimentos baseados em resgate
    Nota: Experimentos heterologosos baseados em resgate emDrosophilausando proteínas humanas determinam se a função molecular dos dois genes ortológicos foram conservadas sobre ~ 500 milhões anos de evolução. Eles também avaliam a função da variante no contexto da proteína humana63. Embora não tenha sido relatada uma análise sistemática estudando centenas de pares de genes, várias dúzias de humanos e mamíferos (por exemplo, mouse) são capazes de substituir a função deDrosophilaGenes13.
    1. Na aproximação salvamento-baseada, determine primeiramente se há os fenótipos óbvios, scorable, e reprodutíveis em mutantes de LOF no ortolog da mosca antes de avaliar funções das variações.
      Nota: a literatura precedente no gene da mosca é um bom lugar à mina dos dados primeiramente, e pode ser encontrada usando as bases que incluem FlyBase e PubMed. Bancos de dados adicionais como MARRVEL, Monarch Initiative e Gene2Funcion também são úteis na coleta dessas informações.
    2. Realize uma pesquisa global de fenótipos pontuáveis em homozygous e hemizygous (T2A-GAL4 alelo sobre uma deficiência cromossomática definida molecularmente animais, especial se o alelo T2A-GAL4 é a primeira mutação a ser caracterizada para um gene específico. Avalie os fenótipos como letalidade, esterilidade, longevidade, morfológica (por exemplo, tamanho e morfologia do olho) e comportamento (por exemplo, corte, fuga, escalada e defeitos de sensibilidade do estrondo).
      Nota: se não houver fenótipos principais identificados a partir desta tela primária, fenótipos mais sutis, como defeitos neurológicos medidos por gravações eletrofisiológicas, podem ser usados se forem altamente reprodutíveis e específicos. Como exemplo, os estudos funcionais que utilizam o electrorretinograma (ERG) são descritos na etapa 3.2.3. Se houver falha na detecção de qualquer fenótipo pontuáveis, mova-se para a seção 3,2 e realize o estudo funcional baseado em superexpressão.
    3. Uma vez que um phenotype pontuáveis é identificado no mutante da mosca LOF, teste se o cDNA humano da referência pode substituir a função do ortólogo da mosca tentando usar o cDNA humano para resgatar a linha da mosca do mutante. O ensaio fenotípico a ser realizado aqui depende dos resultados da etapa 3.1.2 e será específico para o gene que está sendo estudado.
      Nota: se a "humanização" do gene Fly é bem sucedida, há agora uma plataforma para comparar a eficiência de resgate para a variante de interesse em comparação com a contraparte de referência. O salvamento visto com o cDNA humano da referência não tem que ser perfeito. O salvamento parcial do phenotype do mutante da mosca usando um cDNA humano ainda fornece um ponto de referência para executar estudos comparativos usando a tensão humana variante do cDNA.
    4. Usando o sistema do ensaio selecionado na etapa 3.1.2, compare o salvamento observado com o cDNA humano da referência ao salvamento observado com o cDNA variante do ser humano para determinar se a variação do interesse tem conseqüências no gene do interesse.
      Nota: se o cDNA variante humano executa pior do que o alelo de referência, isso sugere que a variante de interesse é deletéria para a função protéica. Se a variante e a referência não puderem ser distinguidas funcionalmente, então 1) o alelo pode ser um isomorph (uma variante que não afete a função proteica) ou 2) o ensaio não é suficientemente sensível para detectar diferenças sutis.
    5. Se a variante for encontrada como um alelo deletério, avalie ainda mais a expressão e a localização intracelular das proteínas de referência e variantes de interesse in vivo via Western blot, coloração por imunofluorescência ou outros métodos93.
      Nota: se o cDNA UAS-Human é gerado de um clone aberto em um vetor de PGW-ha. ATTB, use um anticorpo anti-ha para executar estes ensaios bioquímicos e celulares. Se o clone original é um clone fechado, teste se os anticorpos comerciais de encontro às proteínas humanas podem ser usados para estes ensaios. Uma diferença nos níveis de expressão e localização intracelular pode revelar como a variante de interesse afeta a função protéica.
  2. Realizando análises funcionais através de estudos de superexpressão
    Nota: a superexpressão Ubiquitous ou tecido-específica de cDNAs humanos em moscas do tipo Wild-Type pode fornecer a informação que é complementar às experiências salvamento-baseadas discutidas na seção 3,1. Enquanto os ensaios baseados em resgate são projetados principalmente para detectar variantes de LOF (amorphic, hipomófico), os ensaios baseados em superexpressão também podem revelar variantes de ganho de função (GOF) que são mais difíceis de avaliar (hipermórficas, antimórfica, neomórfica).
