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Artigo de método

Isolamento e cultura de células endoteliais aórticas primárias de suínos em miniatura

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DOI:

10.3791/59673

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14 de agosto de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 2Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen University School of Medicine, 3Department of Medical Laboratory, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 4Department of Endocrinology, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 5Xenotransplantation Program, Department of Surgery, University of Alabama at Birmingham, 6People's Hospital of Longhua

Neste artigo

Resumo

Um método enzimático eficaz para o isolamento de células endoteliais aórticas primárias porcinas (pAECs) de suínos em miniatura é descrito. Os pAECs preliminares isolados podem ser usados para investigar a resposta imune e da coagulação no xenotransplante.

Resumo

Xenotransplante é uma maneira promissora para resolver a escassez de órgãos humanos para pacientes com insuficiência de órgãos em estágio final, e o porco é considerado como uma fonte de órgão adequada. A rejeição imune e a coagulação são dois obstáculos principais para o sucesso do xenotransplante. A lesão e a disfunção da célula endotelial vascular (EC) são importantes para o desenvolvimento das respostas de inflamação e coagulação no xenotransplante. Assim, o isolamento de células endoteliais aórticas porcinas (pAECs) é necessário para investigar as respostas de rejeição imune e coagulação. Aqui, desenvolvemos uma abordagem enzimática simples para o isolamento, caracterização e expansão de pAECs altamente purificados de suínos em miniatura. Primeiramente, o porco diminuto foi anestesiado com cetamina, e um comprimento da aorta foi extirpado. Em segundo lugar, a superfície endotelial da aorta foi exposta a 0, 5% de solução digestiva de colagenase IV por 15 min. terceiro, a superfície endotelial da aorta foi raspada em apenas uma direção com raspador de células (< 10 vezes), e não foi comprimida durante o processo de Raspagem. Finalmente, os paecs isolados do dia 3, e após a passagem 1 e a passagem 2, foram identificados pelo fluxo citometria com um anticorpo CD31. As porcentagens de células CD31-positivas foram 97,4% ± 1,2%, 94,4% ± 1,1% e 92,4% ± 1,7% (média ± DP), respectivamente. A concentração de Collagenase IV, o tempo digestivo, o sentido, e a freqüência e a intensidade da raspagem são críticas para diminuir a contaminação do fibroblasto e obter a elevado-pureza e um grande número ECs. Em conclusão, nosso método enzimático é um método altamente effctive para isolar ECs da aorta diminuta do porco, e as pilhas podem ser expandidas in vitro para investigar as respostas imunes e da coagulação no xenotransplante.

Introdução

A escassez de órgãos disponíveis para a transplantação é um problema proeminente World-Wide1. De acordo com a Cruz Vermelha da sociedade de China, somente um número pequeno de pacientes com falha de órgão da fase final recebeu um órgão apropriado em China em 2018.

O xenotransplante é uma forma promissora de resolver o problema da escassez de órgãos. Os órgãos do porco são considerados ser os órgãos os mais apropriados para seres humanos por causa das similaridades anatômicas e fisiológico2,3. A falha de um xenograft do porco é relacionada pela maior parte às respostas imunes da rejeição e da coagulação do primata. As células endoteliais porcinas (ECS) são críticas, uma vez que essas células são as primeiras a interagir com o sistema imunológico do primata, que inclui anticorpos, complemento, citocinas e células imunes (por exemplo, células T, células B e macrófagos)4,5. A porcina ECS desempenha um papel vital no órgão de suínos e no Islet xenotransplante6,7. Assim, os ECs são células importantes para investigar as respostas de rejeição e coagulação a um enxerto de porco. A isolação de ECS suínos de alta qualidade é exigida para a pesquisa do xenotransplante.

Em tentativas de isolar ECS de diferentes órgãos (por exemplo, coração, rim, fígado e aorta), vários protocolos têm sido relatados em uma configuração de xenotransplante8,9,10,11,12. Entretanto, manter uma cultura ultrapura de ECs isolado é um problema proeminente em protocolos padrão. O aumento da concentração da solução digerida, o tempo de digestão inadequado e a intensidade de raspagem podem contribuir para o aumento da contaminação do fibroblastos nos estudos atuais8,10,13. Além disso, o método de pAECs isolados de suínos em miniatura é menos estudado. Aqui, nós descrevemos um método enzimático otimizado para isolar pAECs altamente purificados de suínos em miniatura (Wuzhishan ou Bama). Várias etapas do protocolo foram projetadas para reduzir a contaminação de fibroblastos e obter ECs de alta pureza.

