Uso da microscopia de força atômica para medir propriedades mecânicas e pressão de turgor de células vegetais e tecidos vegetais

Resumo

Aqui, nós apresentamos a microscopia de força atômica (AFM), operada como uma ferramenta do nano-e do micro-Indentation em pilhas e em tecidos. O instrumento permite a aquisição simultânea de topografia de superfície 3D da amostra e suas propriedades mecânicas, incluindo a parede celular módulo de Young, bem como a pressão de turgor.

Resumo

Apresentamos aqui o uso da microscopia de força atômica para recuar os tecidos vegetais e recuperar suas propriedades mecânicas. Usando dois microscópios diferentes no modo de recuo, mostramos como medir um módulo elástico e usá-lo para avaliar as propriedades mecânicas da parede celular. Além disso, também explicamos como avaliar a pressão de turgor. As principais vantagens da microscopia de força atômica são que ele é não-invasivo, relativamente rápido (5 ~ 20 min), e que virtualmente qualquer tipo de tecido vegetal que é superficialmente plana pode ser analisado sem a necessidade de tratamento. A resolução pode ser muito boa, dependendo do tamanho da ponta e do número de medições por unidade de área. Uma limitação deste método é que dá somente o acesso direto à camada superficial da pilha.

Introdução

A microscopia da força atômica (AFM) pertence à família da microscopia da sonda da exploração (SPM), onde uma ponta com um raio de geralmente alguns nanômetros examina a superfície de uma amostra. A detecção de uma superfície não é alcançada através de métodos ópticos ou baseados em elétrons, mas através das forças de interação entre a ponta e a superfície da amostra. Assim, esta técnica não se limita à caracterização topográfica de uma superfície amostral (resolução 3D que pode descer para poucos nanômetros), mas também permite a medição de qualquer tipo de força de interação, como eletrostática, Van der Waals ou forças de contato. Além disso, a ponta pode ser usada ....

Protocolo

1. Measure de propriedades mecânicas da parede de pilha

Nota: O exemplo do gineceu tornando-se de Arabidopsis é apresentado.

1. Preparação das amostras biológicas
   1. Colete um botão de flor fechado no estágio 9 a 10 (aproximadamente 0,5 milímetros de comprimento) de acordo com a determinação publicada dos estágios para Arabidopsis⁴. um binocular, usando pinças finas, cuidadosamente abrir o botão para verificar o estágio de desenvolvimento e recolher o gineceu localizado no centro da flor.
   2. Põr o gineceu na fita lateral dobro coloc no centro da tampa d....

Resultados

Figura 1a e Figura 1b mostram uma captura de tela ilustrando o resultado das etapas 1.3.4 a 1.3.6 do protocolo, usado para localizar uma região de interesse onde adquirir o mapa de QI. Vale ressaltar que a região de interesse foi escolhida para não estar em uma superfície inclinada (ou seja, o mais plana possível). Na verdade, como observado por Routier et al.⁵, se o eixo de recuo não for perpendicular à s.......

Discussão

O surgimento de formas em plantas é determinado principalmente pela taxa coordenada e direção do crescimento durante o tempo e o espaço. Células vegetais são envoltos em uma parede celular rígida feita de uma matriz polissacarídico, que cola-los juntos. Em conseqüência, a expansão da pilha é controlada pelo equilíbrio entre a pressão do turgor que puxa na parede de pilha, e a rigidez da parede de pilha que resiste a esta pressão. A fim compreender os mecanismos que são subjacentes ao desenvolvimento, é importante poder m.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de crescimento
1.000x solução			de vimatina usada para fazer ACM, composição ver Stanislas et al., 2017. Adicione ao ACM após a autoclavagem, antes de despejar.
Ácido 1-N-naftilftalâmico (NPA)	Sigma-Aldrich / Merck	132-66-1	adicionar ao meio Arabidopsis, 10 μ M. Adicionar após a autoclavagem, antes de despejar.
Ágar-ágar	Sigma-Aldrich / Merck	9002-18-0	adicionar ao meio Arabidopsis, 1% p / v.
Agarose	Merck Millipore	9012-36-6	usado para fazer ACM sólido, 0,8% p / v.
Arabidopsis meio	Duchefa Biochimie	DU0742.0025	Para cultura in vitro de arabidopsis, 11,82g/L.
Nitrato de cálcio tetrahidratado	Sigma-Aldrich / Merck	13477-34-4	adicionar ao meio Arabidopsis, 2 mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM	Duchefa Biochimie	M0221.0025	Mistura de sal basal, usada para fazer ACM, 2,2 g/ L.
N6-benziladenina (BAP)	Sigma-Aldrich / Merck	1214-39-7	usado para fazer ACM, 555 nM. Adicione ao ACM após a autoclavagem, antes de despejar.
Oryzalin	Sigma-Aldrich/Merck	19044-88-3	para tratamento de orizalina, 10 μ g/mL.
Mistura de preservação de plantas (PPM)	Tecnologia		usada para fazer ACM, 0,1% v/v. Adicione ao ACM após a autoclavagem, antes de despejar.
Hidróxido de potássio	Duchefa Biochimie	1310-58-3	usado para fazer meio Arabidopsis e ACM, ambos pH 5,8.
Sacarose	Duchefa Biochimie	57-50-1	usada para fazer ACM, 1% p/v.
Tools para o catalizador BioAFM
BioScope	O AFM usado para a medida da pressão do turgor neste protocolo.
Nanowizard III + CellHesion	JPK (Bruker)		O AFM usado para medir propriedades mecânicas.
Patafix	UHU	D1620
Estrutura elasítica de referência	NanoIdea	2Z00026
Reprorubber-Thin Pour	Flexbar	16135	cola biocompatível.
Pontas esféricas do AFM	Nanoandmore	SD-SPHERE-NCH-S-10	Pontas usadas medindo propriedades mecânicas.

estoque de células vegetais Bruker de