    1. Selecione um conjunto de drivers GAL4 para sobre-expressão os cDNAs humanos de interesse. Um número de motoristas onipresente e tecido-/Stage-specific GAL4 está disponível dos centros de estoque públicos (por exemplo, bdsc), alguns de que são usados mais freqüentemente do que outro. Primeiro foco em motoristas onipresentes e fenótipos facilmente pontuáveis (letalidade, esterilidade, fenótipos morfológicos), em seguida, passar para os condutores específicos do tecido e fenótipos mais específicos.
      Observação: valide a expressão de drivers GAL4 com uma linha de repórter (por exemplo, UAS-GFP) para confirmar os padrões de expressão antes de usar nos experimentos.
    2. Expresse os cDNAs humanos de referência e variantes usando o mesmo driver a mesma condição (por exemplo, temperatura) cruzando 3-5 fêmeas virgens da linha GAL4 (por exemplo, ey-GAL4 para expressão de disco imaginal do olho) com 3-5 moscas masculinas das linhas UAS [por exemplo, UAS-TBX2 (+) ou UAS-TBX2 (p. R305H) para o exemplo mostrado na secção 4,2] num único frasco para injetáveis.
      1. Transfira as cruzes cada 2-3 dias para ter muitos animais que eclosing de uma única Cruz.
    3. Examine a progêia e detecte quaisquer diferenças entre as cepas de referência e variante (por exemplo, morfologia ocular) um microscópio de dissecção. A imagem voa usando uma câmera unida a um microscópio da dissecção para documentar o phenotype.
      Nota: se um phenotype é visto somente na referência mas não na linha variante, a seguir a variação pode ser um alelo bloqueia ou um amorfos forte. Se o phenotype é visto em ambos os genótipos mas a referência causa um defeito mais forte, a seguir a variação pode ser um alelo bloqueia suave-à-fraco. Se a referência não mostra um phenotype ou exibe somente um phenotype fraco mas a variação mostra um defeito forte, a seguir a variação pode ser um alelo de GOF.
    4. Se um fenótipo não é visto em condições de cultura padrão (RT ou a 25 ° c, em seguida, definir as cruzes em diferentes temperaturas variando 18-29 ° c, uma vez que o sistema UAS/GAL4 é conhecido por ser sensível à temperatura64,65). Normalmente, a expressão de transgenes UAS é maior em temperaturas mais elevadas.
  3. Realizar estudos funcionais adicionais relacionados com os genes e proteínas de interesse.
    Nota: Além do que examinar defeitos gerais, um sistema do ensaio pode ser selecionado para sondar em funções moleculars do gene e da variação. Em um exemplo discutido nos resultados representativos (TBX2caso), as gravações do ERG foram usadas para determinar efeitos da variação na função do fotorreceptor, desde que o gene da mosca do interesse (bifid) foram estudados extensivamente no contexto do desenvolvimento do sistema visual. Protocolos detalhados para o ERG emDrosophilapode ser encontrado como publicado anteriormente66,67,68.
    1. Gere moscas para testar defeitos funcionais no sistema visual. Cruze fêmeas virgens da linha rhodopsin 1 (Rh1)-GAL4 para machos com transgenes de referência ou variante de cDNA UAS-Human para expressar as proteínas humanas de interesse nos fotorreceptores R1-R6.
      Nota: Cross 3-5 Virgin fêmeas para 3-5 macho voa em um único frasco e transferir as cruzes a cada 2-3 dias para ter muitos animais eclosing de uma única Cruz. Todas as cruzes devem ser mantidas em uma incubadora ajustada na temperatura experimental para obter resultados consistentes.
    2. Uma vez que as moscas começam a Eclose (a 25 ° c, ~ 10 dias após a definição da Cruz inicial), reúna a progêia (Rh1-GAL4/+; UAS-Human cDNA/+) em frascos frescos e colocá-los de volta para a incubadora definido na temperatura experimental para um adicional de 3 dias para o sistema visual para amadurecer.
      Nota: embora o ERG possa ser executado em 1-2 moscas velhas do dia, as moscas recentemente pupários podem ter grandes flutuações em seu sinal do ERG. Se for desejado examinar um fenótipo dependente da idade, essas moscas podem ser envelhecidas por várias semanas, desde que sejam regularmente (por exemplo, a cada ~ 5 dias) transferidas para um novo frasco para evitar o afogamento em alimentos molhados.
    3. Prepare as moscas para a gravação de ERG, primeiro anestesiando as moscas usando CO2 ou colocando-os em um frasco no gelo. Cole delicadamente um lado da mosca em uma corrediça de vidro do microscópio para imobilizá-los.
      Nota: as moscas múltiplas da referência e da variação podem ser coladas sobre a um único slide. Coloque todas as moscas em aproximadamente a mesma orientação com um olho sendo acessível para o eletrodo de gravação. Tenha cuidado para não obter cola no olho e deixar o Proboscis livre.
    4. Prepare os eletrodos de gravação e referência. Coloc um capilar de vidro de 1,2 milímetros em um extrator da agulha e ative-o. Quebre o tubo capilar para obter dois eletrodos cônicos afiados. Os eletrodos resultantes devem ser ocos e ter diâmetros finais de < 0,5 mm.