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Protocolo

O uso de animais foi aprovado pelo Comitê de ética de revisão do hospital do segundo povo de Shenzhen, de acordo com os princípios do bem-estar animal.

1. preparação de animais, médios e buffers

  1. Prepare o porco em miniatura.
    Nota: todos os porcos em miniatura foram chineses Wuzhishan ou Bama porcos (masculino). A idade e o peso dos suínos foram de 100 dias ± 8 dias e 5,7 kg ± 1,0 kg (média ± DP, n = 3), respectivamente.
  2. Prepare o meio de cultura: meio de células endoteliais (ECM) suplementado com 10% (v/v) de soro bovino fetal inativado por calor (FBS), 1% (v/v) penicilina/estreptomicina (P/S) e 1% (v/v) suplemento de crescimento de células endoteliais (ECGS).
  3. Prepare o tampão de lavagem: solução de 1X PBS (pH 7,4) com 1% (v/v) P/S.
  4. Prepare uma solução digestiva de colagenase 0, 5% IV: 1 mg de pó de colagenase IV em 20 ml de solução de PBS. Pré-aqueça a solução digestiva do colagenase em 37 ° c antes da digestão.
  5. Prepare o tampão de parada: o meio modificado da águia de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% calor-inactivated FBS e 1% P/S.

2. cirurgia e preparo para isolamento da célula endotelial aórtica porcina

  1. Desinfecção da sala de operação com luz UV para 1 h e desinfetante médico 84 líquido (o teor de cloro disponível é 4,0%-5,0%, tabela de materiais) antes de realizar a cirurgia.
  2. Após o suíno em miniatura ter recebido uma injecção intramuscular formada por 15 mg/kg de cetamina, 15 mg/kg de cloridrato de Xylazina e 0, 5 mg/kg de cloridrato de fenacetina (volumes: 100μL/kg, tabela de materiais) (Figura 1a), confirme a Estado de anestesia com a verificação de estímulo doloroso porcino (por exemplo, beliscando uma orelha ou agitando um forelimb) e índice fisiológico (por exemplo, pressão arterial, coração e frequência respiratória).
    Nota: outra meia dose de injecção pode ser administrada ao porco se mostrar os sinais de acordar.
  3. Cortar o abdômen com um bisturi, expor a veia cava inferior e, consequentemente, injetar heparina sódica (5.000 U, tabela de materiais) na veia cava inferior com seringa de 5 ml.
  4. Cinco minutos depois, insira um cateter na aorta abdominal com sangue, corte a pele do tórax e incise o diafragma com um bisturi e, subsequentemente, corte o ventrículo esquerdo.
    Nota: Certifique-se de que o porco é eutanasiado verificando o pulso aórtico após o sangue e cortando o coração.
  5. Exponha as costelas com fórceps ósseo (tabela de materiais), e expor o coração e os pulmões. Encontre a aorta posterior para o coração e os pulmões e prenda as duas extremidades. Lave a aorta uma vez com tampão de lavagem pré-arrefecido (Figura 1B, C).
  6. Corte a aorta com tesoura e mantenha a aorta presa em cada extremidade. Excesso de tecido de consumo em torno da aorta com fórceps estéril e tesoura. Coloque a aorta em um tubo de centrífuga de 50 mL, lave a aorta com tampão de lavagem pré-arrefecido 3x (30 mL por lavagem) e transfira a aorta para o laboratório (Figura 1D).

3. isolamento de células endoteliais aórticas porcinas

  1. Em condições assépticas, retire a aorta do porco do tampão de lavagem e coloque-a em uma placa de Petri de 150 mm (Figura 2a).
  2. Cortar suavemente as duas extremidades da aorta e o excesso de tecido de consumo em torno da aorta com fórceps estéril e tesouras novamente (Figura 2b). Lave o exterior e o interior da aorta (sobre o prato de cultura à temperatura ambiente) com 20 − 50 mL de tampão de lavagem.
    Nota: tentar cortar apenas a área onde os grampos foram colocados durante a cirurgia, uma vez que alguns ECs foram danificados nesta área, e remover o excesso de tecidos e ramos laterais arteriais.
  3. Passar uma sutura cirúrgica através da aorta e, em seguida, amarrar uma extremidade da aorta usando a sutura cirúrgica (5-0, 90cm, tabela de materiais). Manter a sutura cirúrgica no interior da aorta (Figura 2C,D).
  4. Fixar suavemente a aorta perto da extremidade amarrada com fórceps e, em seguida, puxar a sutura cirúrgica lentamente para reverter a aorta até que a superfície endotelial da aorta seja exposta (Figura 2E-G).
    Nota: Assegure-se de fixar a aorta perto da extremidade amarrada e não fixar a aorta firmemente, ou então a aorta não pode ser revertida puxando a sutura cirúrgica.
  5. Lave a superfície endotelial da aorta com tampão de lavagem 3x (10 mL por lavagem) e, em seguida, descarte esta solução. Coloque a aorta em um tubo de centrífuga de 15 ml e cubra a aorta com 10 ml de solução digestiva de colagenase IV a 0, 5% no tubo (Figura 2h).
    Nota: pré-aqueça a solução digestiva colagenase 0, 5% IV a 37 ° c antes da digestão.
  6. Incubar a 37 ° c durante 15 min. Coloque a aorta digerida e a solução digestiva em um prato de cultura de 100 mm e interrompa os efeitos de 0, 5% de colagenase IV adicionando 10 − 15 ml de tampão de parada pré-arrefecido.
    Nota: o tempo de digestão recomendado é entre 10 e 20 minutos. Certifique-se de que a superfície endotelial da aorta esteja coberta pelo tampão de parada.
  7. Raspe suavemente os pAECs da superfície interna da aorta usando um raspador de células (Figura 2I). Lave a aorta raspada 3x com tampão de lavagem (5 mL por tempo). Põr a solução do prato da cultura em um tubo de centrifugação de 50 mL. Lave a parte inferior do prato de cultura 2x com tampão de lavagem (5 mL por o tempo), e põr a solução em um tubo de centrifugação de 50 mL outra vez.
    Nota: raspe em uma direção suavemente e não comprima. Não toque no tecido perto das bordas e furos. A raspagem 5 − 8x é recomendada.
  8. Centrifugue o tubo a 600 x g durante 6 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante e deixe 10 mL de solução na parte inferior de um tubo de centrífuga de 50 mL. Adicione 20 mL de tampão de lavagem ao tubo de centrífuga de 50 mL e resuma os pellets. Evite bolhas durante esta etapa.
  9. Centrifugador a 600 x g durante 6 min a 4 ° c. Elimine lentamente o sobrenadante. Resuspend as pelotas da pilha com 1 mL do meio de cultura e misture bem.
    Nota: o número médio obtido de ECs por cm de aorta é de 1,9 x 105 ± 1,4 x 104 (média ± DP, n = 3).
  10. Conte as células com um contador de células. Placa e cultura as células em uma embarcação sem revestimento de quaisquer materiais de acordo com o número da célula. Se o número da célula for menor ou igual a 1,0 x 106, células de cultura em um balão de 25 cm2 . Se o número da célula for maior que 1,0 x 106, células de cultura em vários frascos de 25 cm2 (1,0 x 106 células por balão). Coloque o balão numa incubadora (sem agitação) a 37 ° c com 5% de CO2 e substitua o meio a cada 2 − 3 dias.
    Nota: algumas células são danificadas pelo raspador de células. Um ensaio de viabilidade celular encontrou o percentual de células ao vivo para 95,7% ± 1,7% (média ± DP, n = 3). O tempo de duplicação das células isoladas é de cerca de 1 − 2 dias.

4. colheita e caracterização de células endoteliais puras

  1. Deixe as células crescerem por cerca de 4 − 5 dias. Quando as células atingem 80% confluência (Figura 3a), digerir as células com 0,25% tripsina e passagem das células. Em seguida, recolher algumas das células isoladas (dia 3, passagem 1 e passagem 2) e identificar por citometria de fluxo (com um anticorpo CD31).
  2. Rótulo isolado de pAECs (número de células: 1 x 105) (dia 3, passagem 1 e passagem 2) com anticorpo conjugado CD31-Fluorescein antiporcina (FITC) (10 μL de anticorpo para células por 100 μl, corados por 30 min a 4 ° c) para análise de citometria de fluxo.
  3. População total da pilha viva da porta com uma parcela dispersada para diante, amostra unmanchado como um controle negativo. Em seguida, apresente as células CD31 positivas das células fechadas com histograma.
    Nota: a eficácia das células CD31-positivas é 97,4% ± 1,2% (dia 3), 94,4% ± 1,1% (P1) e 92,4% ± 1,7% (P2) (média ± DP), respectivamente (Figura 3B).