    5. Encha os capilares com solução salina (100 mM NaCl), certificando-se de que não há bolhas de ar. Deslize os capilares de vidro sobre os eletrodos de fio de prata (tanto o eletrodo de gravação e eletrodo de referência, ver Figura 4) e fixar os capilares no lugar.
    6. Configure o estimulador e o amplificador. Um set-up detalhado pode ser encontrado em Lauwers, et al.67. A UDN Drosophila Mosc set-up consiste em equipamentos listados na seção de materiais.
      1. Defina o amplificador para 0,1 Hz Filtro passa-alta, 300 Hz Filtro passa-baixa, e 100 ganho.
      2. Defina o estimulador para 1 s período, 500 MS largura de pulso, 500 MS pulso atraso, modo de execução, e 7 amp.
      3. Prepare a fonte luminosa para a fotoestimulação. Use uma fonte luminosa do halogênio para ativar os photoreceptors da mosca.
      4. Prepare o software de gravação em um computador conectado à set-up do ERG. Crie um protocolo de estimulação com o modelo de aquisição "eventos de comprimento fixo" e duração de 20 s.
    7. ACCLIMATE as moscas para completar a escuridão antes de iniciar gravações ERG. Coloque as moscas em escuridão completa por pelo menos 10 min antes de iniciar o experimento.
      Nota: uma vez que as moscas não conseguem detectar luz vermelha, use uma fonte de luz vermelha durante o período de habituação escura.
    8. Coloque o slide contendo as moscas no aparelho de gravação e mova os Micromanipuladores carregando os eletrodos de referência e de gravação para um ponto próximo à mosca de interesse no slide. Observe a ponta do eletrodo e coloque cuidadosamente o eletrodo de referência no tórax da mosca (penetre a cutícula). Uma vez que o eletrodo de referência está estavelmente inserido, coloque o eletrodo de gravação na superfície do olho.
      Nota: a posição exata deste eletrodo de referência não tem um impacto importante no sinal ERG. O eletrodo de gravação deve ser colocado na superfície do olho, uma vez que o ERG é uma gravação em potencial de campo, em vez de uma gravação intracelular. A quantidade adequada de pressão aplicada ao eletrodo de gravação provoca uma pequena ondulação sem penetrar no olho.
    9. Desligue todas as luzes por mais 3 min para aclifazer as moscas para o ambiente escuro.
    10. Configurar o software de gravação e iniciar a gravação do sinal. Se usar uma fonte luminosa do halogênio com obturador manual, gire sobre a fonte luminosa com o obturador fechado. Comece a gravar o sinal.
    11. Expor os olhos da mosca à luz abrindo e fechando o obturador cada 1 s para a duração de 20 s de uma única corrida.
      Nota: o on/off da fonte luminosa do halogênio pode ser controlado manualmente ou programado para tornar-se automatizado usando uma fonte luminosa branca do diodo emissor de luz. O ERG mais robusto e de confiança pode ser obtido usando uma fonte luminosa do halogênio comparada a um diodo emissor de luz branco, provável devido ao espectro claro mais largo emitido da fonte luminosa do halogênio.
    12. Registre ERGs de todas as moscas que são montadas na corrediça de vidro. Realize ERGs a partir de 15 moscas por genótipo por condição.
      Nota: alguns parâmetros que podem ser alterados para encontrar uma condição que mostra diferenças robustas entre os cDNAs de referência e variantes podem incluir temperatura, idade ou condições ambientais (por exemplo, criados em ciclo claro-escuro ou luz/escuridão constante).
    13. Executar a análise de dados: Compare os ERGs da referência, variante e controles para determinar se há diferenças. Avalie os dados do ERG para mudanças em transientes, depolorization, off-Transients, e repolarização69 (Figura 4B).
      Nota: a despolarização e a repolarização refletem a ativação e a inativação da cascata de fototransdução dentro dos FOTORRECEPTORES, enquanto que em-e off-transientes são medidas das atividades das células pós-sinápticas que recebem sinais de os fotorreceptores. A diminuição da amplitude e a cinética alterada de repolarização estão frequentemente associadas a defeitos com a função e a saúde do fotorreceptor, enquanto os defeitos em e fora-transientes são encontrados em mutantes com defeito no desenvolvimento, função ou manutenção da sinapse 70.
    14. Em cima da identificação das diferenças em fenótipos do ERG com superexpressão da referência contra cDNAs humanos variantes, determine se este phenotype eletrofisiológicos é associado com os defeitos estruturais e ultrastructural nos fotorreceptores e em seus sinapses realizando análise histológica e microscopia eletrônica de transmissão.
      Nota: uma discussão mais adicional na interpretação de defeitos do ERG e da análise estrutural/ultrastructural foi descrita previamente69.

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Resultados

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Estudo funcional de de novo variante missense em EBF3 ligado a fenótipos de neurodesenvolvimento
Em um macho dos anos de idade 7 com os fenótipos do neurodesenvolvimento que incluem a hipotonia, a ataxia, o atraso desenvolvente global, e a desordem de discurso expressivo, os médicos e os geneticistas humanos nos institutos nacionais da saúde projeto das doenças undiagnosed (UDP) identificou uma variante de missense de novo (p. R163Q) em EBF3 (Early b-Cell factor 3)

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Discussão

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Estudos experimentais utilizando Drosophila melanogaster proporcionam um sistema de ensaio robusto para avaliar as consequências das variantes humanas associadas à doença. Isto é devido ao grande corpo do conhecimento e das ferramentas genéticas diversas que foram geradas por muitos investigadores no campo da mosca sobre o século passado89. Assim como qualquer outro sistema experimental, no entanto, é importante reconhecer as advertências e limitações que existem.

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Agradecemos a José Salazar, Julia Wang e a Dra Karen Schulze pela leitura crítica do manuscrito. Reconhecemos os Drs. Ning Liu e XI Luo para a caracterização funcional das variantes TBX2 discutidas aqui. O centro de triagem de organismos do modelo de rede de doenças não diagnosticadas foi apoiado pelo fundo comum dos institutos nacionais de saúde (NIH) (U54 NS093793). H. T. C. foi apoiado ainda pelo NIH [CNCDP-K12 e NINDS (1K12 NS098482)], Academy americano do Neurology (concessão da pesquisa do Neuroscience), fundo do Wellcome de Burroughs (concessão da carreira para cientistas médicos), sociedade da neurologia da criança e Fundação da neurologia da criança ( PERF Elterman), e o prêmio de independência antecipada do diretor da NIH (DP5 OD026426). M. F. W. foi apoiado pela Simons Foundation (SFARI Award: 368479). S. Y. foi apoiado pela NIH (R01 DC014932), a Fundação Simons (SFARI Award: 368479), a associação de Alzheimer (novo investigador Research Grant: 15-364099), naman família fundo para a investigação básica, e Caroline Wiess lei fundo para a investigação em Medicina molecular. A microscopia confocal em BCM é apoiada na parte por NIH Grant U54HD083092 ao núcleo do Neurovisualization do centro de pesquisa das inabilidades intelectuais e desenvolventes (IDDRC).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Drosophila Estoques para transgênese de cDNA humano UAS
Cepas de injeção para transgênese (D. melanogaster)BDSC#24871Reagente específico: VK33 (3º cromossomo) Linha de injeção
Cepas de injeção para transgênese (D. melanogaster)BDSC#24872Reagente específico: VK37 (2º cromossomo) Linha de injeção
DNA plasmidial
Vetor de clonagemThermo Fisher#12536-017Reagente específico: pDONR221
Drosophila vetor de transgênesePresente dos Drs. Johannes Bischof e Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS)Reagente específico: pGW-HA.attB
Kits e reagentes de biologia molecular
AgaroseSigma-Aldrich#A2790Reagente específico: Agarose (grau de biologia molecular)
Células quimicamente competentes (E. coli)Thermo Fisher#18265017Reagente específico: DH5&alfa;
Kit de extração de gel de DNAThermo Fisher#K210012Reagente específico: Kit de extração de gel PureLink
Kit de isolamento e purificação de DNAQiagen#27104Reagente específico: Kit de minipreparação de spin QIAprep
Polimerase de alta fidelidadeNEB#M0491Reagente específico: Kit de polimerase Q5
Sistema de clonagem mediado por recombinaseThermo Fisher#11789020Reagente específico: Kit de clonase Gateway BP
de clonagem mediado por recombinaseThermo Fisher#11791100Reagente específico: Kit enzimático Gateway LR Clonase II
Kit de mutagênese dirigida ao localAgilent#200523Reagente específico: Kit de mutagênese Quick Change
IIEquipamento relacionado ao equipamento de eletrorretinograma
ERG AnalysisMolecular Devices/AReagente Específico: Axon pCLAMP 10 Pacote de Software de Dados
ERG Coleta de DadosLabX#R150358Reagente Específico: Amplificador Biológico Isolado ISO-DAM
Estimulador ERGAstro-Med#S48Reagente Específico: Estimulador de Pulso Quadrado
Sistema N

Referências

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