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Resultados

Nosso método visa fornecer uma maneira eficaz de isolar ECs altamente purificados das aortas de suínos em miniatura. O processo de cirurgia da aorta é mostrado na Figura 1. O primeiro passo é que toda a aorta é extirpada do porco. Prevenir outra célula ou contaminação bacteriana é muito importante. Assim, não ferir outros órgãos ou tecidos no caso de células não segmentadas ou bactérias contaminar a aorta, e lavar a aorta com tampão de lavagem pré-arrefecido 3x (Figura 1...

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Discussão

As células endoteliais são comumente utilizadas na pesquisa de disfunção vascular, diabetes, regeneração tecidual, transplante e cânceres14,15,16,17,18. Para compreender e caracterizar a biologia e a função de ECS nestas doenças, os métodos numerosos para isolar o ECS de órgãos ou de tecidos doentes diferentes foram relatados8,

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

O trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação de ciências naturais da província de Guangdong, concessão/número do prêmio: 2016A030313028; Fundação médica da pesquisa científica da província de Guangdong, concessão/número da concessão: B2018003; Fundação de Shenzhen da ciência e da tecnologia, concessão/número da concessão: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 e JCYJ20160428142040945; Fundação do distrito de Shenzhen Longhua da ciência e da tecnologia, concessão/número da concessão: 2017013; Programa nacional da chave R & D de China, concessão/número da concessão: 2017YFC1103704; Sanming projeto de medicina em Shenzhen, Grant/Award Number: SZSM201412020; Fundos especiais para a construção de hospitais de alto nível na província de Guangdong (2019); Fundo para a construção da disciplina médica de nível elevado de Shenzhen, concessão/número da concessão: 2016031638; Shenzhen Fundação de saúde e planejamento familiar Comissão, Grant/Award Number: SZXJ2017021 e SZXJ2018059. Agradecemos a Hancheng Zhang e Zhicheng Zou da Universidade de Shenzhen por ajudar na preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BD FACSAria IIBD Bioscience
BoneforcepsPequim HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. ChinaHL-YGQ   
Seringa Descartável BOON (10ml)Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China
CD31-FITC anticorpoBio-RadMCA1746F
Raspador de célulasCorning 3010#
Collagenase IVSigma-AldrichC5138#-1G
Composto de injeção de cetamina Fábrica farmacêutica veterinária de Shenyang, ChinaCloridrato de cetamina? 0,3 g / 2 ml, cloridrato de xilazina: 0,3 g / 2 ml, cloridrato de fenacetina? 1 mg / 2 ml
DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-fenilidol, dicloridrato)Life TechnologiesD1306 #
DMEMLife Technologies11965118 #
ECMSciencell1001 #
ECGSSciencell1052#
Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) AXYGENMCT-150-C#
Falcon 100mm Placa de Cultura de CélulasCorning353003#
Fetal Soro BovinoGIBCO10270-106#
Flowjo v10.0
Fórceps Xangai instrumentos médicos Co., Ltd. China
Heparina sódicaJiangsu WanBang biofarmacêutica Co., Ltd. China
tintura de iodoGuilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd. China
Porco em miniatura (Bama ou Wuzhishan)Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China
microscópio Mshot Fornecedor verificado - Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd.M152
Placas de Petri (150 x 15 mm)Biologixgroup66-1515#
Penicilina/EstreptomicinaLife Technologies15070063#
Frasco de Cultura de Células de Pescoço Inclinado Retangular com Tampa de Ventilação? T25?Corning 3289#
TesouraShangHai medical instruments Co.,Ltd.China
Pipetas de Transferência Sorológica (10ml)JET BiofilGSP010010# 
Pipeta Pasteur EstérilGeneBrickGY0025#
Filtro de Seringa Estéril (0.22µ m)MilliporeSLGV033RS #
bisturi cirúrgicoXangai instrumentos médicos Co., Ltd.China22 #
sutura cirúrgicaXangai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd5-0 #
Seringa?Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenolGIBCO25200056 #
75% Álcool médicoGuilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd.China
20 x solução PBS (pH 7,4, livre de nuclease)Sangon BiotechB540627 #
Desinfetante médico 84 líquidoProvíncia de Sichuan Yijieshi Medical Technology Co., Ltd450ml/bottle

Referências

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